ELISA测定中TMB显色体系的优化及其稳定性研究

通过对间接酶联免疫测定中显色体系的各影响因素的研究,确定了酶联免疫测定的最优显色体系为二甲基亚砜(DMSO)配制四甲基联苯胺(TMB)浓度为0.3 mg/mL的溶液为A液,pH5.5,0.2 mol/L磷酸氢二钠与0.1 mol/L柠檬酸缓冲液配制过氧化脲素浓度为0.74 mg/mL的溶液为B液,两者按一定比例混合后使用。试验结果表明,此显色体系在25-40℃内进行都可得到较为准确的结果,且A、B液混合后在室温下放置4 h仍可使用。A液及B液分别在4℃放置60 d后混合使用仍不影响测定结果。     

正交试验法优化菊花中总黄酮的提取工艺研究

研究了菊花中总黄酮的提取工艺。以总黄酮浸提量为考察指标,在单因素试验基础上,采用L_9(3~4)正交试验法,对乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取温度等条件进行优化,筛选出最优提取工艺。菊花中总黄酮物质的最优提取工艺为:乙醇体积分数70%,料液比1∶23 (w/v),提取时间140 min,提取温度70℃,提取次数2次,总黄酮的浸提量为28.11 mg/g。该工艺操作简单、重复性好,且对菊花中总黄酮有较高的提取量,可为工业生产提供一定的理论依据。     

正交试验优化天麻超声波提取工艺的研究

为了优化天麻素的提取工艺,本研究采用超声法提取天麻素,以天麻素含量为指标,在单因素筛选基础上,采用正交试验优化提取工艺,选择料液比、提取次数和提取时间3个影响因素,每个因素3个水平进行正交试验。结果表明,最优提取工艺组合为:提取时间20min、料液比1∶15和提取次数2次;按照此工艺平行制备3批样品,天麻素的提取率为(0.339±0.13)%。     

正交试验优化八角ISSR-PCR反应体系

利用正交试验设计研究Taq DNA聚合酶、DNA模板、引物(UBC 886)、dNTP、Mg2+浓度5个因素对云南八角ISSR-PCR反应的影响,建立其最佳反应体系。结果表明:25μL的反应体系中5个因子的最佳水平为:Mg2+3 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8μmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L。PCR最佳反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,46℃退火45 s,72℃延伸1 min,40次循环;72℃最后延伸7 min,4℃保存。     

正交试验优化精制酪氨酸的工艺条件

采用正交实验法 ,将所得实验数据进行统计分析 ,对结晶法精制酪氨酸的工艺条件进行优化。结果表明 :在酪氨酸粗品质量分数为 6 %的溶液中 ,脱色剂ζ(活性炭∶活性白土 ) =3∶1,氨水的浓度为 5 % ,反应终点pH值为 2 .0 ,中和反应恒温水浴的温度为 6 0℃的工艺条件下 ,粗品经一次脱色、结晶就能获得品质合格的产品     

正交试验优化亚麻籽拌菜油的工艺

以亚麻籽油为主要原料,在充分利用亚麻籽油独特的香味及营养物质的基础上,将亚麻籽油与辅料蒜、姜、洋葱、花椒、桂皮及香叶（蒜∶姜∶洋葱∶花椒∶桂皮∶香叶=1∶1∶2∶0.5∶0.5∶0.1）混合后在真空状态下抽提一定时间后经过滤制取浓香的亚麻籽拌菜油。正交试验优化结果表明：最佳温度为60 ℃、浸提时间为10 min、辅料与亚麻籽油的比例为1∶10,在该条件下制得的亚麻籽拌菜油风味独特、香气浓郁、色泽好,其品质最高。经测定,油酸13.11%、亚油酸12.5%、亚麻酸42.2%。     

正交试验法优化吴茱萸总碱的微波提取

以紫外-可见分光光度法为检测手段,研究了乙醇-水混合溶剂中吴茱萸总生物碱的微波提取条件,试验中分别以微波功率、萃取时间和萃取溶剂的用量、浓度及酸度等为因素,设计了五因素四水平的正交试验,考察了它们对总生物碱成分提取率的影响。结果表明,最佳提取条件为：在700W微波功率下,用浓度70％、酸度pH=2的乙醇-水混合溶剂25mL／g,提取6min,此条件下总生物碱的提取率可达0．4898％。     

正交试验法优化半夏多糖的提取工艺

目的:建立半夏多糖的最佳提取工艺.方法:采刚水提醇沉法,以多糖提取率为指标,通过单因素试验和正交试验,确定半夏多糖的最住提取工艺条件.结果:最佳水提条件为料液比1:30,70℃提取1h,提取3次,最佳醇沉工艺条件为醇沉浓度70%,静置时间12h.在此条件下,半夏多糖的提取率为13.68%.结论:该工艺简便,重复性好,多糖的提取率高.     

正交试验优化乙醇回流提取积雪草苷的工艺研究

为了优化积雪草中积雪草苷的提取工艺,本研究采用乙醇回流法,以积雪液草苷含量为研究指标,在单因素试验的基础上采用正交试验设计,考察乙醇浓度、液料比、粉碎粒度以及提取时间等因素对提取结果的影响。结果表明,积雪草苷的最佳提取工艺条件为:乙醇浓度70%、液料比10∶1、粉碎粒度140目、提取时间6h,该工艺条件下积雪草苷的提取含量达到8.32mg·g-1。     

杨梅RAPD-PCR体系的正交优化研究

以杨梅DNA为模板,对影响杨梅RAPD-PCR扩增的重要参数进行了优化试验,以期建立杨梅RAPD反应的最佳体系。通过采用正交试验设计的方法,对杨梅RAPD-PCR条件进行了优化,结果表明最佳的杨梅RAPD-PCR的反应体系(20μl)中含有1×buffer,1.0U TaqDNA聚合酶,3.0mmol/L MgCl2,0.30mmol/L dNTPs,1.5μmol/L引物和模板DNA 30-40ng。适宜的扩增条件为94℃预变性3min,再进入38个PCR循环(94℃变性30s,38℃退火30s,72℃延伸90s),72℃延伸7min,4℃保存。     

非水介质中辣根过氧化物酶（HRP）催化酚类底物聚合反应速度的影响因素

利用荧光测活法研究了非水介质中不同的对位取代基团对酚类底物ＨＲＰ催化聚合的反应速度的影响,发现反应速度既同对位取代基团的空间位阻效应有关,又同反应中间态的自由基活性有关,两者共同影响反应速度。同时还考察了有机溶剂对反应速度的影响。     

兔抗五种鱼免疫球蛋白抗体的制备和HRP标记

目的制备兔抗鱼类免疫球蛋白抗体并进行辣根过氧化酶标记,为鱼类血清学检测系统的建立提供工具。方法利用proteinA亲和层析的方法纯化鱼血清免疫球蛋白,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法来纯化兔抗鱼免疫球蛋白的抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗鱼免疫球蛋白的抗体进行HRP标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blotting来考察标记抗体与其他常见鱼类血清蛋白间的交叉反应。结果纯化了鳙、鲤、乌鳢、黄鳝、鲈五种鱼血清免疫球蛋白,免疫双扩散法测定兔抗这五种鱼免疫球蛋白的抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗鳙、鲤、乌鳢、黄鳝、鲈五种鱼类免疫球蛋白的抗体进行了HRP标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶10000左右,Western blots显示标记抗体与部分其他鱼类免疫球蛋白之间存在不同程度的交叉反应。结论成功制备了HRP标记的兔抗鱼类免疫球蛋白抗体,为鱼类血清学检测体系的建立提供了工具。     

Visualizing anterogradely transported HRP by use of TMB histochemistry: comparison of the TMB-SNF and TMB-AHM methods

Horseradish peroxidase (HRP), a commonly used enzymatic marker for tracing pathways in the central nervous system, can be visualized histochemically with the aid of the chromogen tetramethyl benzidine (TMB). In a recent report, Olucha and collaborators (J Neurosci Meth 13:131, 1985) introduced the use of ammonium heptamolybdate (AHM) as a substitute for sodium nitroferricyanide (SNF) which serves to stabilize the HRP reaction product. This TMB-AHM method of Olucha et al. proves superior to the TMB-SNF method of Mesulam (J Histochem Cytochem 26:106, 1978) in that the reaction does not produce crystalline artifact. For visualization of retrogradely transported HRP, the two methods are reportedly equivalent in sensitivity. In the work reported here, we have compared the sensitivity of the two methods in detecting HRP that was transported anterogradely after intraocular injections of the enzyme in normal adult and neonatal hamsters, as well as in animals with lesions of the superior colliculus or retina. We demonstrate that the TMB-SNF method is decidedly more sensitive than the TMB-AHM technique for visualization of anterogradely transported HRP. This difference in sensitivity is especially evident in regions of sparse projections.     

十六种鸟类二级抗体的制备和辣根过氧化物酶标记

目的制备兔抗16种鸟类的二级抗体,并进行辣根过氧化物酶标记,为鸟类血清学检测系统的建立提供工具。方法采用水稀释法粗纯抗体后,再利用改良的饱和硫酸铵分级沉淀法,或亲和层析结合饱和硫酸铵沉淀法,或饱和硫酸铵沉淀法结合SDS-PAGE凝胶切胶纯化的方法进一步纯化鸟类的IgY,利用纯化的IgY免疫大耳白兔制备抗血清,用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法来纯化兔抗鸟类的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗鸟类的二级抗体进行辣根过氧化物酶标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blots考察标记抗体的特异性。结果纯化了灰雁、鸬鹚、鸵鸟、小鹈、鸽子、鹅、孔雀、鹌鹑、贵妃鸡、草鹭、夜鹭、赤嘴潜鸭、燕鸥、长脚鹬、虎皮鹦鹉、翘鼻麻鸭等16种鸟类的IgY,免疫双扩散法测定兔抗这16种鸟类的抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗灰雁IgY、兔抗鸬鹚IgY、兔抗鸵鸟IgY、兔抗小鹈IgY、兔抗鸽子IgY、兔抗鹅IgY、兔抗孔雀IgY、兔抗鹌鹑IgY、兔抗贵妃鸡IgY、兔抗草鹭IgY、兔抗夜鹭IgY、兔抗赤嘴潜鸭IgY、兔抗燕鸥IgY、兔抗长脚鹬IgY、兔抗虎皮鹦鹉IgY、兔抗翘鼻麻鸭IgY等16种兔抗鸟类IgY的二级抗体进行了辣根过氧化物酶标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶800～80000左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性。结论成功制备了辣根过氧化物酶标记的兔抗16种鸟类的二级抗体,为鸟类血清学检测体系的建立提供了工具。     

十七种哺乳动物二级抗体的制备和辣根过氧化物酶标记

目的制备兔抗17种哺乳动物的二级抗体,并进行辣根过氧化物酶标记,为哺乳血清学检测系统的建立提供工具。方法利用饱和硫酸铵沉淀法粗纯抗体后,再利用protein A或protein G亲和层析的方法进一步纯化哺乳动物的IgG,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法来纯化兔抗哺乳动物的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗哺乳动物的二级抗体进行辣根过氧化物酶标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blot方法考察标记抗体的特异性。结果纯化了恒河猴、东北虎、布氏田鼠、黑线姬鼠、斑羚、原驼、果子狸、食蟹猴、梅花鹿、长爪沙鼠、马鹿、骆驼、大仓鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17种哺乳动物的血清IgG,分别免疫大耳白兔制备了这17种哺乳动物的兔抗血清,免疫双扩散法测定兔抗这17种哺乳动物的抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗恒河猴IgG、兔抗东北虎IgG、兔抗布氏田鼠IgG、兔抗黑线姬鼠IgG、兔抗斑羚IgG、兔抗原驼IgG、兔抗果子狸IgG、兔抗食蟹猴IgG、兔抗梅花鹿IgG、兔抗长爪沙鼠IgG、兔抗马鹿IgG、兔抗骆驼IgG、兔抗大仓鼠IgG、兔抗豚鹿IgG、兔抗熊猴IgG、兔抗大耳羊IgG和兔抗雪貂IgG等17种哺乳动物的二级抗体进行了辣根过氧化物酶标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶（2000～60000）左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性。结论成功制备了HRP标记的兔抗17种哺乳动物的二级抗体,为哺乳动物血清学检测体系的建立提供了工具。     

七种常见宠物二级抗体的制备和HRP标记

目的制备兔抗7种中国家庭中常见宠物的二级抗体,并进行辣根过氧化酶标记,为宠物血清学检测系统的建立提供工具。方法利用饱和硫酸铵沉淀法粗纯抗体后,再利用protein A 或protein G亲和层析的方法进一步纯化宠物的IgG,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法来纯化兔抗宠物的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗宠物的二级抗体进行HRP标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blotting考察标记抗体的特异性。结果纯化了狗、家猫、豚鼠、金仓鼠、松鼠、花鼠和龙猫7种宠物的血清IgG,免疫双扩散法测定兔抗这7种宠物的抗血清效价均达到1：32,并对纯化的兔抗7种宠物的二级抗体进行了HRP标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1：（2000～15000）左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性。结论成功制备了HRP标记的兔抗7种中国家庭中常见宠物的二级抗体,为宠物血清学检测体系的建立提供了工具。     

九种重要经济动物二级抗体的制备和HRP标记

目的制备兔抗9种重要经济动物的二级抗体,并进行辣根过氧化酶标记,为经济动物血清学检测系统的建立提供工具。方法利用饱和硫酸铵沉淀粗纯抗体后,再利用protein A或protein G亲和层析的方法进一步纯化动物血清IgG,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法纯化兔抗经济动物的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的二级抗体进行HRP标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blotting考察标记抗体的特异性。结果纯化了家猪,绵羊、山羊、牛、马、驴、狐狸、貉和黑貂9种重要经济动物的血清IgG,免疫双扩散法测定兔抗血清效价均达到1：32,并对纯化的兔抗家猪,绵羊、山羊、牛、马、驴、狐狸、貉和黑貂9种重要经济动物二级抗体进行了HRP标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1：（2000～15000）左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性。结论成功制备了HRP标记的兔抗9种重要经济动物的二级抗体,为经济动物血清学检测体系的建立提供了工具。     

Simultaneous saccharification and fermentation of steam-pretreated bagasse using Saccharomyces cerevisiae TMB3400 and Pichia stipitis CBS6054

Sugarcane bagasse--a residue from sugar and ethanol production from sugar cane--is a potential raw material for lignocellulosic ethanol production. This material is high in xylan content. A prerequisite for bioethanol production from bagasse is therefore that xylose is efficiently fermented to ethanol. In the current study, ethanolic fermentation of steam-pretreated sugarcane bagasse was assessed in a simultaneous saccharification and fermentation (SSF) set-up using either Saccharomyces cerevisiae TMB3400, a recombinant xylose utilizing yeast strain, or Pichia stipitis CBS6054, a naturally xylose utilizing yeast strain. Commercial cellulolytic enzymes were used and the content of water insoluble solids (WIS) was 5% or 7.5%. S. cerevisiae TMB3400 consumed all glucose and large fraction of the xylose in SSF. Almost complete xylose conversion could be achieved at 5% WIS and 32 degrees C. Fermentation did not occur with P. stipitis CBS6054 at pH 5.0. However, at pH 6.0, complete glucose conversion and high xylose conversion (>70%) was obtained. Microaeration was required for P. stipitis CBS6054. This was not necessary for S. cerevisiae TMB3400.