甘蓝型油菜BnCOP1基因的原核表达和纯化

COP1蛋白是植物光信号调节网络中介导光信号转导的一个关键因子,对植物生长发育起重要调控作用.通过RT-PCR方法从甘蓝型油菜中克隆BnCOP1基因编码区全长序列,并将其连接到冷诱导原核表达载体pCold TF上,构建原核重组表达载体pCold TF/BnCOP1,转化大肠杆菌BL(21)star.通过IPTG法低温诱导表达融合蛋白.结果表明,重组质粒在大肠杆菌中获得高效表达,融合蛋白分子质量约为128 kD,融合蛋白在上清液和包涵体中均有表达,可溶性部分经亲和层析纯化和Western blotting检测证实获得了高纯度的重组蛋白,这些结果为进一步研究油菜BnCOP1的结构和功能奠定了基础.     

小鼠cofilin2蛋白的原核表达及纯化

[目的]构建小鼠cofilin2原核表达载体并纯化表达产物。[方法]以胚胎期小鼠心脏组织的c DNA为模板PCR扩增cofilin2基因,经酶切连接表达载体PGEX-4T-1后转化入大肠杆菌E. coli BL21感受态细胞中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达及优化,利用SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝R-250进行染色,检测GST-cofilin2的表达情况。通过谷胱甘肽树脂(Glutathione Resin)亲和层析进行纯化,最后通过Western Blot进行验证。[结果]PCR成功扩增cofilin2基因,双酶切及测序结果表明p GEX-4T-1-cofilin2原核表达载体构建成功,SDS-PAGE鉴定表明,在22℃、200μmol/L的IPTG能诱导出大量可溶性的GST-cofilin2蛋白,分子量为43 k Da。Western Blot验证得到纯化的GST-cofilin2。[结论]成功构建小鼠cofilin2原核表达载体,纯化得到的重组小鼠cofilin2蛋白可用于后续的生物学研究。     

重组人磷脂爬行酶1的原核表达及纯化

目的:建立重组人磷脂爬行酶1(hPLSCR1)原核表达及纯化工艺。方法:PCR扩增hPLSCR1编码基因并连接到原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达,Western印迹鉴定所表达蛋白;优化表达条件后,Ni2+柱亲和层析纯化重组蛋白。结果:构建了pET-28a-PLSCR1重组质粒,诱导表达后,经SDS-PAGE分析目的蛋白的表达量达32%,Ni2+金属螯合法纯化目的蛋白后纯度达到95%以上,Western印迹验证了融合蛋白的特异性。结论:建立了高效稳定的His-PLSCR1表达体系,获得大规模生产His-PLSCR1的分离纯化工艺,为进一步研究其蛋白功能奠定了基础。     

剪接因子1N端1-320氨基酸片段的原核表达及纯化

目的:通过扩增剪接因子1(SF1)的N端1-320氨基酸(aa)片段对应的cDNA,构建His融合蛋白原核表达质粒pET-28a(+)/SF1(1-320aa),在大肠杆菌中诱导表达并进行亲和纯化。方法:PCR扩增SF1的1-320 aa片段对应的cDNA,扩增产物和载体pET-28a(+)经酶切回收,连接载体和目的片段,获得重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,挑取克隆、酶切鉴定、测序,将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和West-ern印迹分析蛋白表达情况,亲和纯化His-SF1(1-320aa)。结果:SF1片段以正确的读框插入pET-28a(+),IPTG可以诱导大肠杆菌表达重组蛋白,SDS-PAGE和Western印迹证实得到相对分子质量约为40×103的蛋白,亲和纯化得到高纯度蛋白质。结论:构建了His融合蛋白原核表达质粒pET-28a(+)/SF1(1-320aa),并获得His-SF1(1-320aa)融合蛋白,为进一步研究SF1和U2AF65之间的相互作用及对剪接体形成的影响提供了基础。     

重组人FOXL2基因的原核表达和纯化研究

目的通过pET32a（＋）原核表达载体,表达重组人叉头框蛋白L2（human forkhead box12,FOXL21）。并且进行纯化和鉴定。方法从正常人血液中提取基因组DNA,利用PCR扩增FOXL21目的基因片段,构建FOXL21原核表达重组质粒[pET32a（＋）-FOXL21]并转化E．coli的BL21（DE3）菌株,IPTG诱导重组蛋白表达,经HisTrap FF亲和层析柱纯化,再通过SDS—PAGE和Western印迹鉴定。结果成功克隆到大小为1131bp的人源FOXL21基因片段并准确插入表达载体pET32a（＋）,0．1mmol／LIPTG诱导转化菌8h可表达大量的FOXL21蛋白,并可经HisTrap FF柱亲和层析得到高度纯化。结论成功获得纯化的66kD重组人FOXL21蛋白,为后续进行FOXL21蛋白的功能研究奠定了基础。     

人抗酶抑制因子-1的克隆与原核表达

目的:克隆人抗酶抑制因子-1(ornithine decarboxylase antizyme inhibitor-1,OAZI-1)cDNA,建立在大肠杆菌中原核表达并纯化人OAZI-1蛋白的实验技术。方法:巢式RT-PCR法从人A549总RNA中扩增人OAZI-1 cDNA并构建pET-28a/OAZI-1原核表达质粒。该质粒转化大肠杆菌原核表达菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达。诱导表达出的重组蛋白用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。SDS-PAGE和Western法检测重组OAZI-1蛋白的表达和纯化。结果:成功克隆出编码全长人OAZI-1的cDNA序列,并构建出原核表达质粒pET-28a/OAZI-1。DNA测序分析,重组质粒中的OAZI-1 cDNA无突变,与6×His标签框架对接正确。重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中后,可用IPTG诱导表达出重组OAZI-1蛋白,该重组蛋白可用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。结论:成功建立了人抗酶抑制因子的原核表达和纯化的实验方法,为后续OAZI-1的功能研究奠定了基础。     

重组斑马鱼 p8蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼p8蛋白并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼p8蛋白基因编码区,连接到带有6×His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-p8并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达;优化表达条件后用Ni^2＋柱纯化重组蛋白。结果：构建了pET-28a-p8重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的12．8×10^3。结论：获得了斑马鱼p8融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

重组斑马鱼CD36蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼CD36蛋白胞外区38～432氨基酸残基段并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼CD36蛋白的基因编码区,连接到带有6~His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET28a-CD36,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达,优化表达条件后用Ni^2＋柱进行纯化。结果：构建了pET28a-CD36重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的46．8×10^3。结论：获得了斑马鱼CD36融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

DREB1A 转录因子蛋白的原核表达

DREB1A是DREB转录因子的一员,它们都含有一段与DNA结合的保守区域,由58个氨基酸组成,称为EREBP/AP2结构域(EREBP/AP2 domain)。一个DREB转录因子可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因表达。从拟南芥中克隆了DREB1A转录因子基因,成功构建了DREB1A基因的原核表达载体,转化E.coliBL21(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导表达获得了DREB1A蛋白,但以包涵体形式存在。为以后深入研究DREB转录因子与DRE顺式作用元件相互作用的具体机制奠定了基础。     

GST-Ets-1融合蛋白的表达与纯化

[目的]旨在原核表达Ets-1基因,纯化获得GST-Ets-1融合蛋白。[方法]以SD大鼠脑垂体cDNA为模板,利用PCR扩增含有Bam HI和Not I酶切位点的Ets-1基因;然后将其克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中,将正确的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3);用IPTG诱导表达,再利用Magne GST particles亲和纯化GST-Ets-1融合蛋白;最后通过Western blot鉴定此融合蛋白。[结果]成功构建pGEX-4T-1-Ets-1原核表达载体;30℃条件下,0.2 mmol/L的IPTG能诱导出大量的可溶性GST-Ets-1蛋白;经Magne GST particles纯化的GST-Ets-1蛋白可被识别ETS-1的抗体特异识别。[结论]纯化的GST-Ets-1蛋白可用于后续的生物学研究。     

重组鼠干细胞因子的原核表达、纯化及生物活性初步分析

目的：研制重组鼠干细胞因子（rmSCF）,并检测其体外生物学活性。方法：提取BALB/c孕龄鼠总RNA,通过RT-PCR扩增mSCF的编码基因,将其克隆至原核表达载体pBV220,转化大肠杆菌DH5α,将重组菌株接种至氨苄青霉素抗性的LB培养基中,扩大培养至5L发酵罐中,42℃诱导表达,经包涵体复性、DEAE-SepharoseFF和Phenyle-SepharoseHP层析纯化,制备rmSCF。结果：构建了pBV220-mSCF原核表达载体,在大肠杆菌中表达了rmSCF,纯化后的rmSCF对类原巨核细胞白血病细胞系的UT-7细胞有明显的刺激作用,比活为1.0×106U/mg。结论：获得了纯度大于95%的rmSCF,将进一步展开其在小鼠体内的药效学研究。     

小鼠精囊自身抗原的原核表达和纯化

目的：在原核细胞中表达小鼠精囊自身抗原（SVA）,并对表达产物进行鉴定和纯化。方法：提取小鼠附睾组织总RNA,RT-PCR获得SVA的cDNA,设计并合成特异引物序列,进一步扩增出不含信号肽的SVA编码序列,连入原核表达载体pET28a中,经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达,Western印迹分析表达产物His-SVA,采用Ni-NTA纯化融合蛋白His-SVA。结果：原核表达获得融合6个组氨酸的SVA,用抗His单克隆抗体进行Western印迹鉴定,检测到相对分子质量约18×10^3的目的蛋白,与理论值一致;经Ni-NTA纯化获得较高纯度的His-SVA融合蛋白。结论：获得了在大肠杆菌中表达的小鼠附睾蛋白SVA,为后续研究其对小鼠生殖的影响奠定了基础。     

人SCYL1-BP1重组蛋白的原核表达及分离纯化鉴定

前期研究结果发现,SCYL1-BP1具有细胞周期调控功能,同时具有肿瘤抑制因子的特性。目的:采用基因工程技术,构建SCYL1-BP1的大肠杆菌重组表达菌株,以获得足够量的高纯度目的蛋白,为后面进行一系列药理学检测及新药安全性测试奠定基础。方法:利用从人胎脑cDNA文库中克隆得到SCYL1-BP1基因克隆为模板,经PCR扩增,通过酶切位点克隆到新型原核表达载体pET-28b-SUMO上,转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,摸索优化表达条件,表达产物经Ni柱进行亲和层析纯化,后再进行SDS-PAGE和Western blot等分析鉴定。结果:成功构建了SCYL1-BP1的原核表达工程菌BL21(DE3)/pET-28b-SUMO-SCYL1BP1。SDS-PAGE和Western blot检验结果表明,诱导表达的融合蛋白His6-SUMO-SCYL1BP1的分子量约为65 kDa,主要以可溶的形式存在,且能被His标签抗体和SCYL1-BP1单克隆抗体特异性识别。结论:原核表达并纯化了人SCYL1-BP1融合蛋白,为其后续功能研究及性质实验奠定基础。     

重组人胰岛素样生长因子1的原核可溶性表达及活性鉴定

目的:原核可溶性表达人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)并进行生物活性测定。方法:PCR扩增hIGF-1核酸序列,克隆至融合表达载体pET-DsbC中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,对融合蛋白DsbC-hIGF-1分别进行酶切、Western印迹和生物活性测定。结果:融合蛋白DsbC-hIGF-1在原核系统内经IPTG诱导,主要以可溶性形式表达,其表达量占菌体总蛋白量的30%～35%,Western印迹和MTT法测定结果证明重组DsbC-hIGF-1蛋白具有较强的抗原活性和明显的促NIH/3T3细胞增殖作用。结论:融合蛋白DsbC-hIGF在大肠杆菌中以可溶性表达形式存在并具有类似天然hIGF-1的生物活性,这对进一步研究hIGF-1的结构和功能,开发相应的基因工程产品具有重要意义。     

扁桃CBF1转录因子的克隆及原核表达分析

为了探明CBF转录因子在扁桃中的抗寒分子机理,以新疆栽培扁桃‘矮丰’叶片为材料,通过PCR技术从扁桃基因组DNA中获得CBF1转录因子,命名为AF-Pd CBF1,Gen Bank登录号为KM245570。序列分析表明,该基因开放阅读框为729bp,编码242个氨基酸,推测蛋白质分子量为27.405 k D,并且该蛋白没有信号肽。进化树分析表明,AF-Pd CBF1与甜樱桃和中国梅的亲缘关系最近。将该基因片段连接到原核表达载体p ET-32a(+)中,构建融合表达质粒p ET-Pd CBF1,转化到E.coli Rosetta(DE3)中进行表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期大小一致,分子量大小约为47.8 k D。对重组蛋白的诱导条件进行优化后结果表明,重组蛋白p ET-Pd CBF1在IPTG浓度为0.2 mmol/L、诱导4 h时,其表达量最佳。试验结果可为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定基础。