人细胞差异表达基因cDNA消减杂交体系的建立

为克隆肺腺癌分化相关基因, 采用诱导分化与消减杂交相结合的策略, 建立了全反式维甲酸(RA)诱导前后人肺腺癌细胞系的cDNA消减文库, 得到124个cDNA消减克隆. 经加减法杂交差异筛选、DNA和RNA印迹、cDNA全序列测定和生物学功能分析, 分离到3个在人肺腺癌细胞系分化过程中由RA激活而特异表达的新的cDNA序列这一策略和技术路线适用于分离细胞中呈过量表达或表达抑制基因的cDNA克隆, 并具有反映细胞分化过程中基因表达动态变化特征和相对简便适用的特点.     

人巨细胞病毒IE基因调节子特异DNA结合蛋白cDNA的克隆和鉴定

本文利用人巨细胞病毒(HCMV)IE基因调节子中特异DNA片段作为探针,自人Hela细胞cDNA表达库中筛选并分离出两个编码能与该探针结合的DNA结合蛋白cDNA克隆(DJ-1和EH-2)。其中EH-2编码的蛋白具有明显的DNA结合序列特异性。比较DJ-1和EH-2克隆在HCMV戚染不容性和可容性畸胎瘤细胞中mRNA表达水平,未见明显差异。DJ-1和EH-2克隆可能涉及IE基因表达调控过程。     

流行性出血热病毒R22株cDNA克隆及其特异性鉴定

用家鼠型流行性出血热病毒R22株RNA,经polyA接尾,以Oligo-dT做引物,合成cDNA。用pUC18为载体转染E.coli Mc1061,建立cDNA克隆。再经菌落杂交,选择病毒特异性的5个阳性克隆制成缺口翻译探针,与病毒RNA3个片段进行反杂交,确定RNA片段的特异性。结果表明,3个克隆为中(M)片段的cDNA,另两个分别为大(L)和小(S)片段cDNA。核苷酸序列分析证明,克隆的DNA中含病毒特异的核苷酸序列。     

cDNA微阵列技术在植物功能基因组学研究中的应用

cDNA微阵列 (cDNAMicroarrays)技术是近年发展起来的分子生物学研究新型工具 ,以分子杂交为基本原理 ,在检测植物基因表达水平、研究基因表达图谱、特异基因检测以及发现新基因和分离差异表达基因等方面有着独特的优势 ,已成为植物功能基因组学研究的重要手段。     

用抑制差减杂交法分离和克隆梭梭幼苗受渗透胁迫诱导相关基因的cDNA片段

以Hoagland溶液培养的梭梭幼苗（H）为对照群体,甘露醇处理的梭梭幼苗（M）为目标群体,进行抑制差减杂交。用经过H cDNA差减的M cDNA构建了一个含有大约400个独立克隆的差减文库;采用差减前的H cDNA和M cDNA以及正向／反向差减杂交后的cDNA为模板标记探针,对随机挑取的100个重组质粒进行差示筛选,获得了21个阳性侯克隆,从这些阳性候选克隆中随机挑取了8个进行Northern blot分析。证实其中3个候选克隆代表了在M中特异表达或表达增强的基因,序列分析和同源性比较表明它们与逆境胁迫有关;而另外5个候选克隆无Northern杂交信号,推测它们为低丰度转录本。     

人肺腺癌细胞分化相关基因cDNAs的克隆

在用10^-5 mol/L全反式维甲酸(RA)诱导人肺腺癌细胞系GLC-82分化的基础上,以M13噬菌粒pSPORT1为载体,应用定向克隆技术,分别构建了未经RA诱导和RA诱导1d及4d细胞的3个cDNA文库.以含重组子的诱导文库单链DNA为靶标(Target)同未诱导文库的cDNA驱除子(Driver)进行消减杂交,富集RA特异性单链DNA,将富集的单链DNA回复为双链后转化感受态菌,建立细胞诱导分化过程中活化表达基因的cDNA消减文库,得到124个cDNA消减克隆.经同源性分析和与文库总cDNA作Southern印迹杂交,进而与RA诱导前后细胞的RNA作Northern印迹杂交,筛选出2个(RA5,RA28)诱导后呈早期瞬时表达和1个(RA42)呈早期并持续表达的cDNA克隆,cDNA全长分别为1.8,1.5和0.7kb.序列测定及初步功能分析结果表明,RA5,RA28和RA42这3个首次报道的序列,可能是人肺腺癌细胞分化相关基因的cDNA克隆.     

用差异显示PCR技术克隆冬小麦春化设定cDNA克隆实验系统的建立

差异显示PCR技术是一种新近发展起来的在真核细胞中检测与克隆特异表达基因的手段。本文建立了用此技术克隆春化相关基因的研究系统,并提供了诸如总RNA的提取、污染DNA的去除、sscDNA的逆转录、PCR参数、扩增cDNA的电泳、特异cDNA的收集与重扩增等在方法上的细节。用这种技术分离了一个仅在春化20天这一特异时期表达的春化设定cDNA克隆VPC28。这些结果也适用于更加广泛的类似研究。     

用抑制差减杂交法分离和克隆梭梭幼苗受渗透胁迫诱导相关基因的cDNA片段

以Hoagland溶液培养的梭梭幼苗(H)为对照群体,甘露醇处理的梭梭幼苗(M)为目标群体,进行抑制差减杂交.用经过H cDNA差减的M cDNA构建了一个含有大约400个独立克隆的差减文库;采用差减前的H cDNA和M cDNA以及正向/反向差减杂交后的cDNA为模板标记探针,对随机挑取的100个重组质粒进行差示筛选,获得了21个阳性候选克隆.从这些阳性候选克隆中随机挑取了8个进行Northern blot分析,证实其中3个候选克隆代表了在M中特异表达或表达增强的基因,序列分析和同源性比较表明它们与逆境胁迫有关;而另外5个候选克隆无Northem杂交信号,推测它们为低丰度转录本.     

大鼠再生肝中表达上调基因的筛选与鉴定

采用新发展的抑制差减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）在基因组水平筛选再生肝中高表达基因。大鼠肝部分切除后24h的再生杆组织来源的cDNA作为受检者（tester）,正常肝组织的cDNA作为驱动者（driver）,进行差减杂交,获得一900个克隆的差减杂交库,随后对差减克隆进行了差异筛选,得到50个在再生肝中高表达的强阳性克隆,序列测定和同源比较表明这些克隆代表了37个基因,其中13个与已报道的肝再生相关的基因同源,15个为忆知基因但首次发现与肝再生相关,9个为新的基因（EST）已被GenBank收录。制备了标准化RNA点杂交膜,通过对上述部分基因的RNA点杂交分析,不但确认了这些基因在再生肝中表达水平的升高,同时发现它们在肝再生过程中有不同的表达模式。实验结果提示这些基因在肝再生过程中具有重要功能。     

大鼠正加速度高耐力相关基因的分离

 为从基因水平上揭示正加速度 (+Gz)高耐力产生机理及寻找 +Gz高耐力相关功能性蛋白 ,利用抑制消减杂交技术分离 +Gz高耐力相关基因 .雄性SD大鼠在离心机上处理后 ,选取耐受终点在高、低两个极端的动物 ,立即取全脑 ,分离mRNA .以高耐力者为Tester ,低耐力者为Driver,利用抑制消减杂交技术进行 +Gz耐力处于高、低两个极端动物脑组织间基因表达差异显示 ,获得 +Gz高耐力大鼠脑组织相关cDNA .以高、低耐力大鼠脑组织mRNA来源的cDNA为探针 ,对获得的cDNA克隆进行斑点杂交 .分别以杂交筛选出的阳性克隆为探针 ,对高、低耐力大鼠脑组织总RNA进行Northern杂交分析 .两次杂交结果均选择高耐力组杂交信号是低耐力组 3倍以上的cDNA克隆 .经过斑点杂交筛选 ,从大鼠脑组织中获得了 6 7个在 +Gz高耐力大鼠脑组织中上调表达的cDNA克隆 .Northern杂交分析发现 ,钙离子 钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱβ亚基 (Camk2b)和一未知基因在 +Gz高耐力大鼠脑组织中的表达量增加 .结果提示 ,+Gz耐力处于高、低两个极端的大鼠脑组织基因表达有明显差异 ,这些差异表达的基因很可能与 +Gz高耐力的产生有关 ,且钙离子 钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱβ亚基和一未知基因是初步获得的与 +Gz高耐力的产生特异相关的基因     

辣椒温和斑点病毒(PMMV)外壳蛋白基因的克隆和序列测定

从本院分离的辣椒温和斑点病毒株系PMMV-QD中提取RNA.根据已有报道的外壳蛋白(CP)自行设计引物P1、P2,用RT-PCR扩增PMMV-QD的CP基因的cDNA,插入pMD 18-T载体,转化感受态受体菌XL1-B1ue,以蓝白菌落筛选转化株,用PCR检测白色菌落,确认获得了含cDNA的阳性重组子.序列测定和比较的结果表明该片段确含有PMMV的CP基因编码区,此种cDNA与国外报道的PMMV病毒株系核苷酸序列的同源性达到97.7%.     

小麦苗期冷驯化相关cDNA的克隆

以中国春小麦幼苗为材料,利用改进的mRNA差异显示方法和银染技术,对不同低温驯化诱导表达的差异基因进行分离,共得到cDNA差异片段60条.经Reverse Northern验证,检出阳性表达片段8条,克隆并测序,分别命名为TIGW1~TIGW8.其中,TIGW2和TIGW3可能与抗冻蛋白积累、低温诱导蛋白的生成或低温信号的感受与传递有关;TIGW1、TIGW6、TIGW8中具有ACGT应答元件,TIGW3含有CAACA应答元件,说明可能获得了冷诱导基因的启动子序列.     

鸡IFN-γcDNA的克隆及测序

应用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）技术,参照图外报道的鸡γ干扰素（CHIFN-γ）cDNA全基因序列,利用自行设计合成的一对引物,从ConA诱导培养的SPF鸡外周血淋巴细胞中扩增出CHIFN-γcDNA基因,并与PMD18-T载体连接,构建了CHIFN-γ基因重组体,经DNA序列测定,确认为CHIFN-γ基因,为进一步表达CHIFN-γ奠定了基础。     

小麦RCA的cDNA片断克隆和反义表达载体的构建

目的:试图分离和克隆小麦Rubisco活化酶cDNA片断并构建反义表达载体。方法:采用RT-PCR技术克隆cDNA片断,对序列用Blast等软件进行分析,并将该片断反向连接于植物表达载体pROK2的CaMV35S启动子下游,构建反义表达载体。结果:获得了小麦Rubisco活化酶(RCA)的cDNA片断(GenBank注册号:DQ984669);小麦RCA的cDNA片断推导的氨基酸序列与其它植物的RCA氨基酸序列高度同源。序列比较表明,用本实验所得的cDNA序列推导出的氨基酸序列与GenBank登录的大麦(AAA63163)、南极银须草(AAP83928)、水稻(AAX95414)、玉米(AAC97932)、拟南芥(NP 850321)和烟草(CAA78703)等的RCA序列的同源性分别为97%、95%、88%、83%、82%和82%;分析表明,该序列为新的小麦RCAα的cDNA序列;通过选择和引入合适的酶切位点进行载体构建,构建了小麦RCA的cDNA反义表达载体pR-AntiRCA。结论:构建成了小麦RCA的cDNA反义表达载体。     

鹅源新城疫病毒拯救体系的建立

参照GenBank上公布的鹅源新城疫病毒ZJI株全序列,设计8对引物,经RT-PCR法从尿囊液中扩增目的片段后,分别克隆进pCR2.1载体,将Ⅰ～Ⅶ7对引物的扩增片段依次亚克隆到TVT7R转录载体中,构建了含NDV全基因组cDNA的转录载体(pNDVZJI),将Ⅴ、Ⅵ和Ⅷ3对引物的扩增片段分别克隆进pCR2.1载体,并亚克隆到表达质粒pCI-neo上,构建了L基因的真核表达载体(pCI-L),pNDVZJI、pCI-L与另外两个辅助表达质粒(pCI-NP和pCI-P)共转染BSR-T7/5细胞,成功拯救出了具有血凝性的鹅源新城疫病毒,ZJI株鹅源新城疫病毒的成功拯救为后续相关研究工作的开展打下了基础。     

山羊卵泡刺激素β-亚基cDNA的分子克隆与序列分析

从新屠宰的母山羊脑垂体中提取总RNA,反转录获得cDNA,以皮cDNA为模板用PCR法扩增目的片段,获得长为390bp的山羊卵泡刺激素β－亚基cNDA片段,与预期的目的片段大小一致。将它克隆至pMD-18-T-Verctor中,随机挑选2个阳性重组子进行测序,并将测序结果与绵羊,牛等多种哺乳动物该基因的核苷酸序列及相应氨基酸序列进行比较。结果表明,山羊的卵泡刺激素β－亚基因与绵羊的该基因氨基酸同源性最高,达99．9％,只有1个氨基酸不同,与牛,猪,马,虎,人,大鼠的该基因氨基酸同源性分别为92.5%,91.7%,89.9%,89.1%,86.0%,83.7%。从核苷酸同源性来看,山羊的卵泡刺激素β－亚基因与绵羊该基因的同源性了高,达98％;与牛,猪,马,虎,人,大鼠的核苷酸同源性为95％,90％,90％,88％,86％,84％。结果表明,尽管β－亚基基因有种的特异性,但在哺乳动物中其同源性还是很高的。     

两种茶树β-葡萄糖苷酶基因cDNA在原核中表达的研究

采用原核表达系统pET-32a( )载体和BL21trxB(DE3)菌株对两条茶树β-葡萄糖苷酶基因cDNA(GluⅠ和GluⅡ)进行了表达,研究了不同诱导时间、不同诱导温度对两个茶树β-葡萄糖苷酶表达量的影响并测定了两者的活性。表达分析结果表明,诱导6h、25℃时,GluⅠ在总蛋白中所占比例最高;诱导6h、37℃时,GluⅡ在总蛋白中所占比例最高,活性测定结果表明,两种表达蛋白均具有正常的β-葡萄糖苷酶活性,在相同的测定条件下,GluⅡ活性(0.310±0.03U·ml-1)比GluⅠ(0.234±0.03U·ml-1)活性更高。     

人类β-1,4-半乳糖苷转移酶基因家族中1个新成员的克隆与表达谱分析

应用从EST出发克隆基因家族新成员的策略 ,在人类睾丸组织cDNA文库中分离出 1个新的全长cDNA片段 ,它编码的蛋白产物与 (UDP 半乳糖苷 :N 乙酰基葡萄糖胺 )半乳糖苷转移酶 (GalT)有较高的同源度 .分析表明 ,在其 2 173bp的序列中含有 1个长 10 3 2bp的开放读框 ,编码 3 44个氨基酸 .基于该基因与半乳糖苷转移酶基因家族各成员的同源关系 ,尤其是与G .gallus β 1,4 半乳糖苷转移酶Ⅰ型(CKⅠ )的关系密切 ,这个基因的蛋白产物被命名为人类 β 1,4 半乳糖苷转移酶同源蛋白Ⅰ型 .Northern杂交发现它在被检测的人体 16种组织中均有表达 ,但丰度各异 .通过与含人单条染色体的人 /啮齿类的杂种细胞DNA进行Southern杂交 ,证明该基因位于 3号染色体上 .     

EST的应用现状与前景

综述EST（Expressed sequence tag）的用途,应用现状及其发展前景。     

表达人溶菌酶基因牛乳腺特异表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺酪蛋白基因的1.8kb和1.1kb的5'和3'调控 序列,克隆入TA载体.经测序鉴定后,利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体 pcDNA3(切除CMV启动子),并插入人溶菌酶基因(hLYZ)的cDNA, 构建成牛乳腺特异表达 载体.获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定、PCR验证等表明,成功克隆了酪蛋白基因5 '和3'的调控区,并成功构建了表达人溶菌酶基因的牛乳腺特异表达载体.