β-葡萄糖苷酶在工农医领域的应用

β-葡萄糖苷酶能够水解多种β-葡萄糖苷.它与其他纤维素酶共同作用,可以将自然界中含量丰富的纤维素水解成人类可以直接利用的能源物质--葡萄糖;β-葡萄糖苷酶在医学上也有重要的应用,它可用于一些肿瘤疾病的诊断和治疗.人缺乏β-葡萄糖苷酶,可以引起葡萄糖苷-N-脂酰鞘氨醇在巨噬细胞溶酶体内积累,引发戈谢病(Gaucher disease).     

利用黑曲霉β-葡萄糖苷酶催化香兰素葡萄糖苷水解

本文通过在香兰素葡萄糖苷溶液中加入黑曲霉菌种发酵制取的β-葡萄糖苷酶,进行酶促反应实验,定时取样进行高效液相分析检测,结果表明在反应过程中,溶液中香兰素葡萄糖苷的含量呈逐步下降趋势,香兰素的量呈逐步增加趋势;而在没有加β-葡萄糖苷酶的对照实验中,整个反应过程中香兰素葡萄糖苷的含量基本没有出现什么变化,在反应液中也没有检测到香兰素,这说明黑曲霉β-葡萄糖苷酶能够催化香兰素葡萄糖苷分解为香兰素的反应.     

耐糖β-葡萄糖苷酶基因的挖掘、突变及应用研究进展

降低木质纤维素生物炼制的用酶成本,对推动木质纤维素的绿色利用至关重要。作为纤维素水解过程中的限速酶,β-葡萄糖苷酶酶解活性受高浓度葡萄糖的胁迫抑制。目前,挖掘和突变耐糖β-葡萄糖苷酶的基因是解决这一问题的重要策略。本综述总结了近年来在耐糖β-葡萄糖苷酶基因的挖掘、酶耐糖分子机制的分析、旨在提高酶耐糖性能的酶基因突变以及基于β-葡萄糖苷酶基因的微生物菌株基因工程改造等方面所取得的进展,并进行了展望。本综述为构建高产耐糖β-葡萄糖苷酶的基因工程菌株提供参考,这对推动木质纤维素生物炼制工业化进程具有重要意义。     

β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选及其所产纤维素酶酶系组成分析

从木霉属、曲霉属、担子菌等17种试验菌株中筛选出一株产β-葡萄糖苷酶活性较高的黑曲霉A.niger-nl-1。该菌株在适宜的培养条件下,β-葡萄糖苷酶的最高活力达到4.7U/mL,适宜的产酶周期为4d。制备的β-葡萄糖苷酶最适反应温度为55℃、最适反应pH为5.0。该菌株除能产生β-葡萄糖苷酶外,还能产生内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶,滤纸酶活达到0.62IU/mL。     

新型海洋微生物β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及重组酶性质

通过功能筛选方法,从中国南海海洋表层海水微生物元基因组文库筛选得到了6个β-葡萄糖苷酶阳性克隆。对其中的一个阳性克隆pSB47B2进一步亚克隆和序列分析,获得一新型β-葡萄糖苷酶基因(命名为bgl1B)开放阅读框。以pET22b(+)为载体、Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌,bgl1B被高效活性重组表达。通过Ni-NTA亲和层析柱纯化了重组Bgl1B(rBgl1B)。纯化的rBgl1B催化pNPG水解反应的最适pH为6.5,最适温度为40oC。在最适反应条件下,rBgl1B水解pNPG的活性达到39.7U/mg,Km和Vmax分别为0.288mmol/L、36.9μmol/min。纤维二糖是rBgl1B的有效作用底物,其Km和Vmax分别为0.173mmol/L、35μmol/min。但rBgl1B不能催化转化蔗糖、乳糖、麦芽糖以及CMC。rBgl1B催化pNPG的水解反应对高浓度的Na+有较好的耐受性,而低浓度的Ca2+、Mn2+对该酶活有一定促进作用。不同于许多来源于真菌的酸性β-葡萄糖苷酶,rBgl1B在pH7.0～9.0范围内具有比较高的酶活力并具有较好的稳定性。     

UTH1基因破坏提高重组酿酒酵母分泌β-葡萄糖苷酶

异源蛋白质分泌效率低限制了重组酿酒酵母的多种药用蛋白和工业酶生产。挖掘促进蛋白质生物合成和分泌的关键基因,是提高异源蛋白质生产效率的重要手段。酿酒酵母细胞壁完整性影响异源蛋白质分泌,本研究利用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术,破坏了重组酿酒酵母Y294-BGL1中参与细胞壁合成的未知功能基因UTH1,发现所获得的突变体胞外β-葡萄糖苷酶酶活比出发菌株提高112.9%,而细胞壁完整性下降。对促进产酶的分子机理进行探索,发现突变体产酶条件下与细胞壁完整性相关的关键基因和与蛋白质分泌途径相关的基因转录出现明显差异,提示UTH1基因破坏不仅影响细胞壁完整性关键基因的表达,也影响蛋白质分泌途径。本文的研究结果有助于深入理解UTH1的基因功能,并为构建异源蛋白质高分泌酵母菌株提供了借鉴。     

一种来源于蜗牛酶的β-葡萄糖苷酶的纯化

通过DEAE-Sepharose离子交换分段层析、DEAE-Sepharose离子交换梯度层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析三种方法的联用,从中华白玉蜗牛消化酶中提纯出一种β-葡萄糖苷酶。该酶在SDS-PAGE上呈单一蛋白质条带。应用SDS-PAGE和凝胶过滤层析测定其分子量,提示该酶是由4个分子量为110~115 kD的相同亚基组成的同源四聚体。pNPG为底物的动力学参数Km和Vmax分别为0.182 mmol/L和0.189μmol/(min.mg)。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的酶学特性研究

研究黑曲霉β-葡萄糖苷酶的酶学特性,采用酶学研究方法,通过硫酸铵沉淀、Sephadex G-25脱盐和Sephadex G-100纯化了β-葡萄糖苷酶,并进行了黑曲霉β-葡萄糖苷酶的最适反应温度、最适pH、热稳定性、pH稳定性及米氏常数等特性研究,采用SDS-PAGE凝胶电泳测定了分子量。研究表明,β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为70℃、最适反应pH为4.5;在40、50和60℃下较稳定,80℃以上稳定性差;β-葡萄糖苷酶在pH为3、7、8、9的缓冲液中的稳定性很差,在pH为4、5、6的缓冲液中稳定性较好,其中在pH为5时,稳定性最好;酶的Km=41.67 mmol/L,Vmax=23.81 U/L;其分子量为65.2 ku。β-葡萄糖苷酶在饲料工业具有良好的应用前景。     

β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母表面的表达

应用表面表达技术对来自Trichodermareesei的β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母表面的表达及后期性质进行了研究。实验结果表明酵母表面表达酶有活性,该酶的最佳诱导时间为24h,最适温度是70℃,而酶活的最适pH是5．5。使异源表面表达了Bgl1的酵母在以纤维二糖为唯一碳源的培养基中生长,发酵结果表明纤维二糖被明显利用了,但在培养186h后,发酵液中仍残留一定量的纤维二糖。这种技术对纤维素发酵系统中纤维二糖酶活性低的现状有所帮助。     

破坏细胞壁蛋白CWP2基因提高重组酿酒酵母β-葡萄糖苷酶胞外酶活

【背景】重组酿酒酵母广泛应用于生产工业酶和药用蛋白,但是目前仍旧存在异源蛋白产量低、分泌效率差的问题,限制了生产应用。【目的】提高重组酿酒酵母异源分泌蛋白的能力,构建高效的异源蛋白生产细胞工厂。【方法】采用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术,以生产β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母Y294-BGL为出发菌株,构建细胞壁蛋白基因CWP2破坏菌株。【结果】与出发菌株相比,破坏CWP2的破坏菌株在发酵96 h时胞外β-葡萄糖苷酶酶活可提高53%,胞内酶活提高了208%。此外,破坏菌生长未受到影响,对弱酸等环境胁迫的耐性没有下降,未造成过多内质网胁迫。进一步检测发现,破坏菌株胞内活性氧水平下降,同时蛋白胞内运输和分泌途径相关的关键基因表达转录及多个细胞壁生物合成相关基因表达下降。【结论】破坏细胞壁蛋白基因CWP2能够提高异源蛋白β-葡萄糖苷酶的胞外酶活,可作为促进酿酒酵母生产异源蛋白的靶点基因。     

红树林土壤微生物宏基因组文库的构建及两种新颖的β-葡萄糖苷酶基因的鉴定

宏基因组技术是挖掘微生物新酶的重要途径。通过构建红树林土壤微生物Fosmid文库,共获得了约100 000个阳性克隆,该文库外源插入片段平均长度约为30 kb,文库容量达3 Gb。通过对文库中10 000个克隆进行功能筛选,获得了17个具有β-葡萄糖苷酶活性的克隆。对其中2个表达β-葡萄糖苷酶的克隆进行亚克隆,获得2个新颖的β-葡萄糖苷酶的基因,分别命名MhGH3和bgl66。生物信息学分析表明,MhGH3基因由1 992个碱基对组成,bgl66基因由2 025个碱基对组成。在氨基酸水平上,MhGH3和bgl66编码的蛋白质与GenBank数据库中已知β-葡萄糖苷酶的一致性分别为64%和55%。     

灵芝β-葡萄糖苷酶基因的克隆与功能分析

灵芝是我国著名的药用真菌,具有抗癌、抗肿瘤等功效。灵芝酸属于三萜类化合物,是灵芝的主要活性成分,并已成为评价灵芝品质的重要指标之一。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BG)是次生代谢产物合成途径中的关键限速酶,能够调节次生代谢产物的生物合成。本研究通过同源序列比对,注释获得了灵芝β-葡萄糖苷酶基因(GlBG),并通过RNAi技术对灵芝β-葡萄糖苷酶进行功能分析。序列分析结果显示GlBG基因的DNA全长为2 759 bp,包含7个外显子和6个内含子,编码793个氨基酸,其编码的蛋白序列中含有β-糖苷水解酶的2个保守结构域。灵芝β-葡萄糖苷酶基因的沉默转化子中灵芝酸含量比野生型菌株的灵芝酸含量平均降低了38%,并且灵芝酸生物合成途径中的关键酶基因(hmgs、hmgr、fps、sqs和osc)的表达量也显著下降,实验结果表明灵芝β-葡萄糖苷酶在灵芝酸生物合成过程中具有重要作用,并为灵芝次生代谢途径及其调控机制提供了参考。     

蜗牛酶中一种β-葡萄糖苷酶的纯化及酶学性质的研究

通过DEAE-Sepharose离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析的联用从中华白玉蜗牛消化酶中分离出1种具有人参皂苷Rb_1水解活性的β-葡萄糖苷酶.纯化后该酶在SDS-PAGE上呈单一蛋白质条带.反应最适pH为5.6,最适温度是80 ℃.pH稳定范围很广,在pH为4.0～11.0的溶液中和温度60 ℃以下保持长时间稳定状态,是一个耐碱和中等耐热的糖苷酶.Na~+、K~+、Li~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、EDTA、DTT和SDS不影响该酶活性,而Cu~(2+)、Ag~+和Fe~(3+)对该酶则具有明显的抑制作用.pNPG为底物的动力学参数Km和Vmax分别为0.182 mmol/L和0.189 μmol/(min·mg).     

烟曲霉β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析

探索获得优良的β-葡萄糖苷酶基因,对实现其工业化生产具有重要意义。烟曲霉Aspergillus fumigatus基因组中含有一个bgl基因(1 752 bp),编码的蛋白约65 kDa,推测为属于糖苷水解酶家族的β-葡萄糖苷酶。将bgl基因克隆并构建了重组表达载体pGEX-bgl,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导获得表达。重组蛋白经亲和层析纯化后,以七叶苷为底物进行了酶学分析,结果表明该酶的最适温度是45℃,最适pH在5.5~6.0之间,对七叶苷的Km值为17.7 mmol/L。该酶在pH 4~7范围内稳定;70℃保温2 h后仍能保持60%的活性。金属离子和化学试剂对酶活性有不同程度的影响,Ca2+对重组酶有轻微的激活作用,而SDS可强烈抑制其活性。由于其相对于真菌来源的其他葡萄糖苷酶稳定性较高,为进一步的研究与应用奠定了基础。     

两种茶树β-葡萄糖苷酶基因cDNA在原核中表达的研究

采用原核表达系统pET-32a( )载体和BL21trxB(DE3)菌株对两条茶树β-葡萄糖苷酶基因cDNA(GluⅠ和GluⅡ)进行了表达,研究了不同诱导时间、不同诱导温度对两个茶树β-葡萄糖苷酶表达量的影响并测定了两者的活性。表达分析结果表明,诱导6h、25℃时,GluⅠ在总蛋白中所占比例最高;诱导6h、37℃时,GluⅡ在总蛋白中所占比例最高,活性测定结果表明,两种表达蛋白均具有正常的β-葡萄糖苷酶活性,在相同的测定条件下,GluⅡ活性(0.310±0.03U·ml-1)比GluⅠ(0.234±0.03U·ml-1)活性更高。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的催化性质

通过测定黑曲霉β-葡萄糖苷酶的底物特异性,表明该酶不仅能水解纤维二糖和对硝基苯-β-D葡萄糖苷,还能微弱地水解对硝基苯-β-D-半乳糖苷和β-D-木糖苷。Ag~+、Cu~(2+)和Hg~(2+)对该酶有较强的抑制作用。该酶水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷、水杨苷和纤维二糖的Km值分别为2.32、19.11和30.18mmol/L,V_(max)则分别为412、237和198μmol·min~(-1)·mg~(-1),Lineweaver-Burk作图法表明,D-葡萄糖和δ-葡萄糖酸内酯对该酶显示竞争性抑制作用,其Ki分别为5.17和1.31mmol/L。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的提纯与性质

从黑曲霉Aspergillus niger,发酵液中分离提纯了β-葡萄糖苷酶。提纯步骤通过(NH₄)₂SO₄分级沉淀,DEAE-Sephadex A-50和Sephadex G-100等三步纯化,得到凝胶电泳均一的β-葡萄糖苷酶。该酶的最适pH4.5,最适温度60℃,Km为0.44(pNPG),并有较好的热稳定性。用SDS-凝胶电泳法和凝胶色谱法测得该酶的分子量为120 000。     

家蝇β-葡萄糖苷酶基因的克隆及重组表达

克隆家蝇内源性β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,BG)基因并建立原核表达体系,检测其表达产物的活性,了解家蝇内源性BG酶特点,为进一步解释家蝇极强环境适应能力和发现新的种群控制措施提供分子生物学基础。以草地贪夜蛾等结构信息相对完整且研究较为透彻的6种代表性昆虫的BG酶基因序列为参照对象,利用同源克隆结合RACE-PCR的方法,从家蝇cDNA中克隆得到BG酶基因的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析。分别采用原核表达载体pET-28a(+)构建原核表达体系并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达BG酶基因的融合蛋白。采用七叶苷平板显色法和DNS法检测表达体系融合蛋白的酶活性,并对其性质进行初步的分析。家蝇体内克隆得到了长度为1933 bp的家蝇BG酶基因全长cDNA序列,推导其为562个氨基酸残基组成的蛋白多肽。重组原核质粒经诱导表达后,在65 kDa附近均出现特异性蛋白条带,证实重组质粒成功表达。重组表达的家蝇BG酶兼具内切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶和BG的酶活性。家蝇BG酶是一种新的多功能纤维素酶,是昆虫纤维素酶研究的重要补充。     

海藻酸钠固定化β-葡萄糖苷酶的研究

以海藻酸钠为载体,研究了β-葡萄糖苷酶固定方法及其条件,并利用固定化β-葡萄糖苷酶进行了酶解试验。结果表明,采用交联-包埋方式,在海藻酸钠质量分数3．5％、给酶量100U／g载体、戊二醛体积分数1％、氯化钙质量分数2％的条件下固定β-葡萄糖苷酶2h,可以获得较佳的固定化效果。其固定率达到65％,重复分批利用20次仍能保持90％以上的酶解得率。利用固定化β-葡萄糖苷酶连续酶解纤维二糖时,在不同进料速度下有着不同的催化效率,当进料速度为1．5mL／min、1．0mL／min时,酶解得率分别达到96,7％和99．0％;与木霉纤维素酶协同水解纤维素时,在β-葡萄糖苷酶总酶活与滤纸酶活之比为0．5（FPA为2．0U／mL）的条件下,酶解滤纸纤维素和微晶纤维素60h的得率比单独采用木霉纤维素酶分别增加了20．4％和29．3％。研究结果对于解决酶法水解纤维资源得率低、酶使用成本高这一关键问题提供了一种有效的方法。     

差异柠檬酸杆菌GXW-1 β-葡萄糖苷酶的酶学性质及分子改造

【目的】筛选鉴定1株产β-葡萄糖苷酶的菌株,克隆、表达该菌株中的β-葡萄糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质并进行分子改造。【方法】在自然界中采集土样,筛选到1株具有β-葡萄糖苷酶活性的菌株,对野生菌进行16S rDNA鉴定,比对分析Gen Bank数据库中与野生菌同属的β-葡萄糖苷酶基因序列,设计简并引物PCR扩增基因保守区;设计引物扩增目的基因,以pQE30为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌中进行诱导表达;采用镍亲和层析对重组酶进行纯化,研究其酶学性质;采用易错PCR和定点随机突变相结合的方法对野生型β-葡萄糖苷酶进行分子改造。【结果】一个来自于差异柠檬酸杆菌GXW-1的β-葡萄糖苷酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达。酶学性质研究结果表明该β-葡萄糖苷酶CBGL的最适温度为45°C,最适p H为6.0,V_(max)值是(0.1704±0.0073)μmol/(mg·min),K_(cat)值为(0.2380±0.0102)/s。CBGL能水解α-pNPG、甜菊苷、黄豆苷和染料木苷。对野生酶进行分子改造,获得V_(max)是野生酶2.54倍的突变体W147F。【结论】CBGL不仅具有β-1,4-糖苷键水解能力,还可能具有一定的α-糖苷键水解酶活性。此外,CBGL还能够水解天然底物甜菊苷、黄豆苷和染料木苷。这些特性表明该β-葡萄糖苷酶在理论研究及在工业中有一定的应用价值。