用原生质体融合技术提高α-淀粉酶稳定性

工业生产上一般都采用物理和化学诱变的方法选育优良菌株,Foder和Schaeffer将种内细菌原生质体融合成功之后,用原生质融合方法育种的报道较多,所得融合子也逐渐应用于工业生产.本研究用产α-淀粉酶活力高的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)生产菌株和活力低、耐热性好的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)进行原生质融合,选育出耐热高产的α-淀粉酶产生菌.1 材料和方法1.1 菌种Bacillus amyloliquefaciens BF 7658,北京房山交道酶制剂厂生产菌株;Bacillus licheniformis ATCC9789,中国科学院微生物所保藏.     

通过同源介导α-淀粉酶基因扩增改良地衣芽孢杆菌α-淀粉酶生产菌株

地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶(BLA)是淀粉水解与生物加工过程中重要关键酶制剂之一.为了进一步提高地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶生产菌株的生产性能,本研究构建了一种含有地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶编码基因amyL的整合性重组质粒pBL-amyL.将重组质粒pBL-amyL转化入BLA工业生产菌株Bacillus licheniformis B0204,再在卡那霉素存在下介导其B.1icheniformis B0204染色体中的同源整合与高温α-淀粉酶编码基因amyL的扩增,由此获得了携带多个amyL拷贝的转化子.对转化子的amyL拷贝数及其BLA发酵水平分别用荧光实时定量PCR及摇瓶发酵试验进行评价与鉴定.与出发菌株B0204相比,含2～5倍amyL拷贝数的重组菌的BLA的合成水平显著提高.其中,重组菌REBL18生产BLA的水平提高了89.2%.     

提高芽孢杆菌蛋白质的产量

α-淀粉酶是淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)分泌的一种蛋白质,人们想从这种菌获得更大的α-淀粉酶,就把编码这类蛋白质的某个基因的多拷贝连接到芽孢杆菌PUB110质粒上。把这个携带基因多拷贝的质粒插入到某个芽孢杆菌中,主要是插入到枯草芽孢杆菌     

角蛋白酶生产菌株的分离筛选与鉴定

【目的】分离筛选具有高效脱毛能力的野生角蛋白酶生产菌株,开发无硫制革生物脱毛剂。【方法】以贮备原料皮的特定环境中的污水样品为菌株源、在含诱导物脱脂羊毛粉的培养基中的富集、筛选与评估其发酵液脱毛能力的多相筛选方法分离选育高产角蛋白酶野生菌株。通过形态学、生理生化特征,Biolog全自动分析以及16SrDNA基因序列分析等方法多尺度地鉴定目的菌株。【结果】定向筛选得到了一株高活力,无硫脱毛效率高的菌株。鉴定结果表明,该菌株为地衣芽孢杆菌属,故命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)X-47。【结论】应用多相定位选育技术筛选出的菌株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)X-47,产角蛋白酶活力高,脱毛效率高,对胶原作用力弱的特点,具有开发无硫脱毛生物助剂的潜力。     

枯草杆菌(Bacillus subtilis)稳定的基因表达系统

芽孢杆菌属(Bacillus)在应用微生物学方面有着悠久的应用历史,尤其是本世纪以来,该属在工业用酶生产中所起的作用愈来愈显重要。液化淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)曾占据α—淀粉酶工业生产的主导地位,而地衣芽孢杆菌(B.1icheniformis)则是当今世界工业用酶的主要来源之一。     

通过同源介导a-淀粉酶基因扩增改良地衣芽孢杆菌a-淀粉酶生产菌株

地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶(BLA)是淀粉水解与生物加工过程中重要关键酶制剂之一。为了进一步提高地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶生产菌株的生产性能,本研究构建了一种含有地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶编码基因amyL的整合性重组质粒pBL-amyL。将重组质粒pBL-amyL转化入BLA工业生产菌株BacilluslicheniformisB0204,再在卡那霉素存在下介导其B.licheniformisB0204染色体中的同源整合与高温α-淀粉酶编码基因amyL的扩增,由此获得了携带多个amyL拷贝的转化子。对转化子的amyL拷贝数及其BLA发酵水平分别用荧光实时定量PCR及摇瓶发酵试验进行评价与鉴定。与出发菌株B0204相比,含2～5倍amyL拷贝数的重组菌的BLA的合成水平显著提高。其中,重组菌REBL18生产BLA的水平提高了89.2%。     

枯草杆菌α-淀粉酶的生产

α-淀粉酶是在酒精、酿造、制药、制糖和纺织工业上应用广泛的酶种,也是目前国内外应用最广、产量最大的酶种之一。α-淀粉酶可由微生物发酵产生,也可由植物和动物提取。目前工业生产上都以微生物发酵法为主进行大规模生产α-淀粉酶。我国从1965年开始应用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BF-7658生产α-淀粉酶,当时仅无锡酶制     

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因的克隆、烟草瞬时表达及转化拟南芥的研究

从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中克隆到耐高温α-淀粉酶基因全长,构建了原核表达载体,转入大肠杆菌(Escherichia coli)中,使用IPTG于28℃诱导6小时后,通过SDS-PAGE检测到目的蛋白,分子量约为55 kDa,并通过酶活力检测实验证明该蛋白具有耐高温α-淀粉酶活性。同时构建了该基因融合GFP的植物表达载体,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导瞬时转化烟草(Nicotiana tabacun)下表皮细胞并在荧光显微镜下观察,发现在烟草下表皮细胞的细胞质和液泡中均有绿色荧光。使用I_2-KI溶液对乙醇脱色后的烟草叶片进行染色,显色反应表明在烟草中表达的耐高温α-淀粉酶具有酶活性。最后,采用农杆菌介导的花蕾浸泡法将重组载体转化到拟南芥(Arabidopsis thaliana)中,筛选到稳定遗传的耐高温α-淀粉酶基因的拟南芥纯合子。研究结果为后期开展表达耐高温α-淀粉酶的转基因植物的相关研究奠定了实验基础。     

重离子诱变枯草芽孢杆菌高产复合酶菌种的筛选

重离子诱变作为一种新型高效的辐照诱变方式,具有突变率高、突变谱广、突变体稳定等特点。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)因具有多种水解酶活力而广泛应用于工业生产,虽然经过多次诱变和改造,其酶活力不断提高,但其复合酶活力仍有提升空间。同时,多次同种诱变剂的使用容易导致菌种产生"抗性",酶活力提高不大。为此,本研究首次利用不同剂量¹²C⁶⁺重离子束对枯草芽孢杆菌20076进行辐照诱变。诱变后通过透明圈初筛和酶活力验证复筛方式选育出一株复合酶活力较高的菌株B. subtilis KC-1。与原始菌株相比,其发酵液滤纸酶活力、内切葡聚糖酶活力、β-葡萄糖苷酶活力、外切葡聚糖酶活力、蛋白酶活力和α-淀粉酶活力分别提高了20. 2%、79. 6%、98. 2%、7. 4%、10. 4%和27. 4%。11代遗传稳定性实验结果表明该突变株具有良好的稳定性。     

枯草杆菌(Bacillus subtilis)蛋白酶突变株蛋白酶和α-淀粉酶合成的关系

用同步辐射、离子注入和紫外辐射对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)183l菌株辐射诱变后,筛选到四个稳定的蛋白酶突变株。研究了B．subtilis 183l亲株及其蛋白酶突变株的蛋白海和α-淀粉酶合成情况,分析了蛋白酶和α-淀粉酶的合成关系。结果表明,B． subtilis 183l亲株及其突变株在以豆饼粉、玉米粉、麸皮等组成的发酵培养基中,37℃,120r／min培养条件下,各菌株最高α-淀粉酶活力相差不大;中性蛋白酶与α-淀粉酶的合成可能具有相互促进的作用。     

一株嗜热地衣芽孢杆菌及其产高温淀粉酶的初步研究

从云南腾冲热海热泉中分离到23株产高温淀粉酶的菌株,选取酶活最高的一株菌株进行生长特征、16S rRNA基因测序及系统进化分析表明,该菌株为嗜热的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),并命名为B.1icheniformis Tamy6。该菌株生长范围为37～70℃,最适生长温度为55℃。对该菌所产高温淀粉酶的性质研究表明:该酶在70℃具有最高催化效率,在98℃保温30min,仍有45%的活力,其最适反应pH为5.0。通过Native-PAGE酶谱分析表明菌株Tamy6的粗酶液中含有一种类型的淀粉酶。通过TLC分析水解淀粉产物表明,其产物主要为葡萄糖、麦芽糖及3～5个葡萄糖基的寡糖,说明菌株Tamy6所产淀粉酶为高温α-淀粉酶。     

产α-淀粉酶菌株的分离、鉴定及酶学性质研究

目的:筛选高产α-淀粉酶菌株,为工业生产α-淀粉酶提供储备菌株。方法:利用碘液显色法和摇瓶发酵法,从土壤中筛选产α-淀粉酶菌株;通过菌落形态、菌体特征观察和16S rDNA序列比对对菌种进行鉴定;发酵粗酶液经硫酸铵沉淀、透析脱盐后,对其酶学性质进行初步研究。结果:从土壤中筛选到一株高产α-淀粉酶菌株,枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XL-15。该菌株所产α-淀粉酶的最适反应温度为50℃,最适作用pH为6.5;Ca2 和Mn2 对酶有激活作用,而Cu2 、Zn2 和EDTA对酶有抑制作用;酶的动力学研究测出米氏常数Km值为1.726mg/mL。结论:该菌株是产α-淀粉酶的较好材料,且具有一定的应用前景。     

芽胞杆菌属产α-淀粉酶的研究进展

α-淀粉酶是一种重要的淀粉水解酶,可以从动物、植物或微生物中获得。但应用于工业生产的α-淀粉酶绝大多数来自芽胞杆菌。自α-淀粉酶工业化生产以来,研究人员针对其生产菌株芽胞杆菌进行了一系列的诱变选育和基因工程等分子生物学育种,使得菌种的产酶能力不断得到提高。另外,优化芽胞杆菌发酵培养基及发酵参数也是提高α-淀粉酶工业化生产产量的重要方法。     

BF7658α-淀粉酶稳定性的研究

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BF 7658即能产生丰富的α-淀粉酶,又能产生丰富的蛋白酶。在0.2mol/L pH7.2磷酸缓冲液中,不加任何底物,样品中α-淀粉酶与蛋白酶的比例是13:1,21:1,27:1,37℃保温24小时,α-淀粉酶活力损失22.1—8.8%,即α-淀粉酶的稳定性随蛋白酶的增加而减少,因而认为蛋白酶是影响α-淀粉酶稳定性的重要因素。Α-淀粉酶的稳定性可以通过选育菌种,选择合适的培养条件,添加钙离子保护及热处理等方法予以提高。     

透明颤菌血红蛋白在产聚γ-谷氨酸地衣芽胞杆菌WX-02中的表达

聚γ-谷氨酸(γ-PGA)是一种应用前景良好的生物高分子材料.通过构建含有α-淀粉酶(amyE)基因两端交换臂的整合载体pDG1730-vgb,将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)整合到聚γ-谷氨酸生产菌株地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02染色体中,获得重组子M2.一氧化碳差光光谱结果验证M2中表达了有活性的血红蛋白,3 L发酵罐分批发酵结果显示M2的生物量比出发菌株WX-02提高了25.5%,γ-PGA产量提高了20%.     

产耐酸性α-淀粉酶菌株的分离、鉴定、酶学特性研究及发酵培养基的优化

从富含淀粉的土壤中筛选获得多株产耐酸性α-淀粉酶的菌株,将酶活最高的一株经16S rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),命名为Bacillus subtilis A-7,其所产的耐酸性α-淀粉酶最适温度和pH分别为60℃和4.5。通过单因素筛选及正交试验优化发酵培养基,得到最佳配方为可溶性淀粉2%,蛋白胨2%,CaCl20.07%,Na2HPO40.8%,在此条件下耐酸性α-淀粉酶活力达到221 U/mL,是未优化条件下的2.3倍。     

不同信号肽及其组合对果聚糖蔗糖酶异源表达的影响

为了实现果聚糖蔗糖酶在解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens 018(简称G3)中的高效表达,选择来源于不同芽孢杆菌的4个果聚糖蔗糖酶基因lsLich、lsAmy、lsSub和lsMega进行异源表达,并将课题组前期确定的对碱性蛋白酶酶活提升较高的5种信号肽进行筛选和组合。其中来源于地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis RN-01的lsLich在重组菌株G3/pLY-2-lsLich中的酶活力最高,酶活力为62.73 U/mL。以LS-Lich作为目的蛋白筛选单信号肽和双信号肽,其中信号肽SP_DacB和SP_AmyE组合的重组菌株G3/pLY-2-SDA-ls酶活最高,胞外酶活达到125.76 U/mL,较重组菌G3/pLY-2-SD-ls和G3/pLY-2-SA-ls分别提高了31.3%和39.2%,较原始菌株提高了100.49%。该结果表明双信号肽较单信号肽有助于提高LS-Lich的分泌量,同时信号肽组合顺序不同也产生一定的差异。     

汤姆青霉PT95和Q1菌株产酶活力及抗菌活性研究

为探讨汤姆青霉菌株产酶活力以及抑菌性能。实验采用Folin酚法、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)糖化力法、二硝基水杨酸(DNS)比色法和对硝基苯酚法进行蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和脂肪酶活力测定;同时采用牛津杯法测定发酵滤液对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)的抑制作用,并测定最小抑菌浓度(MIC)。结果表明PT95菌株产蛋白酶活力为230.473 U、纤维素酶活力为3.463 U,产淀粉酶活力为1.679 MMU、脂肪酶活力10.793 U;Q1菌株产蛋白酶活力为167.247 U、纤维素酶活力为2.147 U,产淀粉酶活力为1.402 MMU、脂肪酶活力为6.350 U;PT95菌株对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌抑菌率分别可以达到53.73%和19.47%,Q1菌株对三种待测菌都有抑菌作用,抑菌率分别是56.37%(枯草芽孢杆菌)、26.87%(金黄色葡萄球菌)和19.47%(大肠杆菌),两株菌株发酵液中均存在抑菌物质,且均对枯草芽孢杆菌的抑菌率最高,两株菌的发酵液对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为0.64和0.32 mg/mL。     

利用淀粉直接发酵生产肌苷菌株的构建

以肌苷生产菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TF_2为受体菌,利用质粒DNA的原生质体转化法,将携带糖化型α-淀粉酶基因的重组质粒pBX96导入肌苷产生菌TF_2中,转化频率为5.7×10^(-6),获得一株能以淀粉为碳源生产肌苷的转化子T140(pBX96),该工程菌株能在以淀粉为碳源的培养基上平均积累肌苷4.64g/L,经过92代,质粒自发丢失率为0.78％。培养48h后,工程菌株的糖化型α—淀粉酶活力为受体菌的7.79倍。并对工程菌株TI40(pBX96)的发酵条件做了初步摸索。     

地衣芽孢杆菌原生质体电转化方法的研究

为了解决地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)工业菌株难以转化的问题,将原生质体制备、电穿孔和原生质体再生技术相结合,建立了一种地衣芽孢杆菌原生质体电击转化方法。在对菌体生长状态、溶菌酶作用时间、电转电压、渗透压保护剂等条件进行优化后,试验了将不同类型的表达载体,即游离型质粒p GJ103(3.3kb)和整合型质粒p AX01(9.3kb),分别转入两株地衣芽孢杆菌工业生产菌株B.licheniformis CICC 10181和B.licheniformis CICC 20204中。实验结果显示,对数生长期后期的菌体酶解40min后制备的地衣芽孢杆菌原生质体得率为96%,再生率达25%以上。原生质体与质粒DNA在最适电压0.6k V/mm下电击转化,并以0.5mol/L山梨醇或甘露醇作为渗透压保护剂进行再生培养后,最终游离型质粒的转化率可达0.88×102~1.1×102CFU/μg p GJ103,整合型质粒的转化率达到0.45×102~0.52×102CFU/μg p AX01。该方法为地衣芽孢杆菌野生工业菌株的遗传改造提供了一种新的、高效的转化手段。