精制原代地鼠肾细胞狂犬病疫苗灭活工艺的改进

为了提高精制原代地鼠肾细胞狂犬病疫苗（ＰＰＨＫＲＶ）的质量,在甲醛浓度,温度和时间相同的条件下,对静置法和转瓶法灭活狂犬病毒后制成的疫苗进行了效力测定比较,结果表明采用转瓶灭活的ＰＰＨＫＲＶ效力高于静置灭活法。     

应用细胞工厂建立人用狂犬病疫苗连续培养多次收获工艺

目的为提高生产效率、增加原代地鼠肾细胞单产量及狂犬病病毒产量,建立人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）连续培养多次收获工艺。方法选用12-14日龄SPF地鼠,无菌取肾经消化,制备成细胞悬液,分装到40层细胞工厂并培养细胞成单层;接种狂犬病病毒固定毒aG株,连续培养病毒并多次收获。分别对同一细胞批制备的多个单次病毒收获液的免疫原性、病毒滴度和地鼠肾细胞蛋白质含量进行检测。结果用40层细胞工厂培养原代地鼠肾细胞和狂犬病病毒,细胞接种浓度为1．0×10。～1．5x10。cells／mL,（36±1）℃培养72h成致密单层;按0．1MOI病毒接种,可进行6次收获病毒;多个单次病毒收获液病毒滴度均不低于6．0lgLD50／mL;免疫原性检查保护指数不低于100;地鼠肾细胞蛋白质残留量随着收获次数的增加而不断降低。结论用细胞工厂建立了人用狂犬病疫苗连续培养多次收获工艺,能显著提高地鼠。肾单产量,增加产能。     

应用细胞工厂传代原代地鼠肾细胞培养狂犬病病毒

目的应用细胞工厂建立原代地鼠肾(primary hamster kidney, PHK)细胞传代培养工艺,培养狂犬病病毒,为PHK细胞和人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)的规模化放大奠定基础。方法选用SPF级地鼠,无菌取肾,经消化分散接种到细胞工厂中,在37℃下培养筛选出PHK细胞静置培养的最适细胞接种密度;在最适细胞接种密度下,从0.20%水解乳蛋白MEM培养基和改良的DMEM/F12培养基中筛选出更适宜地鼠肾细胞静置培养的培养基;同时对消化液A(含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液)和消化液B(含0.30%柠檬酸钠的0.25%胰蛋白酶溶液)的消化效果进行比对,选择适宜的消化液;最后,使用最佳培养基和消化液对PHK细胞进行传代,观察细胞生长情况并分析代谢水平;对同一细胞批不同代次的单层细胞(P0代、P1代和P2代)接种狂犬病病毒aG株,进行多次收获,检测单次病毒收获液病毒滴度。结果 PHK细胞(P0代)在细胞工厂中适宜的接种密度为0.30×10~6～0.50×10~(6 )cells/cm~2;改良的DMEM/F12培养基和消化液B更适用于PHK细胞的培养和消化传代;在40层细胞工厂(CF40)中使用最佳培养基和消化液传代地鼠肾细胞至第4代(P4代),随着代次的增加,收获的细胞密度降低、葡萄糖消耗减少和乳酸生成下降;P0代、P1代和P2代细胞均有较佳的细胞状态和增殖能力;用P0代、P1代和P2代细胞培养狂犬病病毒,能有效收获4次,且单次病毒收获液病毒滴度结果符合要求,差异无统计学意义(P0.05)。结论成功建立了PHK细胞传代培养工艺,为PHK细胞的规模化放大,冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)生产工艺的改进、变更以及产能的扩大提供了参考。     

一种新型原代地鼠肾细胞（PHKC）精制狂犬病疫苗的实验室质量评估

本文通过对一种新型疫苗－ＰＨＫＣ精制狂犬病疫苗的全面实验室检定并与法国Ｖｅｒｏ细胞狂犬病疫苗比较,认为该疫苗安全性良好,纯度较高,与法国Ｖｅｒｏ细胞狂犬病疫苗具有相同的免疫效果。     

原代地鼠肾细胞及狂犬病毒不同培养方式的研究

目的通过比较原代地鼠肾细胞在转瓶、微载体、细胞工厂的3种培养方式的培养效果,为原代地鼠肾细胞选择一种易扩大规模、培养高质量细胞的培养方式,进而提高狂犬病毒的产量。方法消化取得的细胞悬液分别在转瓶、微载体、细胞工厂中培养,通过显微镜观察细胞形态、计数等结果比对培养的差别。结果细胞工厂可以很好地培养原代地鼠肾细胞和狂犬病毒;而细胞在微载体上贴附性差,生长不好。结论实验结果表明细胞工厂可以取代转瓶,用于大规模培养原代地鼠肾细胞扩大狂犬病毒的产量。     

重组猪胰酶在冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)中的应用

目的 探究重组猪胰酶(recombinant porcine trypsin, RPT)代替猪源胰酶在冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)生产中的可能性。方法 选用SPF级地鼠,无菌取肾,用4种不同浓度(0.05、0.10、0.15和0.20 mg/mL)的重组猪胰酶消化原代地鼠肾(primary hamster kidney, PHK)细胞,比较细胞总数、细胞活率以及培养6 d的细胞形态,筛选出最佳重组猪胰酶的工作浓度;对消化液A(含0.30%柠檬酸钠的0.30 mg/mL重组猪胰蛋白酶溶液)和消化液B(含0.30%柠檬酸钠的0.15 mg/mL重组猪胰蛋白酶溶液)消化效果进行对比,选择合适的消化液;对P1代PHK细胞接种狂犬病病毒aG株,确定最佳病毒感染复数(multiplicity of infection, MOI);对不同胰酶消化的细胞接种狂犬病病毒aG株,并比较两者病毒滴度。结果 重组猪胰酶对原代PHK细胞消化的最佳浓度为0.10 mg/mL,消化液A更适用于P1代PHK细胞的消化,细胞培养6 d后形成致密单层,胞体饱满;最佳MOI范围为0.10～0.50,且试验具有高度重复性...     

用Vero细胞大量制备传染性法氏囊病病毒

目前传染性法氏囊病病毒疫苗主要是用原代鸡胚成纤维细胞 (ＰＣＥＦ)增殖ＩＢＤＶ进行生产。由于ＳＰＦ种蛋价格高 ,且ＳＰＦ种蛋在取得及培养过程中易被外源病原污染 ,造成产品质量的不稳定 ,生产成本很高[1] 。Ｖｅｒｏ细胞系是一种贴壁依赖性的传代细胞系 ,ＷＨＯ已经批准用Ｖｅｒｏ细胞作为载体进行病毒疫苗的生产。目前已成功地应用Ｖｅｒｏ细胞生产出脊髓灰质炎病毒疫苗和狂犬病毒疫苗[2 ] 。用Ｖｅｒｏ细胞生产传染性法氏囊病病毒疫苗也会有较好的前景。我们已完成了在Ｖｅｒｏ细胞上静止状态下增殖ＩＢＤＶ弱毒株的培养条件研究 ,而…     

猪瘟病毒弱毒株感染对体外培养细胞增殖的促进作用*

猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）能在多种体外培养细胞中增殖,却不使细胞产生病变（ＣＰＥ）。使用原代细胞增殖ＣＳＦＶ弱毒疫苗。结果显示：病毒的增殖能够增加原代牛睾丸细胞的传代次数和维持时间。因此,ＣＳＦＶ疫苗一产上能够在接毒后多次收获病毒。此外,ＣＳＦＶ弱毒株还能够刺激体外培养的兔巨噬细胞增殖,使形成致密的单细胞层。使用传代细胞ＰＫ１５样殖病毒,经流式细胞术检测发现ＣＳＦＶ弱毒的增殖不仅不改变ＰＫ１５细胞的增殖     

粗制地鼠肾细胞狂犬病疫苗纯化工艺的建立

分别用Sepharose 4B、Sephacryl-200HR和Sepharose6-Fast flow柱色谱进行地鼠肾细胞狂犬疫苗浓缩原液纯化试验,试制精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗。对疫苗的残余牛血清含量、效力、收获率和安全性进行检测,优化和建立了精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗纯化工艺。     

精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗纯化工艺的建立

分别用Srpharose4B、Sephacryl-200HR和Sepharose6-Fastflow柱色谱进行地鼠肾细胞狂犬病疫苗浓缩原液纯化试验,试制精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗.对疫苗的残余牛血清含量、效力、收获率和安全性进行检测,优化和建立了精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗纯化工艺.