广东地区两种兰花病毒病害的分子鉴定及检测

根据已报道的建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)基因组核苷酸序列,在其cp基因上下游设计PCR引物.CyMV预计扩增产物784bp,ORSV预计扩增产物604bp.以采集自广东省顺德的墨兰和文心兰表现病毒病症状的病株叶组织总RNA为模板,进行RT-PCR扩增.对预期大小的5个扩增产物进行克隆和测序,结果表明,来源于不同兰种或同一兰种不同兰场的病样CyMV引物扩增产物核苷酸序列存在少量差异,但均与世界各地的CyMV分离物cp基因高度同源;而来源于不同兰种的病样ORSV引物扩增产物核苷酸序列完全相同,与世界各地的ORSV分离物cp基因高度同源.因此可将侵染广东兰花的两种病毒鉴定为CyMV和ORSV.混合上述两种病毒的 PCR引物,采用双重RT-PCR扩增,对采自广东顺德23个兰场共153份样品进行病毒检测,76份(49.7%)检出CyMV,52份(34.0%)检出ORSV,2份(1.3%)同时检出CyMV和ORSV.     

建兰花哇病毒运动蛋白基因克隆及序列分析

从建兰花叶病毒（CyMV）石斛兰分离物中提取病毒RNA,用反转录－－聚合酶链式反就（RT－PCR）方法获得约500bp的运动蛋白基因片段,插入pGEM-T载体克隆并测序,序列分析表明,该基因片数由474个核苷酸组成,和CyMV美国夏威夷分离物、新加坡分离物相应基因核甘酸序列分别具有97.8%同源性;根据核酸序列推导该片断含有3个部分重叠的开放阅读框架（ORF）,分别编码14kD、12kD和10kD的多肽。     

复合感染建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的兰花超微结构观察及病原物快速鉴定

通过负染和超薄切片观察到蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)病叶中线状和杆状病毒颗粒。组织切片观察,同时发现两种病毒粒子的典型聚集体:线状粒子的带状聚集体,粒子多层排列,层间呈一定角度或螺旋相叠;杆状粒子的平行、角层状或螺旋型排列聚集体。二种病毒聚集体均出现于薄壁细胞、细胞间隙和输导组织细胞中。感病细胞中叶绿体发育不全;线粒体增生、肿胀甚至空化;细胞核膨大、空化。进一步的多重RT-PCR与病毒核酸序列分析,同时扩增到建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)的外壳蛋白基因,与GenBank已知分离物同源性分别达到98%和99%-100%。从细胞和分子层面揭示了蝴蝶兰受CymMV和ORSV复合侵染并可能导致严重病症的事实,分析和明确了感病兰细胞超微结构的病变特征以及田间病症发生的细胞病理学依据。     

四种广普性植物病毒高效mPCR检测方法的建立

本研究建立了能同时检测出烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯Y病毒(PVY)的多重RT-PCR体系。TMV、CMV、PVX、PVY是四种广普性植物病毒,寄主范围广泛,并且常常发生复合侵染。本研究以上述四种病毒的CP基因部分序列设计引物,以反转录的cDNA为模板,建立多重RT-PCR反应体系,分别扩增出211～417bp的不同长度的基因片断,并通过序列测定来确认扩增序列的特异性。将反转录合成的cDNA进行浓度稀释,来对多重RT-PCR与单重RT-PCR的灵敏度进行比较,结果证明,多重RT-PCR体系能够同时快速检测这四种病毒,并且有很高的灵敏度。     

一种新香菇病毒基因组部分cDNA序列及病毒RT-PCR检测

本文报道从香菇菌丝体和子实体中分离到一种大小约20nm×(100-200)nm的杆形病毒颗粒,病毒基因组是大小约8.0kb的dsRNA。对病毒基因组部分cDNA序列进行克隆,完成1457bp的核酸序列测定(Accession No:GQ372842),该序列含1个不完整ORF,编码314个氨基酸残基,推测为病毒RNA聚合酶部分序列。病毒基因组部分cDNA序列与GenBank中的已知核酸序列无明显同源性,表明它可能是新发现食用真菌病毒。为了对实验室和野外的香菇病毒进行快速检测,我们根据得到的病毒基因组部分cDNA序列设计特异性引物,建立了一种方便、有效检测香菇病毒的RT-PCR方法,对感染病毒异常菌丝体中的病毒成功地进行了检测。     

猪7种腹泻相关病毒的临床检测及猪嵴病毒的遗传进化分析

为了解引起猪腹泻疫病的病毒性病原种类及感染现状,本研究首先针对7种报道较少但可引起猪腹泻的病毒性病原建立了多重RT-PCR检测方法,包括猪捷申病毒(PTV)、猪萨佩罗病毒(PSV)、猪丁型冠状病毒(PDCo V)、猪嵴病毒(PKV)、猪札幌病毒(PSa V)、猪星状病毒(PAst V)和猪环曲病毒(PTo V)。利用该方法对419份临床腹泻粪便样品进行筛检,结果显示PKV检出率最高,阳性率达26.98%–45.79%;PKV和其他病原混合感染率达9.52%–18.54%。基于PKV的高检出率及其可能在猪腹泻疾病中发挥的作用,本试验进一步选取3个PKV阳性样品进行全基因组序列测定及遗传进化分析。结果表明,这3个阳性样品PKV均归属于猪嵴病毒属,且与其他动物嵴病毒遗传距离较远,分别标记为CM-PKV、JS-PKV和PD-PKV;它们的全基因组同源性为88.1%–89.1%;CM-PKV与2013年报道的中国株JS-02a-CHN/2013同源性最高,而JS-PKV和PD-PKV则与2008年报道的匈牙利株K-30-HUN/2008/HUN同源性最高。表明上海不同地区猪群中存在的PKV有明显的遗传差异,但毒株遗传特性的差异与其致病力的相关性需进一步研究。本研究为深入了解PKV的流行现状及探讨其在猪腹泻疫情中的作用提供了参考。     

棉铃虫核型多角体病毒几丁质酶基因及杆状病毒 几丁质酶基因的分子进化

用PCR方法扩增了棉铃虫Helicoverpa armigera单粒包埋型核型多角体病毒（HaSNPV）几丁质酶基因,测定了基因编码区的核苷酸全序列。基因编码区全长1.713 bp,可编码570个氨基酸残基组成的多肽,预计分子量为63.6 kD。将所推导的HaSNPV几丁质酶氨基酸序列与其它已知杆状病毒几丁质酶氨基酸序列进行联配比较,结果表明HaSNPV 与谷实夜蛾H.zea单粒包埋型核型多角体病毒（HzSNPV）的氨基酸序列非常相似,同源性高达90.7%,与苜蓿丫纹夜蛾Autographa californica多粒包埋型核型多角体病毒（AcMNPV）、家蚕Bombyx mori核型多角体病毒（BmNPV）、美国白蛾Hyphantria cunea核型多角体病毒（HcNPV）、舞毒蛾Lymantria dispar多粒包埋型核型多角体病毒（LdMNPV）、黄杉毒蛾Orgyia pseudotsugata多粒包埋型核型多角体病毒（OpMNPV）和云杉卷叶蛾Choristoneura fumiferana核型多角体病毒（CfMNPV）氨基酸序列同源性分别为64.4%、64.9%、64.2%、62.9%、66.2%和61.5%。根据氨基酸序列用PC＼GENE程序绘制已知杆状病毒几丁质酶的分子系统树,并与杆状病毒中最为保守的多角体蛋白基因系统树作了比较,结果表明几丁质酶基因和多角体蛋白基因的进化速率是不尽相同的。     

南方养殖草鱼呼肠孤病毒的分子特性比较及双重PCR检测方法的建立

本实验室2009年从广东省患典型出血病的养殖草鱼中分离到一株具强致病性的水生呼肠孤病毒GCRV-GD108株,该毒株具有11个节段双链RNA。全基因组序列分析显示与草鱼呼肠孤病毒GCRV及水生呼肠孤病毒属其它已知种存在较大的分子差异。本研究进一步检测了广东、福建、湖南等地草鱼出血病流行毒株的分子特性。根据已克隆到的GCRV-GD108株11个节段序列分别设计合成特异引物,从各地收集患出血病草鱼,提取组织总RNA,RT-PCR检测。结果表明各检测样品均可扩增到特异性条带,而GCRV标准株则无特异条带;同时根据GCRV标准株序列合成的特异引物进行扩增,GCRV标准株有特异性条带,而各检测样品则均无带。测序结果显示各样品间相应片段序列的同源性很高(95.2%~99.4%),与GCRV-GD108的相应序列也具高同源性(95.0%~99.8%),说明检测样品与GCRV-GD108株具有相似的分子特性,均与GCRV及水生呼肠孤病毒属的其它种存在较大差异。本研究结果提示我国养殖草鱼出血病病毒存在着不同的分子类型,GCRV-GD108株在南方具有一定的代表性,在病害防控上尤其是疫苗研制与使用上应予关注。此外,从上述引物中筛选出适合于双重PCR的引物对,建立了双重PCR检测方法,可在一次PCR反应中鉴别所感染的病毒属于GCRV或GCRV-GD108株。     

侵染厦门地区蝴蝶兰的建兰花叶病毒的分子鉴定

根据已公布的建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus,CyMV）序列,设计特异引物,利用RT-PCR方法分离克隆了厦门蝴蝶兰CyMV的病毒分离物,获得完整的CP基因序列,并与来自中国和其它亚洲国家的病毒分离物进行同源性分析,其同源性均达96%以上。系统进化树分析结果表明,厦门的病毒分离物与中国台湾、韩国、印度的分离物成簇,而福建、北京和新加坡的病毒分离物独立形成另一簇。     

齿兰环斑病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析

齿兰环斑病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析刘志昕潘俊松邵寒霜郑学勤（中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室,海南儋州５７１７３７）关键词齿兰环斑病毒,外壳蛋白基因,序列分析兰花受病毒危害相当严重,齿兰环斑病毒（Ｏｄｏｎｔｏｇｌｏｓｕｍｒｉｎｇｓ...     

应用斑点法检测植物病毒的研究

应用斑点法检测了病叶粗汁液中的芜菁花叶病毒(TuMV)、大豆花叶病毒(sMV)和黄瓜花叶病毒(CMV),病叶粗汁液可被检测的最大稀释度分别为1:5120、1:2560和1:1280。提纯的大豆花叶病毒和黄瓜花叶病毒可检测的最低限量分别为1.7ng和1.2ng。以牛血清白蛋白、吐温和聚乙烯吡咯啉酮作封闭液,均可获得满意的结果。应用斑点法检测芜菁花叶病毒和大豆花叶病毒时,其抗血清稀释1:500倍可获得满意效果,稀释2000倍仍可用于检测。     

单抗免疫斑点法和组织印迹法检测侵染蝴蝶兰的建兰花叶病毒

应用抗建兰花叶病毒(CymMV)的单克隆抗体, 建立了快速检测蝴蝶兰病样的免疫斑点法(Dot-ELISA)和组织印迹法(Tissue blot-ELISA)。CymMV单抗稀释8000倍时, Dot-ELISA可检出病毒粗汁液的最大稀释度为1:10240; Tissue blot-ELISA中样品1次平切后1~5次印迹与Dot-ELISA样品1:80稀释结果相当, 6~8次印迹与Dot-ELISA 1:320稀释结果相当, 前8次印迹均可以得到满意的检测效果。Tissue blot-ELISA的灵敏度略低     

Argonaute 5 family proteins play crucial roles in the defence against Cymbidium mosaic virus and Odontoglossum ringspot virus in Phalaenopsis aphrodite subsp. formosana

The orchid industry faces severe threats from diseases caused by viruses. Argonaute proteins (AGOs) have been shown to be the major components in the antiviral defence systems through RNA silencing in many model plants. However, the roles of AGOs in orchids against viral infections have not been analysed comprehensively. In this study, Phalaenopsis aphrodite subsp. formosana was chosen as the representative to analyse the AGOs (PaAGOs) involved in the defence against two major viruses of orchids, Cymbidium mosaic virus (CymMV) and Odontoglossum ringspot virus (ORSV). A total of 11 PaAGOs were identified from the expression profile analyses of these PaAGOs in P. aphrodite subsp. formosana singly or doubly infected with CymMV and/or ORSV. PaAGO5b was found to be the only one highly induced. Results from overexpression of individual PaAGO5 family genes revealed that PaAGO5a and PaAGO5b play central roles in the antiviral defence mechanisms of P. aphrodite subsp. formosana. Furthermore, a virus-induced gene silencing vector based on Foxtail mosaic virus was developed to corroborate the function of PaAGO5s. The results confirmed their importance in the defences against CymMV and ORSV. Our findings may provide useful information for the breeding of traits for resistance or tolerance to CymMV or ORSV infections in Phalaenopsis orchids.     

齿兰环斑病毒的鉴定及其抗血清的制备与应用

根据病毒生物学特性、粒体形态和血清学性质等初步确定从在厦门地区种植的表现为褪绿、褐色坏死斑症状的卡特兰(Cattleya)病株上分离的一个病毒分离物为齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV).通过摩擦接种6科27种(或品种)指示植物,结果其中4科8种(或品种)表现症状,与烟草花叶病毒不同;理化性质试验表明稀释限点为5×10-5,致死温度为92℃～94℃,体外存活期超过3个月.提纯病毒为长约300nm,宽约18nm杆状粒体.SDS-PAGE电泳分析表明其外壳蛋白分子量约为17kDa.该分离物与ORSV抗血清具有强阳性反应、而与TMV抗血清反应微弱,认为该病毒为ORSV分离物.用纯化病毒免疫家兔,成功地制备出特异性抗血清,并通过Dot-ELISA法对厦门地区种植的兰花病株进行了检测研究.     

Genetic Diversities of Cymbidium mosaic virus and Odontoglossum ringspot virus Isolates Based on the Coat Protein Genes from Orchids in Guangdong Province,China

Orchids are some of the most important ornamental flowers. Cymbidium mosaic virus (CymMV) and Odontoglossum ringspot virus (ORSV) are the most prevalent and economically important viruses affecting orchids in China. In this study, 20 CymMV and 28 ORSV isolates were selected for genetic diversity analysis. The CymMV isolates shared 84.6–100% and 89.5–100% identities of coat protein (CP) at the nucleotide (nt) and amino acid (aa) levels, respectively. The identities of ORSV isolates were 96.4–100% (nt) and 92.5–99.4% (aa). The CP genes of CymMV were found to have genetic diversity, and the CP genes of ORSV were genetically conservative. These results can aid in designing effective disease‐control strategies.