结核分枝杆菌H37Ra株HspX蛋白的表达条件优化、纯化和鉴定

以结核分枝杆菌H37Ra菌株基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增获得HspX基因,通过DNA无缝克隆技术将其克隆至pET28a质粒中,构建重组表达质粒pET28a-HspX。将pET28a-HspX转化至大肠埃希菌表达菌株BL21(DE3),采用不同温度、IPTG浓度和时间诱导HspX蛋白表达。使用Ni-IDA亲和层析柱纯化目的HspX蛋白,透析去除咪唑,通过Western blot检测HspX抗原特异性。最终确定表达重组蛋白HspX的最佳诱导条件为：诱导温度37℃、IPTG浓度0.2 mmol/L、诱导时间8 h。结果表明,获得了高纯度和被特异性识别的可溶性Hsp X蛋白,为未来Hsp X蛋白用于结核病诊断试剂和疫苗奠定基础。     

艰难梭菌毒素A原核表达及重组蛋白纯化

目的构建艰难梭菌(Clostridium difficile,C.difficile)毒素A羧基末端原核表达载体,优化诱导表达条件及纯化重组蛋白。方法利用聚合酶链式反应扩增C.difficile毒素A羧基末端基因序列,并将此序列转入pET-28b载体,构建pET-28b-tcdA重组表达载体,并将表达载体转化到BL21(DE3)感受态大肠埃希菌细胞中,分别在不同条件下进行诱导表达,获得最佳诱导表达条件后进行大量表达,最后用Ni柱对重组蛋白进行亲和纯化,得到纯化后的重组蛋白。结果成功构建了pET-28b-tcdA重组表达载体,其重组蛋白表达最佳诱导条件:菌液吸光度值取0.6、温度取25℃、IPTG终浓度取1.0mmol/L、诱导时间取10h。蛋白纯化咪唑磷酸盐洗脱液最佳浓度取200mmol/L。结论成功构建pET-28b-tcdA重组表达载体,在大肠埃希菌BL21(DE3)中可以有效表达,并获得高浓度重组蛋白,为进一步制备TcdA适配子奠定了一定实验室基础。     

家蝇抗菌肽AMPs17蛋白原核表达条件的优化及其抗真菌活性检测

目的:优化AMPs17重组蛋白的原核表达条件,分析重组蛋白的抗真菌活性。方法:比较不同的诱导温度(25℃、28℃、30℃、32℃、34℃)、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度(0. 025mmol/L、0. 05mmol/L、0. 1mmol/L、0. 3mmol/L、0. 5mmol/L、0. 8mmol/L、1. 0mmol/L)和诱导时间(12h、15h、18h、21h、24h)对AMPs17重组蛋白表达量的影响,筛选AMPs17重组蛋白的最佳表达条件;采用镍离子金属螯合剂亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,SDS-PAGE和ImageJ图像分析系统对表达结果进行分析,Western blot对AMPs17重组蛋白进行鉴定,高效液相色谱分析重组蛋白的纯度,微量液体稀释法及菌落计数法检测其抗真菌活性。结果:在诱导温度为32℃、IPTG浓度为0. 05mmol/L的条件下诱导培养15h,AMPs17重组蛋白的表达量最高且最为稳定;HPLC色谱仪分析显示AMPs17重组蛋白纯度可达到90%以上;优化后的AMPs17重组蛋白能有效抑制白色念珠菌的生长。结论:优化了家蝇抗菌肽AMPs17的诱导表达条件,获得了高表达、稳定且具有抗真菌活性的蛋白质,为后续抗菌机制及应用研究提供一定的实验基础。     

小鼠HSP60基因的克隆与表达条件的优化

目的:克隆小鼠热休克蛋白60(HSP60)基因,在大肠杆菌中表达,并进一步对其表达条件进行优化.方法:采用RTPCR技术克隆出非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠HSP60的cDNA序列.构建重组表达载体pET28a- HSP60,以其转化大肠杆菌感受态细胞BL21( DE3),在不同的菌体浓度、不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、不同诱导时间以及不同温度条件下诱导,检测重组蛋白的表达情况.结果:获得一个含有1 721bp的cDNA的片段,重组蛋白HSP60在E.coli BL -21 (DE3)中的最佳表达条件是菌体密度A600nm为0.6,诱导时间为5h,诱导物(IPTG)浓度为4mmol/L,诱导温度为35℃,重组蛋白大小约为60kD.结论:成功克隆了小鼠HSP60基因,并在大肠杆菌中获得高效表达,为重组蛋白的分离纯化及进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

Pfu酶原核的高效表达及其活性分析

目的:在大肠杆菌中高效表达重组Pfu酶.方法:将pfu基因构建于载体pET28a上,重组质粒pET28a-pfu转化DH5α,获得了含pET28a-pfu重组表达菌株.在重组菌株OD600为0.2时,经终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达10～12 h后,菌体超声波破壁后,80℃条件下热变性30 min去除部分杂蛋白;粗酶液再经Ni离子亲和层析进一步纯化.结果:获得了高纯度的重组Pfu酶,利用该酶成功扩增出目的基因片段.结论:纯化的Pfu酶具有较高的活性,比活性为62 500 U/mg,该研究表达的重组酶完全可以替代商用Pfu酶.     

L-谷氨酸氧化酶的克隆表达、纯化及酶学性质研究

为提高微生物产L-谷氨酸氧化酶水平,将Streptomyces sp.X-119-6的L-谷氨酸氧化酶基因(LGOX)与表达载体pET28a连接,导入E.coli BL21(DE3),实现LGOX的高效表达.采用HisTrapTM FF亲和层析柱对重组L-谷氨酸氧化酶进行纯化,并对纯酶的酶学性质进行了研究.结果表明:在IPTG终浓度为0.4 mmol/L下,30℃诱导6h,可以获得比酶活为1.1 U/mg的粗酶液;重组酶的最适反应温度和pH分别为37℃和5.O;km值为2.12 mmol/L,Vmax为1.06μmol/min·mg,对L-谷氨酸具有专一性;具有良好的应用前景.     

Thymidine Kinase 1(TK1)重组蛋白的表达、纯化及鉴定

为获得具有免疫原性的TK1重组蛋白。通过构建能够表达TK1蛋白的重组菌BL21-pET32a-TK1,采用大肠杆菌pET32a表达系统,优化IPTG浓度、诱导温度、诱导时间使BL21-pET32a-TK1重组菌表达目的蛋白的作用条件最佳。表达产物用镍离子亲和层析纯化获得TK1蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行检测。用TK1重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,检测蛋白质免疫原性。实验结果表明,成功构建能够表达TK1蛋白的重组菌BL21-pET32aTK1,在37℃条件下,IPTG浓度为0.2mmol/L、诱导6h时重组蛋白TK1表达量最高。镍离子亲和层析梯度洗脱在80mmol/L咪唑条件下TK1蛋白纯度最大,灰度分析为87.3%,浓缩后蛋白质浓度为5.96mg/ml。用该蛋白质制备杂交瘤共获得10株稳定分泌TK1抗体的阳性单克隆细胞株,表明TK1重组蛋白具有较好的免疫原性。成功获得可溶性、抗原活性高、免疫原性强的TK1重组蛋白,为肿瘤科学及临床应用研究提供物质支撑。     

响应面法优化脯氨酸羟化酶转化反应工艺条件

通过优化脯氨酸羟化酶表达条件和转化反应条件,提高其转化反应效率。采用单因素法筛选脯氨酸羟化酶的最佳诱导温度、诱导剂浓度和转化反应条件,并采用响应面法预测影响转化反应各因素的最佳条件。结果显示,经过筛选和验证,蛋白表达最适诱导温度为28℃,IPTG浓度为0.2 mmol/L;转化反应最佳条件为:120 mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(pH 6.6)、1.5% Nonidet P-40、200 mmol/L L-脯氨酸、200 mmol/L α-酮戊二酸,6 mmol/L L-抗坏血酸、6.0 mmol/L 硫酸亚铁,最适反应温度为27℃,振荡速率为152 r/min。在最佳条件下,转化反应进行48 h后产物反式-4-羟基-L-脯氨酸的转化率可达100%,为合成反式-4-羟基-L-脯氨酸奠定了坚实的实验基础。     

重组人α降钙素基因相关肽在大肠杆菌中表达条件的优化

为提高人α降钙素基因相关肽(bαCGRP)在大肠杆菌中的表达量,研究了本室构建的pET-hαCGRP重组质粒在E.coli BL21trxB(DE3)pKysS宿主菌中的表达条件.经SDS-PAGE分析和YLN2000凝胶影像分析结果表明,重组菌以LB为培养基,氨苄青霉素浓度为50 mg/L,开始诱导时的菌体密度为OD600=0.6～0.8,所加IPTG的浓度为0.75mmol/L,37℃摇床180±5r/min振荡诱导培养4 h时,可获得高效表达的hαCGRP融合蛋白.重组蛋白的最高表达量占菌体总蛋白的70%～80%;它主要以可溶性形式存在,为下一步纯化工作提供了方便.     

美洲大蠊抗菌肽AMPPA13的表达及纯化

[目的]预测美洲大蠊新的抗菌肽基因,构建原核表达体系并纯化表达产物。[方法]通过生物信息学方法,预测分析出潜在的美洲大蠊抗菌肽。构建pET32a重组质粒,优化诱导表达条件,通过亲和层析,分子筛等手段获得纯化的抗菌肽,并进行Western Blot鉴定。[结果]预测出美洲大蠊新的抗菌肽基因AMPPA13,成功构建重组质粒pET32aAMPPA13。优化诱导表达条件得最佳IPTG浓度为0.1 mmol/L,最佳诱导时间为4 h,最佳诱导温度为37℃。纯化后AMPPA13浓度为268μg/m L。[结论]克隆出美洲大蠊抗菌肽基因,并成功构建原核表达体系,得到1 m L纯化的AMPPA13,经Western Blot鉴定,表达产物正确。     

β-synuclein蛋白原核表达载体的构建与表达

目的构建人β-synuclein基因的原核表达载体,分析其在大肠杆菌中的表达。方法从人脑组织中提取总RNA,用RT-PCR方法获得人β-synuclein基因,克隆至pCUm-T载体中,PCR筛选阳性克隆并测序。将酶切后的目的片段克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21。IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达。结果 RT-PCR扩增出人β-synuclein基因,将其亚克隆至pGEX-6P-1构建成重组表达质粒,并在BL21中表达了β-synuclein蛋白。结论成功构建人β-synuclein的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达了人β-synuclein融合蛋白,为进一步研究β-synuclein在帕金森病中的作用奠定了良好的基础。     

The regulatory elements of araBAD operon,contrary to lac‐based expression systems,afford hypersynthesis of murine,and human interferons in Escherichia coli

The overexpression of four different interferons, i.e., murine interferon α1 and human interferons α1, α8, and α21 was challenged in Escherichia coli. Synthetic genes coding for these interferons were designed, assembled, and cloned into the vector pET9a (using the NdeI and BamHI sites), placing interferon expression under the control of phage T7 promoter. Despite an intensive screening for optimal culture conditions, no interferon synthesis was observed using overexpression systems based on the regulatory elements of lac operon (e.g., in E. coli BL21DE3). On the contrary, high levels of interferon expression were detected in E. coli BL21AI, which chromosome contains the gene coding for phage T7 RNA polymerase under the control of the araBAD promoter. To analyze the reasons of this striking difference, the molecular events associated with the lack of interferon expression in E. coli BL21DE3 were studied, and murine interferon α1 was chosen as a model system. Surprisingly, it was observed that this interferon represses the synthesis of T7 RNA polymerase in E. coli BL21DE3 and, in particular, the expression of lac operon. In fact, by determining β‐galactosidase activity in E. coli BL21AI, a significantly lower LacZ activity was observed in cells induced to interferon synthesis. © 2009 American Institute of Chemical Engineers Biotechnol. Prog., 2009     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

基因工程手段提高磷脂酰丝氨酸合成酶活性的研究

为了提高目的蛋白磷脂酰丝氨酸合成酶(PSS)的表达,使用rTaq酶从E coli K12总DNA中PCR扩增获得磷脂酰丝氨酸合成酶基因片段,将其重组于高效表达载体pET28b质粒,转入相应表达菌株进行表达,收集菌体超声破碎获得含PSS的粗酶液,使用两相反应体系进行生物转化,HPLC-ELSD手段进行酶活检测。结果显示,重组菌株中PSS的酶活力比对照有所提高,同时获得酶活力提高的突变基因pssE210G。将突变基因重组于更高效的表达载体pBAD-MCS,转入相应宿主菌株表达。结果显示E.coli TOP10(pBAD-MCS-pss)表达的酶活性明显优于E.coli BL21(pET28b-pss)中表达的酶活性。以上实验结果表明,将目的基因重组于高效表达质粒有助于提高酶活力;组合到不同的表达质粒,酶活提高程度不同;磷脂酰丝氨酸合成酶基因第73位氨基酸发生突变,对其酶结构和酶活力有直接的影响。     

小鼠canstatin C端片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为了构建小鼠canstatinC端片段的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。以小鼠肝脏组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠canstatinC端片段(mCan-C)基因,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将mCan-C基因定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建表达载体pET／mCan-C,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果表明,小鼠canstatinC端片段的cDNA长度为399bp,含有1个终止密码,编码132个氨基酸,与已知的人canstatinC端片段氨基酸的同源性为61％。IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E．coliBL21中表达,表达量约占菌体总蛋白量的28％,重组蛋白主要以包涵体形式存在。首次克隆了小鼠canstatinC端片段的cDNA,IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E．coliBL21中高效表达。小鼠canstatinC端片段的cDNA序列已收入GenBank,接受号为:AY502947。     

Expression and purification of the SsbB protein from Streptococcus pneumoniae

The Gram positive bacterium, Streptococcus pneumoniae, has two genes, designated ssbA and ssbB, which are predicted to encode single-stranded DNA binding proteins (SSB proteins). We have shown previously that the SsbA protein is similar in size and in biochemical properties to the well-characterized SSB protein from Escherichia coli. The SsbB protein, in contrast, is a smaller protein and has no counterpart in E. coli. This report describes the development of an expression system and purification procedure for the SsbB protein. The ssbB gene was amplified from genomic S. pneumoniae DNA and cloned into the E. coli expression vector, pET21a. Although, we had shown previously that the SsbA protein is strongly expressed from pET21a in the E. coli strain BL21(DE3)pLysS, no expression of the SsbB protein was detected in these cells. However, the SsbB protein was strongly expressed from pET21a in the Rosetta(DE3)pLysS strain, a derivative of BL21(DE3)pLysS which supplies the tRNAs for six codons that are used infrequently in E. coli. The differential expression of the two SSB proteins in the parent BL21(DE3)pLysS strain was apparently due to the presence of two rare codons in the ssbB gene sequence that are not present in the ssbA sequence. Using the Rosetta(DE3)pLysS/pETssbB expression system, a protocol was developed in which the SsbB protein was purified to apparent homogeneity. DNA binding assays confirmed that the purified SsbB protein had single-stranded DNA binding activity. The expression and purification procedures reported here will facilitate further investigations into the biological role of the SsbB protein.     

肺炎球菌表面蛋白的克隆表达与免疫原性研究

从肺炎球菌YF05中扩增了肺炎球菌表面蛋白A（PspA）和肺炎球菌表面黏附素A（PsaA）基因,以pET27b(+)为载体构建了重组表达质粒的表达系统后,转化入大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的75％,结果显示：表达的PspA蛋白和PsaA蛋白,分子量分别约为75kDa和37kDa。成功表达的重组蛋白具有较强的免疫活性和交叉免疫效果。     

IL-1023-57-PE40分泌表达的初步研究

将IL-1023-57-PE40基因与pelB信号肽融合置于pET-20b构建分泌表达质粒pET-20b-IL-1023-57-PE40,然后将pET-20b-IL-1023-57-PE40分别转化至BL21(DE3),BL21(DE3)pLysS,Rosetta(DE3),E·coliK12TB1,ER2566中。无论是在37℃或是在26℃,亦或在培养基中添加葡萄糖的情况下,IPTG诱导后,IL-1023-57-PE40蛋白只在BL21(DE3)pLysS菌中以可溶分泌形式表达,其中以37℃时培养基中不添加葡萄糖表达量为最高,占菌体蛋白总量的15%,说明蛋白的分泌表达与菌种的选择有关。表达产物经免疫印记检测可被抗PE40的特异抗体识别。通过质粒稳定性实验证明,pET-20b-IL-1023-57-PE40在BL21(DE3)中不稳定,导致蛋白的不表达,在Rosetta(DE3)BL21,E·coliK12TB1,ER2566中稳定但不表达,因此,以Rosetta(DE3)BL21为例,通过SDS-PAGE、DNAStar和ANThewin蛋白分析软件对本室构建的几种PE重组毒素进行比较分析,我们发现:并不是所有PE重组毒素融合信号肽序列后,就能分泌表达,PE重组毒素分泌表达还可能与导向部分的性质有关。     

沙门菌外膜蛋白D的原核表达及多克隆抗体制备

目的:在大肠杆菌中表达沙门菌外膜蛋白(OMP)D,纯化后制备兔抗OMPD抗体。方法:用PCR方法从鼠伤寒沙门菌中扩增出ompD基因,并插入融合表达载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET28a(+)-ompD;以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,经IPTG诱导目的蛋白表达,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化;以表达的OMPD蛋白免疫家兔,制备抗OMPD的多克隆抗体并进行鉴定。结果:扩增了ompD基因,测序证实正确后亚克隆于表达载体pET-28a(+)中,经PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子质量为40×103的目的蛋白并进行纯化;纯化的OMPD免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶10000以上,且具有良好的特异性。结论:构建ompD基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗OMPD抗体,效价及特异性均良好,为进一步制备肠黏膜高亲和力疫苗奠定了基础。