棉铃虫血淋巴酚氧化酶活性的微量测定

昆虫血淋巴黑化的形成由激活酚氧化酶原的级联系统所引发 ,酚氧化酶在昆虫体液免疫中起着重要作用。用抗凝剂从棉铃虫血淋巴中分离获得了血浆及完整的血细胞 ,以L DOPA为底物 ,牛胰蛋白酶为激活剂 ,测定了血浆及血细胞裂解液中酚氧化酶及酚氧化酶原的活性。结果表明 ,血浆及血细胞中两者都有一定量的分布。这一昆虫血淋巴酚氧化酶的微量测定方法 ,所需样品量少 ,耗时短 ,简便易行。     

黄粉虫幼虫体壁硬化过程中酚氧化酶活性的变化

为研究酚氧化酶(PO)在昆虫蜕皮过程中的功能和作用, 采用微量测定法研究了黄粉虫Tenebrio molitor体壁硬化过程中血淋巴和表皮中的PO活性变化。结果表明：初蜕皮幼虫血淋巴中PO活性较高, 但随着体壁的不断黑化与硬化, 其活性呈现下降趋势, 在3～4 h内达到最低点, 而后PO活性逐渐上升, 7 h左右活性上升至最高, 并接近于正常幼虫的水平;在刚蜕完皮后的1 h内, 体壁中 PO活性基本无变化, 但随后即开始下降, 3 h左右降到最低点, 然后开始回升, 6~7 h左右恢复到正常水平, 并趋于稳定;以L-DOPA为底物, 通过双倒数曲线作图法求得黄粉虫血淋巴PO的Km＝1.176 mmol/L, 体壁PO的Km＝0.881 mmol/L, 表明体壁PO与底物L-DOPA的亲和力要高于血淋巴PO。研究表明两种来源的酚氧化酶均参与了黄粉虫幼虫的体壁硬化过程, 但在作用方式及与底物的亲和力方面存在差异。     

根虫瘟霉不同菌株对小菜蛾幼虫血淋巴酚氧化酶原的激活作用

在对小菜蛾Plutella xylostella幼虫血淋巴酚氧化酶原的存在部位及免疫激活作用特点研究的基础上,比较了根虫瘟霉Zoophthora radicans不同菌株对酚氧化酶原激活系统的免疫激化及防御作用的差异。研究发现, 酚氧化酶原主要位于小菜蛾幼虫血细胞膜及血细胞裂解液中,极少存在于血浆中。在免疫激活剂昆布多糖存在下,分别测得小菜蛾幼虫血细胞碎片、血细胞裂解液和血浆的酚氧化酶活性为26.80 U,16.68 U和2.53 U。酚氧化酶原显著地受血浆和昆布多糖同时存在的激活,但两者单独存在时对酚氧化酶原的激活作用较弱。根虫瘟霉菌丝裂解液对酚氧化酶原有不同程度的激活作用,其激活作用在有血浆存在时显著增强,其酚氧化酶活性可提高2.9～3.4倍。各菌株间对酚氧化酶原的激活作用则以ARSEF1342菌株最强,ARSEF2699和F99101菌株次之,ARSEF1100菌株最弱。被激活的酚氧化酶可粘附于根虫瘟霉菌丝上并能产生黑化反应,各菌株间酚氧化酶粘附于ARSEF1342菌株的能力最强,粘附于ARSEF2699和F99101菌株的次之,粘附于ARSEF1100菌株的最弱。但酚氧化酶粘附于昆布多糖的能力显著强于各虫霉菌株,表明各菌株在一定程度上能逃避寄主的免疫识别;各菌株激活酚氧化酶原及酚氧化酶粘附于菌株强弱,与对小菜蛾毒力呈负相关性,表明高毒力菌株具有易逃避寄主免疫识别的趋向。     

两种色型黄粉虫酚氧化酶原的cDNA克隆、生物信息学分析及表达水平检测

酚氧化酶是黑色素合成和昆虫免疫的关键酶, 通常以无活性的酚氧化酶原形式存在。为给黄粉虫Tenebrio molitor遗传分化和免疫防御研究提供参考, 本研究采用PCR和RACE技术克隆了黄、 黑两种色型黄粉虫幼虫的酚氧化酶原基因Tm-ppo, 对其cDNA序列及其推导的氨基酸序列进行生物信息学分析, 采用实时荧光定量PCR检测其在两种色型黄粉虫不同发育阶段mRNA表达水平上的动态变化。结果表明： 从黄、 黑两种色型黄粉虫幼虫中克隆出的两个Tm-ppo cDNA序列全长均为2 199 bp, 碱基序列一致性为99%, 包含一个2 055 bp的开放阅读框, 编码684个氨基酸, 它们的编码蛋白有3个氨基酸差异： 第176位（P→A）、 256位（V→A）和648位（I→M）。这两个基因分别被命名为Tm-ppo-1和Tm-ppo-2 （GenBank登录号分别为JX987235和JX987234）。 Tm-ppo-1和Tm-ppo-2编码的酚氧化酶原异构体蛋白（分别为Tm-PPO-1和Tm-PPO-2）存在一个可能的酚氧化酶原水解活化位点（R50~F51残基之间）和一个双铜结合中心（第196~239位残基和第344~411位残基）; 同时含有一个类似巯基酯区域的序列（第579~588位残基）及一个C 末端保守基序（第634~645位残基）; 但它们无氨基端疏水信号肽序列, 也不存在跨膜区域。Tm-PPO-1和Tm-PPO-2的二级结构由大量的α 螺旋、 β-折叠和无规则卷曲组成; 三级结构分为前导域（第16~66位残基）、 不相邻的功能域Ⅰ（第3~15位残基和第67~181位残基）、 功能域Ⅱ（第182~419位残基）和功能域Ⅲ（第420~679位残基）4部分。此外, Tm-ppo-1和Tm-ppo-2在黄、 黑两种色型黄粉虫的各发育期均有表达, 并且不同发育阶段的mRNA表达水平呈现明显的变化规律： 幼虫期﹥成虫期﹥蛹期。同时, 环境温度对Tm-ppo-1和Tm-ppo-2的mRNA表达具有显著影响： 与常温对照组（25~30℃）相比, 42℃暴露24 h和48 h的两种色型黄粉虫幼虫、 蛹和成虫的mRNA表达量明显下调。相同试验条件下, 黑色型黄粉虫幼虫和成虫的Tm-ppo-2 mRNA表达量明显高于黄色型幼虫和成虫的Tm-ppo-1 mRNA表达量, 但两种色型黄粉虫蛹的Tm-ppo异构体表达量无显著差异。本研究为进一步探讨黄粉虫的遗传分化和免疫防御提供了有益参考。     

温度对黄粉虫幼虫生长发育及体液免疫防御能力的影响

【目的】探究饲养温度对黄粉虫Tenebrio molitor幼虫生长发育和体液免疫防御的影响。【方法】测定了不同温度（18, 22, 26和30℃）下饲养的黄粉虫幼虫的发育历期、蛹重、化蛹率;采用抑制区分析法测定了不同温度下饲养的免疫（用生理盐水将大肠杆菌Escherichia coli配制成1×104个菌体/μL悬浮液,用微量注射器将其注入虫体腹部的背面,每头幼虫注射1 μL）和非免疫(注射生理盐水)黄粉虫幼虫血淋巴的抑菌和溶菌酶活性,通过分光光度法测定了其酚氧化酶活性。【结果】结果显示,黄粉虫幼虫发育历期随饲养温度的上升而明显缩短（P<0.0001）,而不同温度下蛹重（P=0.067）与化蛹率（P=0.869）差异不显著。免疫组黄粉虫幼虫血淋巴的抑菌、酚氧化酶和溶菌酶活性随饲养温度上升而降低：抑菌和酚氧化酶活性随温度变化差异极显著（P<0.0001）,溶菌酶活性差异显著（P=0.013）。【结论】本研究结果表明,温度对黄粉虫的生长发育和免疫防御具有较大的影响,低温下黄粉虫幼虫的发育历期延长,但其体液免疫防御能力明显增强。     

棉铃虫感染中华卵索线虫后血淋巴酚氧化酶活性的变化及其分离纯化

研究了中华卵索线虫Ovomermis sinensis感染棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫后宿主体内酚氧化酶活性的变化。研究结果表明,在感染后的第1天,中华卵索线虫的侵入引起酚氧化酶活性的增加,感染组酶活性是同期对照组的1.12倍; 但在随后的寄生期间,中华卵索线虫抑制了宿主的酚氧化酶活性,其中以第5天的抑制最为强烈： 同期对照组酶活性是感染组的1.52倍。对酚氧化酶进行了初步的分离纯化,纯化倍数为41.5倍,酶得率为12.7%,比活力为4 030.6 U/mg。     

昆虫酚氧化酶原激活酶研究

昆虫酚氧化酶原激活酶(Prophenoloxidase activating proteinase,PAP)是酚氧化酶原激活过程中的一个关键酶,是昆虫先天性体液免疫体系的重要组成部分。外界的免疫刺激能够诱导级联反应上游的蛋白对酚氧化酶原激活酶的前体进行剪切激活,而激活后的酚氧化酶原激活酶能够将无活性的酚氧化酶原剪切激活为有活性的酚氧化酶并最终生成细胞毒素物质来消灭外源物。本文综述了昆虫酚氧化酶原激活酶的结构与特性及其在酚氧化酶原级联激活系统中的作用机制,并探讨了寄生蜂对寄主昆虫酚氧化酶原激活酶的调控。     

管氏肿腿蜂毒液丝氨酸蛋白酶同源物SgSPH对寄主血淋巴酚氧化酶活性的影响

[目的]本研究旨在通过克隆表达管氏肿腿蜂Scleroderma guani毒液丝氨酸蛋白酶同源物(serine protease homologue,SPH)基因SgSPH,探索其编码的毒液蛋白对寄主血淋巴酚氧化酶活性的影响.[方法]利用RT-PCR技术克隆管氏肿腿蜂毒液SgSPH基因的开放阅读框(ORF),采用生物信...     

软体动物和甲壳动物酚氧化酶的研究进展

软体动物和甲壳动物的很多品种都是重要的经济养殖品种.随着养殖业集约化程度的提高,各种病害频繁发生,造成了巨大的经济损失.于是越来越多的人开始关注软体动物和甲壳动物的免疫防御系统,并对其进行研究.酚氧化酶(phenoloxidase,PO)是一种含铜的氧化酶,广泛存在于微生物、动物和植物体内.作为酚氧化酶原激活系统的重要一员,PO在无脊椎动物的先天免疫机制中起着重要的作用,有关其生物化学、免疫学和分子生物学特性的研究一直以来受到广泛关注,尤其在节肢动物中进展很快.作者对酚氧化酶在软体和甲壳动物中的功能、组织定位及表达、基因克隆和序列分析及其系统演化等几个方面的研究进展进行了综述.基因序列分析和系统进化树证据均表明,催化功能相同的软体动物酪氨酸酶与节肢动物PO的基因有较大差异.该结果对目前被广泛接受并使用的酪氨酸酶专门用于哺乳类,酚氧化酶专门用于无脊椎动物的分类法提出了挑战.因此作者建议,将酚氧化酶专门用于节肢动物,酪氨酸酶用于软体动物等非节肢动物和脊椎动物.     

注射亲水性硅珠对棉铃虫血浆酚氧化酶活性的影响

昆虫通过细胞免疫和体液免疫的协同作用对入侵的异物做出防御反应。在不同时间向棉铃虫体内注射亲水性硅珠后,测定了血浆中酚氧化酶（PO）的活性,同时研究了不同抑制剂和激活剂对注射硅珠后的酚氧化酶活性的影响。结果表明,注射亲水性硅珠后,棉铃虫血浆中酚氧化酶的活性明显升高。分别以牛胰蛋白酶和昆布多糖作为酚氧化酶原（proPO）的激活剂,发现两者都可激活注射硅珠后血浆中的proPO。以牛胰蛋白酶激活时,随着注射硅珠后时间的延长,PO活性逐渐增高;而用昆布多糖激活后PO活性也明显升高,但注射硅珠后不同时间proPO被昆布多糖激活的情况基本相似。这些结果表明,在异物入侵后酚氧化酶原有很大程度的积累,并能被激活,协同细胞免疫抵御异物入侵。P-NPGB和PTU几乎能完全抑制酚氧化酶的活性。     

Examining costs of induced and constitutive immune investment in Tenebrio molitor

Central to the conceptual basis of ecological immunity is the notion that immune effector systems are costly to produce, run, and/or maintain. Using the mealworm beetle, Tenebrio molitor, as a model we investigated two aspects of the costs of innate immunity. We conducted an experiment designed to identify the cost of an induced immune response, and the cost of constitutive investment in immunity, as well as potential interactions. The immune traits under consideration were the encapsulation response and prophylactic cuticular melanization, which are mechanistically linked by the melanin-producing phenoloxidase cascade. If immunity is costly, we predicted reduced longevity and/or fecundity as a consequence of investment in either immune trait. We found a measurable longevity cost associated with producing an inducible immune response (encapsulation). In contrast to other studies, this cost was expressed under ad libitum feeding conditions. We found no measurable costs for constitutive investment in immunity (prophylactic investment in cuticular colour).     

利用黄粉虫分离土壤昆虫病原真菌

利用黄粉虫Tenebrio molitorL.作为寄主从土壤中诱感并分离昆虫病原真菌。结果显示,从吉林市的18个土样中分离出球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)和玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)。土样中的昆虫病原真菌检出率为77.78%。这表明利用黄粉虫分离土壤中的昆虫病原真菌是一种简单、有效的方法。     

泰山虫草对黄粉虫的侵染特性研究

报道了用泰山虫草分生孢子悬浮液接种活体黄粉虫,提取被侵染的黄粉虫体液,并测定不同侵染时间虫体液中酶活性的动态变化。结果表明:泰山虫草分生孢子能成功的侵染黄粉虫并长出子座;接种第2~4 d后即可导致黄粉虫体内活性发生不同程度的变化,说明黄粉虫具有独特的防御病原微生物的侵染机制。     

黄粉虫幼虫对硒的生物积累

在饲料中添加含硒化合物喂养黄粉虫Tenebrio molitor L.幼虫,测定幼虫硒含量、粪便硒含量和体重的变化,计算黄粉虫幼虫特定生长率及幼虫对硒生物积累系数,分析黄粉虫有效积累硒的条件。结果表明,饲料硒含量在15~20mg/kg时,幼虫硒含量明显提高,对硒的生物积累系数高于其它试验组水平,饲料硒含量过高,幼虫硒含量降低,正常生长受到抑制。黄粉虫幼虫特定生长率、取食量、排粪量、干物质含量随着饲料硒含量的增加而降低,死亡率、粪便硒含量随着饲料硒含量的增加而增大。饲料硒含量为15～20mg/kg时黄粉虫幼虫对硒的生物积累效果最好。     

黄粉虫对不同比例聚苯乙烯的取食效率研究

为探索黄粉虫Tenebrio molitor在降解聚苯乙烯过程中聚苯乙烯与麸皮的最佳配比,本研究将聚苯乙烯与麸皮按不同比例PS1(1:9),PS2(2:8),PS3(3:7),PS4(4:6),PS5(5:5),PS6(6:4),PS7(7:3),PS8(8:2),PS9(9:1),PS10(10:0),CK(0:10...     

The Site Specificity of Two Species of Gregarina in Tenebrio molitor Larvae

The site specificity of the apicomplexans Gregarina cuneata and Gregarina sleini , in larval Tenebrio molitor was investigated. Gregarina cuneata was found to inhabit the anteriormost region of the larval midgut, while G. steini was restricted to the posterior portion of the intestine. The site specificity of the pair was conserved in single and concurrent infections. Interspecific interactions do not seem to be presently responsible for the resource partitioning by the 2 gregarine species. Key words. Gregarina, site specificity, Tenebrio molitor.     

利用黄粉甲繁育管氏肿腿蜂:不同蜂虫比对繁育效果的影响

利用黄粉甲Tenebriomolitor的蛹作为中间寄主繁育管氏肿腿蜂Sclerodermaguani,测定了不同蜂虫比对发育历期、寄生率等几项评价繁育效果的重要指标。结果显示接蜂时不同蜂虫比对雌蜂产卵量和育出的子代蜂数量有较明显的影响,当蜂虫比为2∶1时这2项重要指标较为理想。综合比较了寄生率、寄生成功率、子代蜂的发育历期、出蜂数、性比等各项指标后认为,人工扩繁时采用2∶1的蜂虫比较为适宜。     

黄粉虫抗菌肽的提取及其生化特性的研究

【目的】测定黄粉虫Tenebrio molitor Linnaeus幼虫抗菌肽提取液的浓度、抑菌活性及其部分生化特性和凝血效应。【方法】本实验用浓度为1×108 CFU/m L大肠杆菌Escherichia coli诱导5龄黄粉虫幼虫,分别在诱导12、24、36、48、60和72 h后提取其中的抗菌肽,并用考马斯亮兰法测定抗菌肽粗提液蛋白的浓度,并用滤纸片法测定其抑菌活性,同时对其热稳定性、反复冻融稳定性、蛋白酶稳定性及不同p H对其活性的影响等生化特性及凝血效应进行了探究。【结果】经大肠杆菌诱导的黄粉虫抗菌肽粗提液的蛋白浓度均显著高于未诱导的黄粉虫组(P<0.01),且在诱导48 h时产生的抗菌肽提取液蛋白的浓度最高,产生的抑菌圈直径也显著高于未诱导的黄粉虫组(P<0.05),生化特性的测定结果显示,黄粉虫抗菌肽有较好的热稳定性、酶稳定性及酸碱稳定性,反复冻溶后对其抑菌活性影响不大,并且无凝血效应。【结论】大肠杆菌可以刺激黄粉虫的免疫系统,增加抗菌肽的表达量,使其产生浓度高、活性强的抗菌肽,且生化特性较稳定。本研究对黄粉虫抗菌肽作为绿色抗生素用于畜牧养殖业的进一步开发与利用提供了科学的理论依据。