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1.
巴西固氮螺菌 Yu62 draTG 基因启动子区域的核苷酸序列及其功能分析 总被引:2,自引:0,他引:2
对巴西固氮螺菌draTG上游区域进行了全序列分析,结果表明该区域除了编码部分nifH基因外(nifH与draTG转录方向相反),不编码任何其它已知的基因。但在该区域发现了一些可能的调控序列,它们包括上游激活序列(UAS)、下游启动子组份(DPE)和富A+T区。这说明:nifH与draT间的区域可能主要起调控功能而非编码功能;dra操纵元的启动子很可能是RpoN-依赖型。用pAF300做载体,构建了 相似文献
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用PCR方法克隆了巴西固氮螺菌Yu62nifH的启动子片段,DNA序列分析表明菌株Yu62与标准菌株Sp7之间的DNA序列差异很小。利用启动子探针质粒载体pCB182,构建了3个不同的nifH1acZ转录融合质粒,在大肠杆菌中分别测定肺炎克氏杆菌NifA对它们的转录激活作用。结果表明巴西固氮螺菌nifH启动子的转录是依赖于NifA的,缺失了上游激活序列的启动子不能被NifA激活转录,肺炎克氏杆菌N 相似文献
3.
粪产碱菌nifH启动子与LacZ的融合基因构建及其表达调控 总被引:2,自引:0,他引:2
在pRK290载体上将粪产碱菌固氮酶基因nifH的启动子与报告基因LacZ相融合,获得表达载体pSK6,并转导到粪产碱菌A1501菌株中,探讨了铵和氧对该启动子的表达调控。结果表明,粪产碱菌nifH启动子仍受到铵和氧的调节。当铵浓度大于3mmol/L时,其表达水平大幅度下降,但铵浓度高达40mmol/L,仍有很低水平表达。而且,带有巴西固氮螺菌nifH:lacZ的粪产碱菌接合子在高铵条件下(40m 相似文献
4.
在pRK290载体上将粪产碱菌固氮酶基因nifH的启动子与报告基因LacZ相融合,获得表达载体pSK6,并转导到粪产碱菌A1501菌株中,探讨了铵和氧对该启动子的表达调控.结果表明,粪产碱菌nifH启动子仍受到铵和氧的调节.当铵浓度大于3mmol/L时,其表达水平大幅度下降,但铵浓度高达40mmol/L,仍有很低水平表达.而且,带有巴西固氮螺菌nifH∶lacZ的粪产碱菌接合子在高铵条件下(40mmol/L)也有低水平表达.此外,氧对粪产碱菌的nifH启动子有抑制作用,这在无铵条件下表现最为明显. 相似文献
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用PR方法克隆了巴西固氮螺菌Yu62 nifH的启动子片段,DNA序列分析表明菌株Yu62与标准菌株sp7之间的DNA序列差异很小。利用启动子探针质粒载体pcBl82,构建了3个不同的nifH::lacz转录融合质粒,在大肠杆菌中分别测定肺炎克氏杆菌NifA对它们的转录激活作用。结果表明巴西固氮螺菌nifH启动子的转录是依赖于NifA的,缺失了上游激活序列的启动子不能被NifA激活转录,肺炎克氏杆菌NifA对其自身nifH及巴西固氮螺菌nifH启动子的转录激活作用并无很大差异。 相似文献
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亚克隆了Rhodobacter sphaeroidesglnB启动子,以pMP220为载体构建成blnB-lacZ融合子。将glnB-lacZ、nifH-lacZ、nifA=lacZ分别导入R.sphaeroides谷氨酸合酶突变株gltB、gltD和野生型菌株中,分析了突变对固氮基因转录表达的影响,试验证明,在gltBD突变株中nifH的表达受阻遏,nifA表达水平很低。这证明glt基因的突变引 相似文献
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巴西固氮螺菌Yu62 draTG基因及其下游区域的定位诱变分析 总被引:3,自引:0,他引:3
用卡那霉素盒(Km-cassette)插入法,对巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)Yu62的draTG基因及其下游区域进行了诱变,并获得相应的突变株,研究表明draT变突株的固氮酶活性不再受铵抑制,而draG突变株在有铵时则丧失固氮酶活性,但当铵耗尽后却不能使像野生型菌株那样恢复活性,draTG下游区域突变株YZ4(突变位点距draG约2kb)在无氮及限铵条件下,其固氮酶 相似文献
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亚克隆了Rhodobacter sphaeroides glnB启动子,以pMP220 为载体构建成glnBlacZ融合子。将glnBlacZ、nifHlacZ、nifAlacZ分别导入R. sphaeroides 谷氨酸合酶突变株gltB- 、gltD- 和野生型菌株中,分析了突变对固氮基因转录表达的影响。试验证明,在gltBD 突变株中nifH 的表达受阻遏,nifA 表达水平很低。这证明glt 基因的突变引起固氮酶结构基因和固氮正调节基因的转录被阻遏,而glnB 基因的表达几乎不受影响。试验还测定了环境中结合态氮和有机酸等信号分子对glnB 和nifH 表达的影响,发现加入氨或谷氨酰胺后,nifH 的表达受到明显的阻遏作用,glnBlacZ的β半乳糖苷酶活性虽下降30 % 左右但不随结合态氮浓度升高而变化,仍维持在一个较高的水平。α酮戊二酸和丙酮酸对nifH 的表达有部分去阻遏作用而对glnB的表达无诱导作用 相似文献
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优化外源基因在大肠杆菌中表达的翻译起始率的策略和方法(英文) 总被引:1,自引:0,他引:1
mRNA的翻译起始区(TIR)的二级结构对翻译起始率有很大的影响。本文建立了一种改进外源基因在大肠杆菌中翻译起始率的系统。以人分裂细胞核抗原(PCNA)基因为模型,将PCNA基因5′端编码区的114bp的顺序插入质粒pTZ19R中LacZ′的5′端构成融合基因。用定点突变法在PCNA的AUG的8位插入一个Shine/Dalgarno(SD)顺序GAGGT,再以合成的带部分随机序列寡核苷酸作引物,用PCR法在SD顺序两侧,即SD上游6个碱基和SD与AUG之间7个碱基,进行随机突变,它们与结构基因5′端序列形成各种可能的翻译起始区(TIR)二级结构。重组质粒转化大肠杆菌株JM109(DE3),5′PCNA-lacZ′mRNA可通过诱导表达T7RNA聚合酶而得到专一而有效的转录。通过在X-gal板上蓝色筛选以及随后的杂交鉴定,共得到269个5′PCNA-lacZ′融合质粒。从中选择8个不同蓝色的重组子进行β-gal活性测定,结果表明它们的酶活性相差在20倍以上。而RNA点杂交表明它们在转录水平无明显的差异。由此提示,通过此策略和方法能得到一个在大肠杆菌中能高效表达的翻译起始区。 相似文献
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以携带质粒pAM120(Ap^r,Tc^r/Tn916)的大肠杆菌(E.coli CG120)为供体菌株,与受体菌巴西固氮螺菌采用膜接合法进行接合转移,在选择平板上得到具较高频率的接合子(10^-5/每个供体菌,选择四环素抗性)。从846株四环素抗性接合子中进一步用奈氏法筛选得到氨分泌突变株3株。在无氮培养基上,其氨分泌量可达7.5 ̄14.0mmol/L。用乙炔还原法分析氨分泌突变株在不同浓度氮源 相似文献
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CS3纤毛抗原表达调控机理的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
CS3是某些肠毒素大肠杆菌菌体表面上的多聚物,它能使病原菌粘附于宿主的小肠上皮细胞上,是致病的重要因素.为了探索CS3菌毛抗原基因的表达调控机制,根据CS3亚基结构基因的核苷酸序列分析表明,在其翻译起始位点的上游存在着rbs位点及原核启动子的-10区和-35区DNA序列.采用基因重组技术将CS3结构基因上游120bp的DNA片段亚克隆进缺乏启动子而只含报告基因lacZ的质粒pCB267中.凝胶滞留和启动报告基因表达的实验证明了CS3亚基结构基因具有自身的启动子(Ps).将该启动子上游区域不同长度的核苷酸片段克隆进pCB267中,报告基因表达结果表明CS3结构基因的表达受其上游区域的抑制.核苷酸序列分析发现,在Ps-35区上游550bp和840bp处各存在一个富A-T簇.结合原核启动子的一般作用规律推知,CS3的表达可能受DNA结合蛋白型的正向调节因子的作用.用CFA/1菌毛抗原基因的正向调节基因cfaD对CS3基因进行的互补表达试验表明cfaD基因不仅可消除上游区对Ps的抑制,而且可大幅度地提高Ps的启动能力.在分析表达调控的基础上获得CS3重组高效表达.同时提出了其表达调控模型. 相似文献
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利用PCR技术行反义寡核苷酸体外抗丁型肝炎病毒基因组RNA中核酶的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
设计一对PCR引物,其中上游引物的5’端除目的基因外,还加T7RNA聚合酶启动子序列,以质粒(pSVLD3)为模板,通过PCR扩增出带有T7RNA聚合酶启动子序列的139bp的cDNA片段,它含有丁型肝炎病毒(HDV)基因组RNA中核酶(Ribozyme)区的cDNA该核酶具有自身裂解功能,经测序发现该cDNA有2个碱基变异,以此PCR产物为模板,通过T7RNA聚合酶,转录出核酶的前体,并观察到其 相似文献
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用启动子探针质粒pIJ486从麦迪霉素产生菌(S.mycarofaciens)中克隆到1个具启动功能的HindIII-HindIII2.0kb片段,含该片段的重组质粒p4H2转化子在MM基本培养基上对卡那霉素(Km)抗性可达500μg/ml以上。亚克隆缺失分析结果表明,该片段不同部分的缺失对启动活性有不同程度的影响,说明它具有较复杂的转录调控机制。DNA序列分析结果显示,该片段含有1984个核苷酸,其G+C%为47.7%,不存在典型的链霉菌的可读框;进一步的分析发现,其650bp、1150bp和1500bp区域分别与麦迪霉素酮基还原酶基因等链霉菌基因的启动子序列具有同源性;在520-570bp区域与大肠杆菌tRNA基因上游激活序列(UAS)有较好的同源性,提示链霉菌中可能存在可增强基因转录的DNA元件。 相似文献
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利用PHO81lacZ融合基因,对它的上游进行缺失分析,发现有两个区域对PHO81基因的表达是必需的:-401~-289bp和-1012~-801bp。比较PHO81和PHO5,PHO84基因上游,未发现有较高同源性的序列存在,但在-401~-289bp区域有PHO4蛋白结合位点的核心序列5′CACGTG/T3′,以及CACGTG/T两侧富含A/T的序列(可能是PHO2结合位点)。推测-401~-289bp包含了PHO81的上游激活序列(UAS),-1012~-801bp可能起增强的作用。用酵母总蛋白质对-1012~-801bp进行凝胶阻抑电泳分析,证明有未知的蛋白因子结合在这个区域。 相似文献
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用PCR方法从人胎盘cDNA 中获得编码胰岛素受体α亚基中结合胰岛素的相对独立的结构域L1、L2以及人工设计的L1-(Ala)10-L2的基因,克隆入含T7噬菌体RNA聚合酶启动子的表达质粒pET-3a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达成功。DNA测序、氨基酸组成分析以及蛋白质N端测序证明所表达的蛋白质正确。经过包涵体的分离、洗涤、溶解和纯化,得到了纯的变性状态受体的胰岛素高亲 相似文献
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大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG-2100的构建及应用 总被引:3,自引:0,他引:3
利用分子生物学方法,构建了大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG-2100,研究了编码日本血吸虫中国大陆株谷胱甘肽S-转移酶抗原基因在卡介苗中的表达,以含人结核杆菌热休克蛋白70基因全长序列的质粒pMT-70为模板,扩增出hsp70启动子,测序选出无错配的启动子,将其定向克隆入E.coli-Mycobactrium穿梭质粒pBCG-2000中,构建成E.coli-Mycobacterium穿梭表达 相似文献
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人低密度脂蛋白(LDL)受体基因cDNA和氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)及polyA信号序列被克隆进行PGEM4载体的T7噬菌避动子下游,构建成质粒PT7LDLR和PT7CAT,两个重组质粒转化CHO细胞,PCR和CAT酶实验显示:两个基因被T7噬菌体启动子所启动,结果证实真核生物RNA聚合酶能够识别T7启动子,转录外源基因,常用的含有T7启动子的质粒可同时的核生物和真核生物的表达载体。 相似文献