尼古丁影响小鼠胚胎发育的分子机制初探

目的:探讨不同剂量的尼古丁对小鼠胚胎组织器官发育的影响及其分子机制。方法:以妊娠期雌鼠为评价模型,通过皮下注射不同浓度的尼古丁,在E18.5时解剖获取胚胎并称重,同时采集各组织器官,应用HE染色观察相关组织的病理学变化,并采用qRT-PCR检测相关基因表达水平的变化。结果:与对照组相比,尼古丁对小鼠E18.5胚胎的脑、肺、肝脏、肾脏有明显损伤;qRT-PCR分析显示血管形成相关基因(VEGF-α)、神经生长相关基因(Egr-1)及细胞生长分化相关调控基因(c-FOS)有显著的表达差异,其中VEGF-α在心脏和肾脏中表达下调,Egr-1在肺和肾脏中表达上调,c-FOS在脑、心脏和肺中表达上调。结论:妊娠期母鼠注射尼古丁会对小鼠胚胎的脑、肺、肝脏、肾脏产生明显损伤,并导致VEGF-a、Egr-1及c-FOS基因表达异常。     

Egr-1的特异性脱氧核酶对大鼠颈总动脉损伤后内膜增生的影响

目的 探讨早期生长反应因子-1(Egr-1)的特异性脱氧核酶对大鼠颈总动脉损伤后新生内膜形成的影响。方法 对Wistar大鼠行颈总动脉损伤后,在转染试剂Fugene6介导下经血管腔内转染Egr-1的特异性脱氧核酶(ED5),以假手术组、单纯损伤组及空白转染试剂组(Fu gene 6组)作为对照,于术后3、7、14和21d4个时间点取材,检测内膜增生程度及增殖细胞核抗原(PCNA)、转化生长因子-β(TGF-β)和Egr-1的表达变化。结果单纯损伤组及Fugene6组7d时可见内膜增生,14d、21d时内膜增厚更明显,PCNA及TGF-β于损伤后3天明显表达,7d时在新生内膜及中膜中表达达到高峰,14d后逐渐下降,而Egr-1呈持续高表达。经ED6作用后,内膜增生减轻,动脉中PCNA、TGF-β及Egr-1表达明显降低,与单纯损伤组和Fu Gnene 6组比较差异有显性。结论结果提示ED5可能是通过特异性抑制其相应基因的表达来阻遏动脉损伤后的内膜增生。     

FOXQ1在肝癌中的临床意义及其对SMMC-7721细胞体外血管形成的影响

探讨叉头框蛋白Q1(forkhead box Q1, FOXQ1)基因在肝癌中的临床意义及对肝癌细胞体外血管生成作用.利用 qRT-PCR法及Western印迹法,检测24例肝癌、癌旁组织、正常肝细胞L02及肝癌细胞SMMC-7721中FOXQ1的mRNA和蛋白质的表达;利用免疫组织化学法检测68例肝癌及癌旁组织中FOXQ1的蛋白质表达.合成shRNA-FOXQ1及shRNA-NC慢病毒,转染到SMMC-7721细胞.用体外血管生成实验检测转染shRNA-FOXQ1的肝癌细胞血管生成能力. 用qRT-PCR和Western印迹法检测细胞间FOXQ1、VEGF基因和蛋白质的表达.结果显示,癌组织和SMMC-7721细胞中FOXQ1 mRNA和蛋白质的表达均高于癌旁组织和正常肝细胞(P<0.05),FOXQ1蛋白的表达与TNM分期、肿瘤分化程度、肿瘤数目、肿瘤大小等参数差异显著(P<0.05).shRNA-FOXQ1组血管生成能力明显低于shRNA-NC组和空白组(P<0.05),FOXQ1、VEGF基因和蛋白质的表达也明显低于shRNA-NC组和空白组(P<0.05).研究结果证实,FOXQ1在肝癌中高表达,如果沉默FOXQ1的表达可抑制肝癌细胞血管生成,与肝癌的临床病理特征密切相关.     

TAp73调节肺腺癌细胞的血管生成能力依赖P53状态

TAp73是P53家族的一员,能够调节肿瘤的生成、侵袭和转移。但是,TAp73调节肿瘤血管生成的作用备受争议。本研究将外源TAp73转染至P53基因表达状态不同的两株肺腺癌细胞系H1299(P53-null)和A549(wt P53)中,观察TAp73对肿瘤血管生成的作用并探讨与P53基因的关系。首先,使用RT-PCR和Western印迹验证转染效率。细胞划痕实验表明,TAp73在A549细胞中促进细胞迁移,而在H1299细胞中抑制细胞迁移。体外HUVEC血管形成结果表明,TAp73在A549细胞中促进细胞血管形成,而在H1299细胞中抑制细胞血管形成。同时,血管生成抑制蛋白1（VASH1）的表达水平,也分别升高或降低。 本文研究结果表明,TAp73对肺腺癌细胞血管生成的作用依赖于P53基因的状态：在野生型P53基因存在时,TAp73促进血管生成,而在缺失P53基因的情况下,TAp73抑制血管生成。本研究对于TAp73作为肿瘤的潜在治疗靶点具有重要意义。     

Egr-1基因沉默对A549细胞放射敏感性的影响

目的:探讨Egr-1基因沉默对人肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响。方法:选用A549细胞株作为研究对象,将其分成A、B、C三组,即空白对照组(只加入RPMI-1640培养)、阴性对照组(加入LV3-NC-sh RNA)、实验组(加入EGR1-homo-2294-sh RNA),采用慢病毒介导的sh RNA干扰技术使实验组细胞Egr-1基因沉默表达。利用荧光显微镜、自动化荧光定量细胞成像分析系统分析sh RNA转染,利用FQ-PCR分析Egr-1表达,再利用细胞克隆形成实验检测细胞放射敏感性参数的差异。结果:慢病毒介导的sh RNA成功转染阴性对照组、实验组细胞;空白对照组与阴性对照组Egr-1表达无差异(P0.05),实验组与空白对照组、阴性对照组比较Egr-1均受到明显抑制(P0.05);克隆形成实验中细胞放射敏感性参数D0、SF2实验组细胞与空白对照组、阴性对照组比较均存在明显差异(P0.05)。结论:Egr-1基因沉默使A549细胞放射敏感性降低,Egr-1表达可能与肿瘤细胞对放射的敏感性有关。     

Egr-1在小鼠和人组织中的表达及其与细胞增殖的关系

目的：探讨早期生长反应基因－1（Egr-1）在小鼠和人体组织和细胞中的表达及其与细胞增殖的联系,方法：应用原位杂交和免疫组织化学法对小鼠和人的不同组织进行Egr-1检测。结果：Egr-1mRNA和Egr-1蛋白阳性信号呈棕褐色。位于细胞浆和细胞核,生长活跃和增生的细胞可见相对的Egr-1表达。结论：Egr-1mRNA和Egr-1蛋白的高表达主要在生长活跃和增生的细胞,与细胞增殖有密切的关系。     

Egr-1的诱骗性寡脱氧核苷酸抑制大鼠颈总动脉损伤后MMP-2的表达

目的观察局部转染早期生长反应因子-1(early growth response factor-1,Egr-1)的特异诱骗寡脱氧核苷酸(decoy oligodeoxynucleotides,decoy ODNs)对球囊损伤颈总动脉后基质金属蛋白酶-2(MMP-2)蛋白表达的影响及内膜增生的情况,初步探讨Egr-1,decoy ODNs抑制球囊损伤后内膜增生的机制。方法 96只健康雄性Wistar大鼠,随机分为4组,分别为假手术组、对照组、杂码组和诱骗组,每组24只。除假手术组外均应用2F球囊导管行颈总动脉球囊损伤术,术中采用转染试剂FuGENE6介导的Egr-1decoy ODNs转染至损伤后大鼠血管中,与假手术组、对照组、杂码组相比较。术后3、7、14、21d每组处死6只动物。应用HE染色和免疫组织化学方法观察大鼠颈总动脉球囊损伤后内膜增生情况和MMP-2蛋白的表达及转染Egr-1decoy ODNs后对它们的影响。结果 (1)、内膜损伤后3d内膜增厚不明显,7d内膜开始增厚,14、21d时内膜明显增厚。(2)、在假手术组近腔面中膜可见MMP-2有少量散在阳性表达;在对照组及杂码组动脉损伤后3d,在近腔面中膜,有少量阳性表达,与假手术组相比,阳性表达指数上升。7d时在新生内膜和靠近新生内膜处中膜表达明显,14d后表达逐渐下降。(3)转染decoy ODNs治疗后,在各个时间点内膜增厚程度减轻,MMP-2蛋白表达减少,与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。结论血管球囊损伤后,内膜7d开始增生,14d、21d增生更明显,而MMP-2在7d时表达明显,之后逐渐下降,Egr-1decoy ODNs能抑制MMP-2的表达,从而减轻血管损伤后内膜的增生。     

Egr-1基因及其相关癌基因蛋白在放疗后食管鳞癌的表达

目的研究早期生长反应基因1（Egr-1基因）在放疗后切除人食管癌组织的表达及其与癌基因蛋白C－fos、C—Jun和Egr-1靶基因蛋白P53、Rb和Bax表达的关系。方法应用原位杂交和免疫组化法分别检测80例非放疗和放疗后外科切除食管鳞状细胞癌Egr－1mRNA、Egr-1、Cfos、C-Jun、P53、Rb和Bax蛋白的表达。结果Egr-1mRNA和Bax蛋白阳性定位于细胞质;而Egr-1、Fos、Jun、P53和Rb蛋白阳性定位于细胞核。40例非放疗和40例放疗后的食管癌切除肿瘤标本均存在Egr-1表达,其中40例例放疗病人外科切除标本Egr-1阳性表达9例（22．5％）,40例放疗后病人Egr-1阳性表达23例（57．5％）。Egr-1基因表达与Fos、Jun癌基因蛋白的表达无关。食管癌放疗后癌组织Egr-1超表达病人预后较好。结论放疗反应上调食管癌Egr-1表达。Egr-1超表达可作为食管鳞癌放疗反应的基因标志,并对食管鳞状细胞癌的预后判断有重要作用。     

Ad-Ang1-IRES-VEGF165腺病毒载体的构建及其促血管形成作用

目的:构建人血管生成素1(Ang1)和血管内皮生长因子VEGF165 (VEGF165)的共表达腺病毒载体Ad-Ang1-IRES-VEGF165(简称Ad-AV),为研究Ad-AV转基因细胞表达产物血管诱生活性提供实验依据。方法:采用IRES介导的Ang1和VEGF165双基因腺病毒共表达模式,通过常规的基因克隆和重组技术,构建Ad-AV双基因共表达腺病毒载体,经感染人胚肾QBI-293A细胞(293A)进行扩增和效价测定后,再感染WI-38人胚肺成纤维细胞,均用ELISA法检测VEGF、Ang1目的基因的表达,并采用鸡胚尿囊膜血管形成实验(CAM)法分析其对血管形成的影响。结果: 扩增的Ad-AV腺病毒效价可达4×10¹⁰pfu/ml;Ad-AV不仅能在293A细胞中成功表达目的基因Ang1、VEGF,而且在WI-38成纤维细胞也能成功表达,其表达产物具有显著的促进CAM上血管生成的活性。结论:成功构建并获得了Ad-Ang1-IRES-VEGF165重组病毒子, 目的基因均能在人胚肾和人胚肺成纤维细胞中表达,其表达产物具有诱导血管形成的功能。     

Egr-1对APP基因表达的调控作用

该研究构建了含有APP启动子的荧光素酶报告质粒以及缺失突变的报告质粒,将该质粒与Egr-1真核表达载体p CDNA3-Egr-1共转染到HEK293与U87MG细胞中进行荧光素酶活性测定,以确定Egr-1对APP基因表达的调控作用。通过染色质免疫共沉淀实验(chromatin immunoprecipitation assay,Ch IP)和凝胶电泳迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)确定Egr-1蛋白在APP启动子上的结合部位,同时利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA(trichostatin A)和butyrate诱导内源性Egr-1的表达以及Egr-1抑制剂suramin来作用于细胞,通过蛋白免疫印迹分析(Western blot)检测Egr-1对APP蛋白表达的作用。结果显示,Egr-1蛋白在APP基因启动子上5′UTR区域有特异性的结合部位,去除该结合部位则Egr-1失去对APP基因启动子的调控作用,Ch IP和EMSA的结果也证实了该结合位点;通过HDAC抑制剂和suramin干扰内源性Egr-1的表达则显著影响了Egr-1对APP基因表达的调控作用。