贵州华枝(虫脩)属一新种(竹节虫目:长角枝(虫脩)亚科)

华枝(虫脩)属 Sinophasma Günther(1940)隶属于竹节虫目,长角枝(虫脩)亚科(Necrosciinae)。本属昆虫一般生活于森林中,大部分为害壳斗科植物,至目前为止全世界共记载有5种,均分布于我国,它们是:异尾华枝(虫脩)S.mirabile Gnther,克氏华枝(虫脩)S.Klapperichi Günther,瓦腹华枝(虫脩)S.hnei Günther,垂臀华枝(虫脩)S.brevipenne Günther,和斑腿华枝(虫脩)S.maculicruralis Chen。1987年笔者从贵州省森林昆虫考察     

半滑舌鳎AKT-ineracting protein基因的克隆及免疫应答表达分析

研究克隆了半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis膜蛋白AKT-interacting protein (AKTIP)基因, 研究了其在健康组织中的表达模式、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后免疫组织和不同病原物刺激外周血淋巴细胞中的表达特征。通过常规克隆和RACE技术, 获得的半滑舌鳎AKTIP基因全长cDNA序列为1224 bp, 其中包括5'-UTR为116 bp, 3'-UTR为117 bp和完整的ORF序列891 bp, 编码296个氨基酸, 预测蛋白质的等电点(PI)为9.12,分子量是33.74 kD; 同源比对发现半滑舌鳎AKTIP的氨基酸序列在不同物种之间具有较高的保守性; 荧光实时定量PCR (qRT-PCR)检测到半滑舌鳎各个组织中均有AKTIP基因的表达, 在卵巢中表达量最高; 鳗弧菌感染半滑舌鳎后, AKTIP基因在肝、鳃、血液、肠、头肾和脾中均上调表达; 病原模拟物PGN、LPS、poly I:C和WGP刺激半滑舌鳎外周血淋巴细胞均诱导AKTIP基因下调表达。研究表明半滑舌鳎AKTIP基因参与了机体免疫反应为给半滑舌鳎免疫防御技术的研究提供理论依据。     

渤海南部半滑舌鳎的食性及摄食的季节性变化

本文研究了渤海南部半滑鳎的食性及其摄食的季节性变化,胃食物分析结果表明,半滑舌鳎为底栖生物食性鱼类,以虾类,蟹类,双壳类及部分中下层小型鱼类为主要食物,兼食一些多毛类,头足类,腹足类,棘皮动物及海葵,半滑舌鳎终年摄食,其摄食强度的周年变化不大,半滑舌鳎常年捕食鲜明鼓虾,日本鼓虾,口虾蛄,隆线强蟹及泥古隆背蟹等。夏季加强捕食小刀蛏,凸壳肌蛤等双壳类,降春季外还捕食一些以虾虎鱼为主的中下层小型鱼类。     

半滑舌鳎侧线器官和无眼侧皮肤表面的特殊结构

为了解决半滑舌鳎的摄食难题,探讨其摄食机理,本文采用光镜和扫描电镜手段对半滑舌鳎有眼侧侧线管和无眼侧皮肤表面的特殊结构进行了研究。结果表明(1)有眼侧:半滑舌鳎侧线孔圆形,孔径与所在部位侧线管径相同,孔上并连有一胶质管,这种特殊结构既可以提高管道内感觉器官(管道神经丘)的敏感性,又可阻止外界异物进入侧线管内部,具有保护作用;半滑舌鳎口腔附近的侧线管管径及侧线孔孔径较其它部位大,侧线孔密度高,认为口腔附近侧线管道内的感觉器官(管道神经丘)的敏感性较其它部位高,在鱼类捕食行为中具有重要作用;(2)无眼侧:躯干部表面覆盖圆鳞,头部皮肤无鳞,表面被覆相互连结的黏液管,形成黏液管皮肤;极其发达的黏液管构成管状黏液分泌系统。扫描电镜观察发现,在头部黏液管皮肤表面镶嵌着一种乳头状突起(Pailla),其典型特征是在表面被覆一盾牌状结构,一般多个簇生在一起,很少单独存在,其分布密度是从吻端向内逐渐减少,组织切片显示内部结构周边是套细胞,中央是感觉细胞,具一柄或两柄。根据其外部形态和内部结构,作者推测,这可能是半滑舌鳎特有的一种触觉器官,并在其摄食行为中起重要作用。半滑舌鳎极其发达的黏液分泌系统对于裸露的乳头状突起(Pailla)具有相当重要的保护作用。     

谷氨酰胺对半滑舌鳎稚鱼非特异性免疫相关酶活力和低氧应激后HIF-1表达的影响

为探讨饲料中谷氨酰胺对半滑舌鳎稚鱼非特异性免疫以及低氧应激后HIF-1表达的影响, 实验共设计了4种谷氨酰胺添加量分别为0、0.5%、1.0%和2.0%的等氮等脂微颗粒饲料(游离谷氨酰胺测定值分别为0.03%、0.46%、0.91% 和1.73%), 饲喂35日龄半滑舌鳎稚鱼[平均干重(10.640.86) mg]。每天饱食投喂5次,养殖周期30d, 养殖结束后进行低氧应激实验。研究结果表明, 谷氨酰胺添加量为0.5%时半滑舌鳎稚鱼鱼体溶菌酶(LZM)活力显著高于未添加组(P0.05)。饲料中不同谷氨酰胺水平对鱼体总一氧化氮合酶(TNOS)活力和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活力没有显著影响(P0.05)。实验克隆了半滑舌鳎低氧应激关键基因缺氧诱导因子1 (HIF-1), 得到749 bp半滑舌鳎HIF-1核心序列, 系统进化树分析表明半滑舌鳎HIF-1氨基酸序列与大部分鱼类具有较高同源性。定量PCR结果显示, 饲料中谷氨酰胺水平对低氧应激后半滑舌鳎稚鱼内脏团HIF-1表达量未产生显著影响(P0.05)。综上所述, 在饲料中添加谷氨酰胺能够显著增强半滑舌鳎稚鱼鱼体溶菌酶活力(P0.05), 提高非特异性免疫水平。     

半滑舌鳎病原菌轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)的分离与鉴定

从患有严重皮肤溃疡病的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevisGünther)病灶处分离出4株优势菌,经人工感染证实其中一株菌株BV1为养殖半滑舌鳎皮肤溃疡病的病原菌。通过Biolog系统、细菌常规形态特征和生理生化反应指标测定以及16S rRNA和gyrB序列分析对菌株BV1进行了综合鉴定,结果表明该致病菌为轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus),其半致死量LD50为6.7×103CFU/mL。进一步的药敏试验表明其对链霉素、四环素等敏感,而对其他用于试验的抗生素敏感度低或具有一定的抗性。     

舌鳎亚科鱼类单系起源和同种异名的线粒体DNA证据

舌鳎亚科鱼类因形态特征的特殊性, 其分类及系统发育关系一直存在争议。本研究测定了中国沿海14种舌鳎亚科鱼类线粒体DNA的16S rRNA和Cyt b基因的部分片段。两个基因构建的舌鳎亚科系统发育树结果显示, 中国沿海舌鳎亚科鱼类为明显的单系群, 但舌鳎亚科鱼类内部的系统发育关系与形态分类划分的亚属并不完全一致, 日本须鳎(Paraplagusis japonica)与其他舌鳎属(Cynoglossus)种类并未形成不同的分支。虽然舌鳎属内的舌鳎亚属(Cynoglossus)、拟舌鳎亚属(Cynoglossoides)和三线舌鳎亚属(Areliscus)均可以聚为独立分支, 但长吻红舌鳎(C. lighti)与短吻红舌鳎(C. joyneri)、短吻三线舌鳎(C. abbreviatus)与紫斑舌鳎(C. purpureomaculatus)、半滑舌鳎(C. semilaevis)与窄体舌鳎(C. gracilis)及褐斑三线舌鳎(C. trigrammus)这三组物种可能存在同种异名现象。这一结果提示, 基于形态学对舌鳎亚科的种属分类鉴定尚存在不足, 线粒体DNA的系统发育关系可为其分类的修订提供有意义的参考和佐证。     

半滑舌鳎仔、稚鱼视网膜结构与视觉特性

对1-50d半滑舌鳎仔、稚鱼视网膜和全长50mm的半滑舌鳎幼鱼视网膜结构和视觉特性进行了研究。结果表明:(1)3d仔鱼色素层形成,15d仔鱼没有显著的视网膜运动反应,25d时具有正常感受自然光的明视功能,43d半滑舌鳎稚鱼适应自然光的功能丧失;(2)半滑舌鳎仔鱼阶段感受细胞主要为高密度的单锥,视杆细胞和双锥细胞出现的较晚;单锥融合成双锥时,由于半滑舌鳎视锥细胞椭圆体细长,融合程度较差,尽管在视网膜横切面上能够看到双锥,但在切向切面上仍呈现单锥排列方式;随其生长发育,视锥和神经节细胞密度降低,视杆细胞密度增加,31d后视杆细胞数量显著增加;同时,外核层细胞核与神经节细胞的比值增大,网络会聚程度提高;相关数据表明,20-31d是视网膜结构和视觉特性发生明显变化的过渡时期,这是与半滑舌鳎从浮游生活到底栖生活生态环境的变化相适应的;(3)半滑舌鳎内核层结构特殊,50mm时只有1层水平细胞,属感光系统不发达类型,双极细胞和无长突细胞共4-5层,但不可分辨;内核层细胞层数的减少,基本上没有分化的水平细胞、双极细胞和无长突细胞,说明半滑舌鳎视网膜的光敏感性不高;(4)半滑舌鳎仔鱼浮游生活阶段视敏度较高,视觉在捕食行为中具有重要意义;底栖生活后,视敏度和光敏感性都较差,视觉在捕食行为中不可能具有重要作用     

半滑舌鳎性逆转的遗传特性研究

半滑舌鳎雌雄个体生长差异悬殊,由于性逆转而造成的其群体中雌性比例过低大大制约了养殖效率。性逆转是鱼类及两栖类生物性别决定事件中有趣的生物学问题,其发生的遗传机制鲜有研究。在该研究中,分别利用雄鱼和伪雄鱼组建10个半同胞家系,对这10个半同胞家系中的子代雌雄比进行研究,结果发现,2个伪雄鱼的家系,其后代个体中遗传雌性鱼全部逆转为生理雄鱼;在另外8个雄鱼家系中其性逆转比呈连续分布,表现为典型的数量性状特征;半滑舌鳎性逆转的遗传力较低,仅为0.058。以上结果表明,伪雄鱼作为父本的遗传可能为完全的父本效应遗传,性逆转由于其较低的遗传力不适合于做家系选育而适合于做家系内的选育或结合分子标记的遗传评估,以提高雌性比的遗传进展,半滑舌鳎逆转比的数量遗传特征说明其性别决定是多基因作用的结果。     

半滑舌鳎脑芳香化酶基因cDNA克隆及表达分析

为研究脑型芳香化酶(P450aromB)在半滑舌鳎性别分化中的作用,采用同源克隆策略,从半滑舌鳎脑分离了2184bp长的脑型芳香化酶的全长cDNA,该基因编码498个氨基酸。氨基酸序列和系统发育分析表明,P450aromB属于脑型P450arom,P450aromB的氨基酸序列与其他鱼类脑型P450arom的同源性较高(48.3%-66.1%),与性腺型P450arom的同源性较低(34.2%-49.9%),与自身的性腺型芳香化酶同源性为45.1%。RT-PCR分析表明:P450aromB mRNA的表达具有明显组织特异性,P450aromB只在性腺、脑、鳃和皮肤中表达,且脑中表达量远高于性腺,而在雌雄鱼的其他组织中都不表达。经过甲基睾酮浸浴处理和高温诱导半滑舌鳎由雌性性反转为雄性后,脑中P450aromB的表达量降低,这些结果表明P450aromB参与了半滑舌鳎的性腺分化和性别决定过程。     

半滑舌鳎雌性特异AFLP标记CseF783的克隆及其在遗传性别鉴定中的应用

半滑舌鳎性别控制和全雌育种等研究领域中迫切需要一种能够快速鉴定鱼类个体遗传性别的有效方法。文章采用AFLP技术, 利用选择性引物组合(E-ACT/M-CAA)从半滑舌鳎中筛选到一条雌性特异的AFLP标记。对该标记进行二次PCR扩增、琼脂糖凝胶回收、克隆、测序。分析表明, 序列全长为791 bp, 与GenBank中的序列无同源性。以该雌性特异AFLP标记DNA序列为模板, 设计了一对特异的PCR引物, 成功地将其转化为SCAR(Sequence characterized amplified regions)标记, 并在100尾已知性别的半滑舌鳎个体(雌雄各50尾)中进行验证, 结果表明, 该SCAR标记在所有雌性个体中均扩增得到一条长度为324 bp的DNA条带, 而在49尾雄性个体中均扩增不到该DNA条带(有1尾雄性个体例外), 证明该SCAR标记是雌性特异的, 并可用于半滑舌鳎个体遗传性别鉴定。随后, 利用该SCAR标记检测了3日龄半滑舌鳎幼苗, 结果表明, 雌性个体比例为41.7%。     

半滑舌鳎FTZ-F1cDNA克隆及表达分析

为研究性别相关基因FTZ-F1在半滑舌鳎鱼中的表达特征,采用同源克隆策略,从其精巢分离了3143bp长的半滑舌鳎FTZ-F1(hsFTZ-F1)的全长cDNA,该序列包含1458bp开放阅读框,66bp长的5'末端非编码区(UTR),1619bp长的3'末端UTR。mRNA的组织分布、氨基酸序列和系统发生分析表明:hsFTZ-F1属于SF-1/Ad4BP类群。RT-PCR分析表明:hsFTZ-F1mRNA的分布广泛,几乎在所有组织都有表达,但在性腺、肾脏、脑和头肾组织中表达最强,其他组织表达较弱,雌鱼脑和头肾中的表达量明显高于雄性。胚胎发育过程中表达量都高于孵化后仔鱼的表达量,表明hsFTZ-F1可能参与了半滑舌鳎的器官形成过程。     

饲料中添加水解鱼蛋白对半滑舌鳎稚鱼生长及生理生化指标的影响北大核心

试验研究了饲料中添加不同水平(0%、20%、40%和60%)的水解鱼蛋白(Fish potein hdrolysate,FPH)对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)稚鱼生长及生理生化指标的影响。28d饲养实验结束后,对试验鱼生长指标、鱼体消化酶活性、碱性磷酸酶(AKP)及肠道发育情况进行分析。结果显示:实验鱼的存活率为64.44%—78.88%,其中20%与40%添加组存活率显著高于其他两组(P<0.05);实验鱼的特定生长率(SGR)随饲料中FPH添加水平升高呈下降趋势,20%添加组特定生长率最高,显著高于其他3组(P<0.05),且60%添加组与对照组(FM)之间无显著差异(P>0.05);各试验组鱼体消化酶(脂肪酶、淀粉酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶)的比活力在14d与28d时的强弱关系不一致。鱼体碱性磷酸酶比活力大小依次为:20%组>40%组>对照组>60%组,各组间差异均显著(P<0.05);半滑舌鳎肠道微绒毛长度和黏膜厚度均以20%添加组为最优,显著优于其他3组(P<0.05)。以上结果表明,在实验条件下,饲料中FPH的添加水平为20%时,能提高半滑舌鳎稚鱼的存活率及生长性能,并增强其对营养物质的吸收能力。     

半滑舌鳎病原菌(发光杆菌杀鱼亚种)的分离与鉴定

2006年夏,山东青岛某渔场养殖半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Gunther)大量死亡。症状主要表现为体表溃烂,鳍基部出血等,解剖可见胆囊发黑,肾脏发黄。从患病半滑舌鳎胆囊分离出优势菌并命名为WY06。人工感染试验证实WY06对半滑舌鳎及模式动物斑马鱼都具有很强的致病性,其半数致死量分别为5.5×103cfu/克鱼(5.2×105cfu/条鱼)和1.9×103cfu/克鱼(8.9×102cfu/条鱼)。该病原菌革兰氏染色阴性,菌体呈杆状。综合该菌在形态、生理生化特征及16S rDNA同源性等方面的结果,确认WY06为美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.piscicida)。该菌对头孢呋肟、菌必治等抗生素敏感。美人鱼发光杆菌杀鱼亚种在美国、日本、欧洲的海水养殖中为常见的病原菌,但作为鱼类病原菌在中国属首次报道。     

半滑舌鳎血淋巴细胞体外培养及其染色体制备在性别鉴定中的应用

研究建立了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Gnther)外周血淋巴细胞体外培养及染色体制备方法,确定了最佳条件为:在24℃的环境中半滑舌鳎血淋巴细胞在添加20%胎牛血清的MEM培养基中,用终浓度为0.3 mg/mL的LPS为刺激源培养72h,在结束培养前3h加入终浓度0.08g/mL秋水仙素,可获得较多、较好的染色体分裂相。利用这种方法对半滑舌鳎遗传性别进行了鉴定,同时与生理解剖观察、性腺切片、性腺细胞培养、雌性特异标记等方法进行了比较,确定了适宜各阶段不同类型鱼的性别鉴定方法,丰富了半滑舌鳎活体遗传性别鉴定的方法。       

半滑舌鳎脑芳香化酶基因cDNA克隆及表达分析

为研究脑型芳香化酶（P450aromB）在半滑舌鳎性别分化中的作用,采用同源克隆策略,从半滑舌鳎脑分离了2184 bp长的脑型芳香化酶的全长cDNA,该基因编码498个氨基酸。氨基酸序列和系统发育分析表明,P450aromB属于脑型P450arom,P450aromB的氨基酸序列与其他鱼类脑型Ｐ450arom的同源性较高（48.3%—66.1%）,与性腺型Ｐ450arom的同源性较低(34.2%—49.9%),与自身的性腺型芳香化酶同源性为45.1％。RT-PCR分析表明：P450aromB mRNA的表达具有明显组织特异性,P450aromB只在性腺、脑、鳃和皮肤中表达,且脑中表达量远高于性腺,而在雌雄鱼的其他组织中都不表达。经过甲基睾酮浸浴处理和高温诱导半滑舌鳎由雌性性反转为雄性后,脑中P450aromB的表达量降低,这些结果表明P450aromB参与了半滑舌鳎的性腺分化和性别决定过程。     

短吻红舌鳎鱼卵、仔鱼的DNA条形码和形态学鉴定

为了准确鉴定2015年7–10月青岛崂山青山湾鱼类浮游生物调查中采集的依形态学初步鉴定为某种舌鳎属的鱼卵、仔鱼样本,本实验同时采集青岛胶州湾短吻红舌鳎(Cynoglossus joyneri)和长吻红舌鳎(C.lighti)的成鱼样本为参照,通过线粒体COI基因测序分析,以及同山东半岛海域分布的6种舌鳎属鱼类的COI基因序列比对,开展了该舌鳎属鱼卵、仔鱼种类的鉴别分析,以期为今后舌鳎属鱼类的分类及其鱼卵、仔鱼的鉴别提供参考资料。形态学研究结果显示:鱼卵为圆球形浮性卵,直径0.68–0.87 mm(0.73±0.03 mm,n=50),卵膜单层,较薄、光滑透明,卵周隙较大,卵膜及卵黄囊均无特殊构造,油球6–15个,直径0.04–0.10 mm(0.07±0.01 mm,n=50),圆形,大小不一,多位于卵黄囊中与胚体相对的一侧,既有聚集分布也有分散分布;仔鱼的2条冠状幼鳍及右眼移位过程中体长、色素分布等的特征和变化是此鱼种仔鱼鉴别的最明显特征。遗传学分析结果显示:该种舌鳎属样品(Cynoglossus sp.)与短吻红舌鳎和长吻红舌鳎的遗传距离最为接近,三者K2P遗传距离为0.006–0.009;短吻三线舌鳎(C.abbreviatus)与紫斑舌鳎(C.purpureomaculatus)亲缘关系最近,两者K2P遗传距离仅为0.002。以带纹条鳎(Zebrias zebra)为外类群构建的NJ系统发育树显示,该种舌鳎属样品与短吻红舌鳎和长吻红舌鳎以及短吻三线舌鳎与紫斑舌鳎分别聚为一支,其他种类各聚为一支。综合形态特征和COI基因比对结果,确定该舌鳎属鱼卵、仔鱼样品为短吻红舌鳎。     

半滑舌鳎基因组的提取及ISSR反应体系的建立

目的:比较CTAB法和STE法提取半滑舌鳎基因组DNA的效果,通过优化半滑舌鳎ISSR-PCR反应体系,将新型分子标记简单重复间序列(Inter-simple sequence repeat,ISSR),引用到半滑舌鳎遗传多样性研究中。方法:以95%酒精固定的半滑舌鳎鳍条为材料,运用CTAB法和STE法提取基因组DNA,同时分析了模板DNA、Mg2 、dNTPs、引物浓度,以及退火温度对ISSR-PCR扩增结果的影响。结果:CTAB法提取的基因组DNA质量好于STE法提取的结果,同时确立了稳定性强、重复性好的半滑舌鳎ISSR-PCR最佳反应体系和扩增参数。在25lμPCR反应体系中包括:1×PCR缓冲液,2mmol/L MgCl2,0.2mmol/L dNTP,0.2μmol/L ISSR引物,20ng模板DNA,1.5U Taq DNA聚合酶。反应程序为:94℃预变性5min,然后进入PCR循环,即94℃变性45s,52℃退火45s,72℃延伸90s,共进行40个循环。最后72℃延伸10min。结论:ISSR-PCR反应体系稳定可靠,该新型分子标记可应用于半滑舌鳎遗传多样性研究中。     

饲料中添加水解鱼蛋白对半滑舌鳎稚鱼生长及生理生化指标的影响

试验研究了饲料中添加不同水平(0%、20%、40%和60%)的水解鱼蛋白(Fish potein hdrolysate,FPH)对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)稚鱼生长及生理生化指标的影响。28d饲养实验结束后,对试验鱼生长指标、鱼体消化酶活性、碱性磷酸酶(AKP)及肠道发育情况进行分析。结果显示:实验鱼的存活率为64.44%—78.88%,其中20%与40%添加组存活率显著高于其他两组(P0.05);实验鱼的特定生长率(SGR)随饲料中FPH添加水平升高呈下降趋势,20%添加组特定生长率最高,显著高于其他3组(P0.05),且60%添加组与对照组(FM)之间无显著差异(P0.05);各试验组鱼体消化酶(脂肪酶、淀粉酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶)的比活力在14d与28d时的强弱关系不一致。鱼体碱性磷酸酶比活力大小依次为:20%组40%组对照组60%组,各组间差异均显著(P0.05);半滑舌鳎肠道微绒毛长度和黏膜厚度均以20%添加组为最优,显著优于其他3组(P0.05)。以上结果表明,在实验条件下,饲料中FPH的添加水平为20%时,能提高半滑舌鳎稚鱼的存活率及生长性能,并增强其对营养物质的吸收能力。     

半滑舌鳎血红蛋白α1的基因克隆及其在短期低氧胁迫下的表达分析

该文克隆了海洋鱼类——半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis,Cs)的血红蛋白α1 (CsHb-α1)基因全长cDNA序列,并研究了其在短期低氧胁迫下的表达变化.CsHb-α1 cDNA全长594 bp,编码144个氨基酸.氨基酸序列分析表明,该基因与其他物种的Hb具有较高的序列相似性.实时定量PCR检测显示CsHB-α1在心、肝、脾脏、肾脏和血液中表达量较高.与对照组相比(溶解氧:6.2 mg/L),在短期(5～120 min)及36 h低氧胁迫(溶解氧:1.0 mg/L)后,CsHb-α1在心、肝脏、脾脏、肾脏、血液和腮腺中表达量明显升高.这表明Hb-α1的上调是半滑舌鳎适应低氧胁迫的一个重要分子组成.