蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒类凝血酶的研究——Ⅰ.分离提纯及理化、酶学性质的鉴定

(1) 浙江产蝮蛇蛇毒中含有三种具有精氨酸酯酶活力的组分。它们分别是激肽释放酶、类凝血酶及类溶血纤维酶。其中类凝血酶的精氨酸酯酶活力最高,约占总酯酶活力的60%。(2) 提纯后的类凝血酶在聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈一条区带。经凝胶过滤及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,其分子量约43,000。氨基酸组成分析表明含有较多的酸性氨基酸及脯氨酸,此外还含有约6%的中性糖,9%的己糖胺及3.3%的唾液酸。(3) 类凝血酶能直接使血纤维蛋白原凝聚,水解BAEE的活力约是胰蛋白酶的2.7倍,K_m为3.4×10~(-4)M,高于其它已知的蝮亚科蛇毒类凝血酶活力。它不作用于BANA、BAPA及其它蛋白底物。蛇毒类凝血酶与人凝血酶一样,对专一萤光底物Boc-Val-Pro-Arg-MCA都有明显活力,但其凝结血纤维蛋白原的活力却远低于人凝血酶。(4) 类凝血酶能被DFP及PMSF所抑制,但抑制速度缓慢,不能被胰蛋白酶的专一抑制剂TLCK所抑制,因而是专一性很强的丝氨酸蛋白酶。     

烙铁头蛇毒纤维蛋白原溶酶研究 Ⅰ分离纯化及理化性质(英文)

通过DEAE-SephadexA-50,DEAE-SepharoseCL-6B,MonoQ （FPLC）三步离子交换柱层析,纯化得到一新的纤维蛋白原溶酶,在碱性聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上均呈单一的蛋白带。分子量为2600,等电点pl4.7;它是一个糖蛋白,含糖量6.4%,其中中性糖0.3%,已糖胺4.9%,唾液酸1.2%。烙铁头蛇毒纤维蛋白原溶酶TMVFg由187个氨基酸组成,含有较高的酸性氨基酸,此外甘氨酸含量也较高。TMVFg热稳定性强,而酸不稳定,在280 nm处具有典型的蛋白吸收峰,在无离子水中紫外消光系数E0.1%/280 nm=1.558。纯化的TMVFg具有较强的精氨酸酯酶活力,对苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）的Km值为1.4×10[-3]M。TMVFg的活性受苯甲基丹磺酰氟（PMSF）抑制;乙二胺四乙酸（EDTA）对活性无影响。TMVFg不能使纤维蛋白原凝固,但能水解纤维蛋白原α、β链。纤溶实验表明TMVFg具有激活纤溶作用。纯化的烙铁头蛇毒纤维蛋白原溶酶对酪蛋白无作用,无出血活性,因而与凝血酶样酶、出血毒素及β-纤维蛋白原溶酶（OUYANG et al.,1977）明显不同。     

浙江蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒激肽释放酶Ⅰ的分离纯化及其性质的研究

浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒中含有激肽释放酶,不需活化即可水解激肽原,释放激肽,并具有较弱的精氨酸酯酶的活力。粗毒经DEAE纤维素(DE-22,DE-52)和Sephadex G-75分离纯化后,可得到两个激肽释放酶的组分:Ⅰ与Ⅱ,二者电泳行为与酶活力有所不同,激肽释放酶Ⅰ在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈一条带,而组分Ⅱ中还杂有少量组分Ⅰ。激肽释放酶Ⅰ为一糖蛋白,含糖量20.3%,约由221个氨基酸残基组成,凝胶过滤和SDS电泳测定其分子量分别为31,000和30,000。此酶具有严格的底物专一性,能作用于激肽释放肽的专一底物Z-Phe-Arg-MCA及Bz-Pro-Phe-Arg-PA,不作用于一般蛋白质底物酪蛋白,对TAME的水解速度仅是对BAEE的14%。以BAEE为底物时,其最适pH为8～9,K_m值为2.85×10~(-4)M。本文测定了不同pH和不同温度下酶的稳定性,pH低于5或大于9,温度在40℃以上,酶活力迅速下降。其精氨酸酯酶及激肽释放酶的活力均能被丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF和DFP所抑制,两者呈平行关系,但都不被胰蛋白酶的专一抑制剂TLCK所抑制,慈菇抑制剂与大豆(Kunitz)抑制剂对此酶有部分抑制作用。经磷酸纤维素等阳离子交换树脂层析或交联的慈菇抑制剂Sepharose-4B亲合层析也能提纯激肽释放酶Ⅰ,但提纯后精氨酸酯酶活力下降,激肽释放活力几乎全部丧失。经圆二色光谱测定表明,酶的构象已发生改变。     

猪血纤维蛋白溶酶原的纯化及性质研究

 用偶联有L-赖氨酸的Sepharose 4B亲和柱对猪血纤维蛋白溶酶原进行分离纯化,所得酶原在酸性及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示单一蛋白质区带,在碱性条件下电泳及等电聚焦电泳表现出较明显的不均一性。还原及非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得酶原分子量为88kD,经尿激酶激活后,进行还原SDS-凝胶电泳,出现两条新的蛋白质区带,分子量分别为63kD和26kD。酶原含中性糖1.35％,N-末端为异亮氨酸。尿激酶激活后产生的血纤维蛋白溶酶以对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯为底物,测得Km为4.2m mol/L,V_(max)为13.5 IU。6-氨基已酸对酶活性有双重影响。此外,还观察了胰蛋白酶对猪血纤维蛋白溶酶原的激活。     

华广虻肠道溶纤活性蛋白的纯化和性质(英文)

经过 75 %饱和度硫酸铵沉淀、SephadexG 75凝胶过滤层析、Lys Sepharose 4B亲和层析和电泳制备洗脱 ,从华广虻 (TabanusamaenusWalker)腹部组织匀浆液中分离纯化出分子量约为 6 7KD的溶纤活性蛋白TAFP。经纤维蛋白平板测定表明 ,TAFP不仅具有纤溶酶作用 ,还具有激活纤溶酶原的作用 ;通过三肽生色底物测定发现 ,TAFP能分解纤溶酶原激活剂的生色底物—ChromozymUK及S 2 2 88。还能水解胰蛋白酶专一底物Bz Phe Val Arg NA及CBZ Gly Pro Arg NA ,表明TAFP具有类胰蛋白酶活性 ,专一水解精氨酸形成的酰胺键 (或肽键 )。TAFP无胰凝乳蛋白酶活性     

福建产尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒的柱层析分离及酶活力和某些生理效应的测定

用二乙氨基乙基葡聚糖凝胶A—50(DEAE-Sephadex A—50)对福建产尖吻蝮蛇蛇毒进行柱层析分离,获得11个蛋白峰。其中第一峰具有蛋白水解酶及磷酸二酯酶活力,同时还有纤维蛋白溶解作用及局部出血作用。第Ⅵ峰具有较强的精氨酸酯酶活力及凝血酶样的直接凝血效应。第Ⅰ及Ⅳ峰能明显延长血液凝固时间,呈抗凝血效应。第Ⅹ峰具有明显的毒性作用,腹腔注射于小白鼠,可致远隔部位的皮下、肌肉,胸壁内侧以及腹腔等处出血甚至死亡。 尖吻蝮蛇粗毒具有较高的蛋白水解酶、精氨酸酯酶、5′一核苷酸酶及磷酸二酯酶的活力,而碱性磷酸单酯酶、L—氨基酸氧化酶及磷酯酶A的活力均较低,胆碱酯酶的活力近于零。     

以靛酚乙酸酯为底物的酯酶同工酶显色方法的研究

建立一种以靛酚乙酸酯为底物的酯酶同工酶的显色新方法。酯酶样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶用磷酸缓冲液漂洗约10min后,浸入含有0.002%靛酚乙酸酯的溶液显色5～10min,可显出清晰的蓝色酯酶带。先将酯酶凝胶板浸于有机磷农药溶液中,然后再用靛酚乙酸酯显色液显色,比较同工酶谱,从同工酶带由深蓝色变为浅蓝色的颜色变化,可以看出对有机磷农药敏感的同工酶所受到的抑制程度。     

蛇毒中凝血酶样酶的研究

蛇毒中凝血酶样酶的研究韦世秀广西医科大学蛇毒研究所南宁５３００２１许多蝮亚科蛇毒中都含有一种氨基酸酯酶［１］,它催化纤维蛋白原分子特定部位Ａｒｇ－Ｇｌｙ肽键的裂解,释出血纤肽而转换为纤维蛋白。其作用与血浆凝血酶十分相似,因而称之为凝血酶样酶（Ｔｈｒｏ...     

蛇毒丝氨蛋白酶多样性：底物专一性免疫化学及序列比较研究

本文报道烙铁头蛇毒纤维蛋白原溶酶,眼镜王蛇蛇毒纤维蛋白原溶酶,竹叶青蛇毒专一纤溶酶原激活剂对５种小分子多肽底物的底物专一性,及这些蛇毒丝氨酸蛋白酶对各种凝血因子（第Ｘ因子、凝血酶原、纤溶酶原、蛋白Ｃ）的作用,并和其它蛇毒丝氨酸蛋白酶如矛头蝮蛇毒凝血酶样酶、铜头蝮蛇毒蛋白Ｃ激活剂ＡＣＣ－Ｃ、蝰蛇毒第Ｖ因子激活剂ＲＶＶ－Ｖ进行比较研究。通过酶标偶联免疫反应研究了抗ｓｖ－ＰＡ抗体与各种丝氨酸蛋白酶的免疫     

尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒凝血酶样成分的研究 Ⅱ.酶学与血液学活性的研究

对四个凝血酶样成分(TLP)的酶学性质的比较研究表明,它们都具有凝结(血)活性和精氨酸酯酶活性。其凝结活力TLP_4>TLP_3>TLP_1>TLP_2,Ca~(++)有激活作用,但不被肝素、EDTA所抑制;精氨酸酯酶活力以TLP_1、TLP_2较高,Ca~(++)、EDTA无明显的激活或抑制作用;TLP_1对热比较稳定,TLP_4对于酸碱变化比较稳定。经动物体内试验表明,TLP_1、TLP_2具有较强的去纤抗凝作用,TLP_3、TLP_4不显示抗凝作用,而显示出较强的促凝血作用。结果表明,尖吻蝮蛇毒与美洲矛头蝮蛇毒一样,同时含有去纤酶(Defibrase)和蛇毒凝血酶(Hemocoagulase)。这一结果对该蛇毒的研究与应用是很有意义的。     

慈菇中两种结晶的多功能蛋白酶抑制剂的研究

由于蛋白酶抑制剂在生理、生化、病理、药理上都占有很重要的地位,特别是具有多功能的蛋白酶抑制剂被广泛应用于临床,近年来愈来愈受到各方面的重视。本文报道了从慈菇中提取两种结晶的多功能蛋白酶抑制剂,它们都具有两个活力相等的活性中心,这与其他已知的同类型植物蛋白酶抑制剂不同,有它的特殊性。(1)慈菇蛋白酶抑制剂A、B,除能抑制胰蛋白酶外,还能抑制胰凝乳蛋白酶及猪颌下腺的舒缓激肽释放酶。用酰胺、酯及蛋白等不同底物分别求出抑制剂A、B对胰蛋白酶的当量抑制比值及对胰凝乳蛋白酶的半抑制比值。两者对胰蛋白酶的抑制常数在10~(-9)～10~(-10)的范围内,抑制剂B对胰蛋白酶较之A有更大的结合力,但抑制剂A对胰凝乳蛋白酶及舒缓激肽释放酶较之B却有更明显的抑制活力。(2)用葡聚糖凝胶过滤及聚丙烯酰胺凝胶电泳分别测定抑制剂A、B的分子量均在17000左右。从抑制剂A、B对胰蛋白酶的当量抑制比值求得分子量为8500。这说明每一抑制剂分子中具有两个活力相等的活性中心。(3)测定了抑制剂A、B的氨基酸组成,二者除碱性氨基酸及天冬氨酸含量略有差异外其余皆相同,各含有两对二硫键,非极性氨基酸含量较高约占60%左右。由氨基酸组成求得最小分子量约16500。(4)用二硝基氟苯,二甲基氨基萘磺酰氯及氨肽酶M测定抑制剂A、B的N末端,都证实是天冬氨酸。     

蛇毒类凝血酶的研究进展

蛇毒类凝血酶（TLE）属胰蛋白酶家族中的丝氨酸蛋白酶,在序列上与胰蛋白酶有更多的保守序列。具有精氨酸酯酶活性,能直接作用于纤维蛋白原,催化纤维蛋白原分子的特定部位Arg—Gly肽键的裂解,释放血纤肽A（FPA）或B（FPB）,导致纤维蛋白的单体首尾聚合而凝固,故被称为类凝血酶。但它在体内不激活凝血因子瑚,由它水解生成的纤维蛋白凝块不产生侧链交联,对纤溶酶的消化高度敏感,易被天然网状内皮系统或正常的纤溶作用所清除。因此导致胞浆中纤维蛋白原浓度显著下降,表现降纤、抗凝的效果。     

烙铁头蛇毒纤维蛋白原溶酶研究——Ⅱ.对纤维蛋白原及凝血酶的作用

烙铁头(T.mucrosquamatus)蛇毒纤维蛋白原溶酶TMVFg能水解三肽底物Bz-Phe-Val-Arg-PNA,但对凝血酶的良好底物Cbz-Gly-Pro-Arg-PNA却活性甚低。TMVFS显著延长血浆凝血酶时间。血浆复钙时间及纤维蛋白原溶液凝血酶时间。同时,TMVFg体外也能延长全血凝固时间,表明具有抗凝作用。纤维蛋白原-纤维蛋白转换实验表明:TMVFg水解纤维蛋白原产生的纤维蛋白原断片(FDP)除具有抗凝血酶,抑制纤维蛋白聚合活性外,还能促进纤维蛋白的聚合。 进一步用FPLC分离TMVFg水解人纤维蛋白原混合液,得两个FDP断片功能峰,FDP组分Ⅰ和FDP组分Ⅱ。其中FDP组分Ⅰ能抑制纤维蛋白凝块形成;FDP组分Ⅱ能促进纤维蛋白凝块形成,抑制TMVA(烙铁头蛇毒血小板活化素,它可不通过ADP、花生四烯酸途径而诱导血小板聚集),但对ADP诱导的家兔血小板聚集无影响。TMVFg对凝血酶水解三肽底物Cbz-Gly-Pro-Arg-PNA及凝固纤维蛋白原的活性也有一定抑制作用。 实验证明,TMVFg抗凝的主要作用机理是其水解纤维蛋白原产生的断片对纤维蛋白原凝固的抑制作用、FDP断片抗凝血酶作用及TMVFg本身对凝血酶活性的抑制所引起的,但在二者之间,前者是主要的。 从研究结果发现:TMVFg水解纤维蛋白原所产生的断片有一类能加速凝血酶凝固纤维蛋白原的过程,这就发现了FDP断片的     

甘薯和花生胰蛋白酶抑制剂的初步研究

许多植物蛋白制成品均含有抑制动物消化的蛋白酶抑制剂。目前已从某些豆类及蔬菜种子中分离出多种对胰蛋白酶具有抑制作用的活性物质。该实验以花生、甘薯等为原料,通过DEAE-Sepharose4BFF阴离子交换柱层析分离胰蛋白酶抑制剂,以N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)为底物测定其对胰蛋白酶的抑制活性;将具有抑制活性的组分通过SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量(Mr);以聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质等电点(pI)。结果显示,甘薯中至少有4种胰蛋白酶抑制剂组分,相对分子质量为20～25kD、等电点在pH5.0～6.6之间;花生中至少有三种胰蛋白酶抑制剂组分,相对分子质量为30～70kD、等电点在pH5.0～5.8之间。     

五步蛇毒中低分子量蛇毒类凝血酶的分离纯化

目的 寻找五步蛇毒新的蛇毒类凝血酶组份。方法 用ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（－ＦＦ）,ｃｍ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－ＦＦ纯化经常规化学提纯的五步蛇毒;以血凝活性和精氨酸酯酶活性（ＢＡＥＥ）检测酶活力;以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳法测定分子量。结果 得到分子量为１４０００左右的电泳纯蛇毒类凝血酶组份。结论 五步蛇毒中含有低分子量蛇毒类凝血酶。     

慈菇中两种结晶的多功能蛋白酶抑制剂的研究

由于蛋白酶抑制剂在生理、生化、病理、药理上都占有很重要的地位,特别是具有多功能的蛋白酶抑制剂被广泛应用于临床,近年来愈来愈受到各方面的重视。本文报道了从慈菇中提取两种结晶的多功能蛋白酶抑制剂,它们都具有两个活力相等的活性中心,这与其他已知的同类型植物蛋白酶抑制剂不同,有它的特殊性。(1)_慈菇蛋白酶抑制剂A、B,除能抑制胰蛋白酶外,还能抑制胰凝乳蛋白酶及猪颌下腺的舒缓激肽释放酶。用酰胺、酯及蛋白等不同底物分别求出抑制剂A、B对胰蛋白酶的当量抑制比值及对胰凝乳蛋白酶的半抑制比值。两者对胰蛋白酶的抑制常数在10~(-9)～10~(-10)的范围内,抑制剂B对胰蛋白酶较之A有更大的结合力,但抑制剂A对胰凝乳蛋白酶及舒缓激肽释放酶较之B却有更明显的抑制活力。(2)_用葡聚糖凝胶过滤及聚丙烯酰胺凝胶电泳分别测定抑制剂A、B的分子量均在17000左右。从抑制剂A、B对胰蛋白酶的当量抑制比值求得分子量为8500。这说明每一抑制剂分子中具有两个活力相等的活性中心。(3)_测定了抑制剂A、B的氨基酸组成,二者除碱性氮基酸及天冬氨酸含量略有差异外其余皆相同,各含有两对二硫键,非极性氨基酸含量较高约占60%左右。由氨基酸组成求得最小分子量约16500。(4)_用二硝基氟苯,二甲基氨基萘磺酰氯及氨呔酶M测定抑制剂A、B的N末端,都证实是天冬氨酸。     

一种新型的α-纤维蛋白原酶对血小板聚集的影响

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测中国眼镜蛇毒蛋白酶水解纤维蛋白原的作用方式,发现该蛋白酶可迅速水解纤维蛋白原Aα链,对γ链作用较弱,对Bβ链无作用,是一种新型的α-纤维蛋白原酶.用比浊法测定血小板聚集率,证实中国眼镜蛇毒蛋白酶低剂量(0.025 mg/kg)、中剂量(0.05 mg/kg)以及高剂量(0.1 mg/kg)体内给药浓度依赖性地抑制ADP(10 .Μmol/L)和胶原(100 mg/L)诱导的兔血小板聚集.     

眼镜蛇毒纤维蛋白原溶解因子的纯化及理化性质的研究

经Heparin-SepharoseCL-6B亲和层析和SephadexG-150分子筛层析,从中国眼镜蛇毒(Najanajaatra)中纯化出一种可水解纤维蛋白原Aα链的蛋白酶——组分F.SDS-PAGE测得分子量为47100,为一含2%中性己糖的单肽链糖蛋白;它对纤维蛋白、酪蛋白和苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)均无水解作用,也无激活纤溶酶原的作用;100μg皮下或皮内注射,未见出血反应。组分F对酸和热均不稳定。EDTA,EGTA,PMSF和肝素等可抑制其纤维蛋白原溶解活性,benzami-dine,aprotinin和大豆胰蛋白酶抑制因子(SBTI)则无抑制作用。     

东亚飞蝗山西两地理种群酯酶特性的比较研究

对东亚飞蝗山西临猗和永济2个地理种群的酯酶特性进行了比较研究.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱显示:以a-乙酸萘酯为底物染色,2个东亚飞蝗种群谱带差别不明显.但是,酯酶动力学研究结果表明:以a-乙酸萘酯和α-丁酸萘酯为底物时,永济种群的酯酶活性分别是临猗种群的1.81倍和1.20倍.永济种群酯酶活性的增高可能与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱显示出较临猗种群多出的酶带有关.体外酯酶抑制动力学研究表明:永济和临猗2种群所含酯酶大都为B型酯酶,其含量分别为84.94%和91.47%.永济种群对对氧磷的耐受性要高于临猗种群,我们推测可能与2种群马拉硫磷使用背景不同有关.     

烙铁头蛇毒素纤维蛋白原溶酶研究:Ⅱ.对纤维蛋白原及凝血酶的作用

烙铁头（T.mucrosquamatus）蛇毒纤维蛋白原溶酶TMVFg能水解三肽底物Bz-Phe-Val-Arg-PNA，但对凝血酶的良好底物Cbz-Gly-Pro-Arg-PNA却活性甚低。TMVFg显著延长血浆凝血酶时间、血浆复钙时间及纤维蛋白原溶液凝血酶时间。同时，TMVFg体外也能延长全血凝固时间，表明具有抗凝作用。纤维蛋白原-纤维蛋白转换实验表明：TMVFg水解纤维蛋白原产生的纤维蛋白原断片（FDP）除具有抗凝血酶，抑制纤维蛋白聚合活性外，还能促进纤维蛋白的聚合。进一步用FPLC分离TMVFg水解人纤维蛋白原混合液，得两个FDP断片功能峰，FDP组分Ⅰ和FDP组分Ⅱ。其中FDP组分Ⅰ能抑制纤维蛋白凝块形成；FDP组分Ⅱ能促进纤维蛋白凝块形成，抑制TMVA（烙铁头蛇毒血小板活化素，它可不通过ADP、花生四烯酸途径而诱导血小板聚集），但对ADP诱导的家兔血小板聚集无影响。TMVFg对凝血酶水解三肽底物Cbz-Gly-Pro-Arg-PNA及凝固纤维蛋白原的活性也有一定抑制作用。实验证明，TMVFg抗凝的主要作用机理是其水解纤维蛋白原产生的断片对纤维蛋白原凝固的抑制作用、FDP断片抗凝血酶作用及TMVFg本身对凝血酶活性的抑制所引起的，但在二者之间，前者是主要的。从研究结果发现：TMVFg水解纤维蛋白原所产生的断片有一类能加速凝血酶凝固纤维蛋白原的过程，这就发现了FDP断片的新功能。它证明了FDP断片作为血液凝固、纤溶正反馈调节因子的功能。这一类FDP断片还能抑制TMVA诱导的血小板聚集，因此，烙铁头蛇毒纤维蛋白原溶酶TMVFg将成为研究血液凝固调节系统及血小板聚集第三条途径的强有力试剂。