人β肌动蛋白基因原核表达载体的构建及其表达和纯化

目的:构建带GST标签的人β肌动蛋白(β-actin)基因的原核表达产物,纯化出GST-β-actin融合蛋白,为探究β-actin的各项生理功能做准备。方法:以人乳腺文库为模板,利用PCR技术扩增β-actin基因,将其连接到带有GST标签的载体上,经鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rossate感受态细胞,小量诱导表达后,利用GST-Sepha-rose 4B亲和珠纯化GST-β-actin融合蛋白,经SDS-PAGE和Western印迹检测。结果:目的基因经PCR技术得以扩增,将其与带GST标签的载体连接后再经双酶切鉴定及测序后确认构建成功;转化大肠杆菌Rossate感受态后获得小量诱导表达,纯化出GST-β-actin融合蛋白,并证实其有生物活性。结论:构建了人β-actin的原核表达载体,并获得了GST-β-actin融合蛋白。     

重组原核质粒GST-hTudor-SN-SN（1～4）的构建及表达

目的 将人类Tudor-SN（tudor staphylococcal nuelease）蛋白SN（1～4）基因片段分别定向连入pGEX-4T-1质粒,使Tudor-SN蛋白sN各功能片段与（;＂蛋白在大肠埃希菌BL21细胞内融合表达.方法 以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR法扩增出目的 基因,利用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切法将目的 片段连接纠pGEX-4T-1载体卜,再将构建成功的GST-hTudor-SN-SN（1～4）重组质粒转化人大肠埃希菌BL-21内,IPTG诱导表达后再以考马斯亮蓝染色法检测GST融合蛋白的表达.结果 以单/双酶切和基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,考马斯亮监染色法观察到GST融合蛋白的正确表达.结论 重组原核GST.hTudor-SN-SN（1-4）质粒成功构建和表达.     

GST/ AEP 融合蛋白原核表达载体的构建、表达及鉴定

目的：为进一步研究抗癫痫肽（And—epilepsy peptide,AEP）的抗痫机制及筛选其相关作用蛋白,进行GST／AEP融合蛋白原核表达载体的构建及融合蛋白的表达。方法：通过PCR基因扩增对AEP基因进行扩增,并将其克隆于谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1中,经酶切、序列鉴定分析后,用该重组质粒转化大肠杆菌B121（DE3）,经IPTG诱导获得表达,并采用Western Blot进行检测。结果：成功构建了AEP原核表达载体,并在大肠杆菌B121中获得表达。结论：成功构建了GST／AEP原核表达载体,并表达了GST／AEP融合蛋白。     

HCV丝氨酸蛋白酶小分子底物构建及GST融合表达

丝氨酸蛋白酶是丙型肝炎病毒重要的功能蛋白和药物作用靶点,其通过分子内（cis）和分子间（trans）方式催化水解前体蛋白,释放病毒功能蛋白。目的：为深入研究病毒蛋白酶活性和抑制剂鉴定需要,实验研究参照丙型肝炎病毒1a亚型菌株蛋白酶天然底物的氨基酸序列特点,设计了一段包含两个天然底物酶切位点的小分子多肽2S,并进行了原核表达。方法：利用PCR方法,合成2S小分子多肽基因,目的基因两端引入BamH I和EcoR I两个限制性酶切位点,双酶切后将基因与表达载体pGEX-4T-2重组,转化大肠杆菌DH5α,经化学诱导进行GST融合蛋白表达,通过亲和层析柱纯化目的蛋白。纯化的GST 2S融合蛋白在体外反应系统进行酶切鉴定,SDS-PAGE和ELISA鉴定酶切结果。结果：PCR合成的小分子底物多肽2S基因,经与表达载体重组后测序,证实基因序列正确。采用0.5mmol/L浓度的IPTG诱导工程菌过夜,获得表达的目的蛋白,经分离纯化得到融合蛋白GST-2S。GST-2S在体外磷酸盐缓冲系统中与丝氨酸蛋白酶反应,15%SDS-PAGE鉴定酶切产物,证实融合蛋白底物条带明显消失,ELISA结果同样说明融合蛋白的底物活性。结论：含有两个天然底物酶切位点的小分子多肽可以替代病毒天然底物,实验结果为丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶活性研究和酶抑制剂研究奠定了方法学基础。     

人抑癌基因PTEN的原核表达载体的构建及融合表达

为研究抑癌因子PTEN蛋白的抑癌机理,掏建了PTEN cDNA的原核表达载体并进行融合表达。将含有PTEN cDNA的质粒pMD-PTEN经EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切,回收PTEN基因片段与经相同酶切的高效原核表达载体pET-44a连接,经序列测定,证实融合型表达载体pET-Nus-PTEN构建成功。转化表达宿主BL21(DE3)后,IPTG诱导表达。经12％SDS-PAGE凝胶电泳,获得118kD的特异蛋白条带。目的蛋白占细菌总蛋白的17％。结果表明：PTEN基因和Nus基因融合表达成功,获得可溶性Nus-PTEN蛋白。该研究为PTEN蛋白的抑癌机理和基因工程药物的研究打下了基础,这是国内PTEN蛋白在原核细胞中成功表达的首次报道。     

信号肽序列对禽流感病毒H5N1 HA 蛋白GFP融合分子在真核细胞中表达的影响

[目的]构建绿色荧光蛋白(GFP)与禽流感病毒(AIV)HA基因的融合表达载体,观察信号肽序列的有无及位置对HA-GFP在293T细胞中的表达影响.[方法]应用PCR方法从H5N1亚型AIV质粒DNA中扩增出完整的或除去信号肽序列的HA基因片段,PCR产物经Xho Ⅰ和SmaⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的不同位点,将得到的重组体M1,M2和M3分别转化宿主菌DH5a,经双酶切及.DNA测序鉴定分析后,采用脂质体转染法将pEGFF-C1,M1,M2和M3转染人胚肾细胞系293T细胞,荧光显微镜下观察HA-GFP的表达,流式细胞仪检测表达HA蛋白的细胞百分数.[结果]经酶切及测序鉴定成功构建了HA-GFP重组表达载体M1,M2和M3,荧光显微镜及流式细胞仪检测到重组质粒转染的293T细胞表达强的荧光蛋白,信号肽的有无对HA-GFP融合蛋白在293T细胞中的表达有显著影响,信号肽序列使HA-GFP融合蛋白在293T细胞中的表达减少,而信号肽的位置对融合蛋白表达量的影响不显著.[结论]信号肽的有无对HA-GFP融合蛋白在细胞中的表达有显著影响.     

人造血相关PBX相互作用蛋白的原核表达及纯化鉴定

目的:构建带His标签的人造血相关PBX相互作用蛋白(HPIP)的原核表达载体,获得His-HPIP融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法:以本实验室保存的pcDNA3.0-HPIP质粒为模板,采用PCR技术扩增HPIP编码序列,将其插入载体p ET-28a(+)中,经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后转化大肠杆菌Rossate株进行小量诱导,挑选能诱导出His-HPIP的菌液进行融合蛋白的纯化,采用SDS-PAGE和Western印迹检测融合蛋白的纯化效果,采用GST pull-down技术对蛋白的生物学功能进行初步鉴定。结果:双酶切和测序结果表明His-HPIP原核表达质粒构建成功;His pull-down实验证实His-HPIP蛋白和雌激素受体α存在相互作用,说明生物学活性良好。结论:原核表达并纯化出His-HPIP融合蛋白,为进一步研究HPIP在肿瘤发生发展中的功能奠定了基础。     

δ-睡眠肽与GFP融合蛋白的表达和纯化

构建δ-睡眠肽(DSIP)蛋白与GFP的融合基因表达载体,高效表达和纯化GFP-DSIP融合蛋白。通过SOE-PCR拼接DSIP全长编码基因,并使得DSIP上游具有肠激酶识别位点,经双酶切定向克隆至表达载体pET-28a,构建重组载体pET-28a-DSIP,通过PCR扩增GFP全长编码基因,经双酶切定向克隆至pET-28a-DSIP,构建原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,通过双酶切和测序鉴定后,导入E.coli BL21宿主菌中,IPTG诱导表达融合蛋白,采用镍亲和层析和分子筛凝胶层析获得高纯度蛋白,SDS-PAGE分析鉴定。经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,在IPTG诱导下获得可溶性的绿色荧光蛋白与睡眠肽的融合蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化成功获得高纯度的融合蛋白。成功构建了DSIP与GFP融合基因的重组表达载体,确定了GFP-DSIP融合蛋白诱导表达的最佳条件,获得了较高纯度的融合蛋白,为进一步研究DSIP蛋白的生物学功能奠定了基础。     

GST-His双标签原核表达载体的构建及应用

目的：在原有带有GST标签的pGEX-KG载体上添加His标签,构建双标签原核表达载体,以提高纯化后的融合蛋白的纯度。方法：双酶切pGEX-KG载体,将同样带有双酶切位点编码His标签的DNA序列酶切后与其连接、转化大肠杆菌DH5α、鉴定阳性克隆并测序,并将编码雌激素受体B（ERβ）的片段构建到该载体上,分别利用GST标签和His标签对ERβ蛋白进行2次纯化。结果：构建了GST-His双标签原核表达载体,将ERβ编码片段克隆入该载体中,在原核生物中得到表达;分别用GST和His抗体进行Westernblot分析,均可检测到GST-His-ERβ融合蛋白的表达;利用此双标签载体纯化得到了纯度较高的ERβ蛋白。结论：GST-His双标签原核表达载体的构建对提高目的蛋白纯度具有重要意义。     

一种双顺反子表达载体的构建及应用的研究

将表达载体pEC34中的一段寡核苷酸序列,其中包括翻译增强子序列、SD序列、终止码、起始码及两端的限制性内切酶位点,插入GST基因后,构建成双顺反子的表达载体．利用此载体表达了非融合的人骨形成蛋白2A(hBMP2A)和人骨形成蛋白3(hBMP3)C端肽段,将第一顺反子基因（GST基因）切小到原来的1／3时,则位于下游的第二顺反子基因编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达量增加一倍。     

金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药辅助基因femB的克隆和原核表达

金黄色葡萄球菌femB基因与甲氧西林高水平耐药密切相关,可能成为开发抗MRSA药物的新靶位.以金葡菌基因组DNA为模板,PCR扩增femB全长基因,所得片段与pGM-T载体连接并转化感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆以PCR、双酶切及测序鉴定.将鉴定正确的目的片段定向克隆到pGEX-4T-1表达载体中,转化至大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达GST/FemB融合蛋白;采用SDS-PAGE及Western blot对融合蛋白进行鉴定.结果显示,重组质粒在宿主菌中获得了高效表达,融合蛋白相对分子质量为75 kD,该融合蛋白可与抗GST-tag抗体特异结合;表明femB基因的原核表达系统构建成功,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

人SUMO-3基因原核表达及多克隆抗体制备

构建人SUMO-3基因的原核表达载体pET41a(+)-SUMO-3,表达重组GST-SUMO-3融合蛋白,制备人SUMO-3多克隆抗体。试验结果显示,通过PCR方法从重组质粒pEYFP-SUMO-3中克隆到的SUMO-3 N端93个氨基酸的基因序列与NCBI上提供的序列一致,重组质粒pET41a(+)-SUMO-3构建成功;重组pET41a(+)-SUMO-3在E.coli.BL21 (DE3) pLysS中表达GST-SUMO-3融合蛋白,分子量为44.0 kDa,与预期分子量一致;采用亲和层析纯化融合蛋白GST-SUMO-3并免疫家兔,获得人SUMO-3抗体;Western blot 检测显示该抗体可以特异性识别SUMO-3,ELISA检测结果成阳性,抗体效价约为1: 20000。实验结果为进一步研究人SUMO-3及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具。     

粉尘螨Ⅰ类变应原(Der fⅠ)的克隆表达、纯化及免疫学特性

粉尘螨Ⅰ类变应原(Der fⅠ)是粉尘螨Dermatophagoides farinae主要变应原,可引发Ⅰ 型变态反应。挑取纯培养的粉尘螨,提取总RNA,采用RT-PCR方法有效地扩增出Der fⅠ 片段,产物连接入T载体(pMD18)。经扩增后,用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后将目的片段连接到pET24a表达载体上,得到重组质粒pET24a-Der fⅠ,工程菌经IPTG诱导培养,高效表达出Der fⅠ蛋白,该蛋白主要以包涵体形式存在。表达产物经亲和层析纯化,用Western blot及ELISA方法检测免疫学活性,结果表明目的蛋白具有良好的免疫原性。     

Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白G基因片段的克隆表达及初步鉴定

通过计算机分析Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白G的氨基酸序列,筛选出HSV1gG蛋白中优势抗原决定簇位点,用PCR技术扩增克隆含强抗原决定簇较集中的基因片段。将该段基因克隆至质粒表达载体pGEX4T2内,转化大肠杆菌TG1,构建成功了高效表达Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白G基因的工程菌。用纯化的表达蛋白HSV1gGGST作抗原ELISA分析证实有较好的抗原性和特异性,显示可应用于单纯疱疹病毒感染的诊断 。     

禽呼肠孤病毒σC基因在杆状病毒表达系统中的表达及其活性鉴定

本研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建重组禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σC基因的杆状病毒,感染sf9细胞获得表达重组蛋白。首先,将ARVσC基因克隆至pFastBacHTA载体,构建重组供体载体pFσC,将其转化大肠杆菌DHl0Bac感受态细胞,使σC基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体BacmidσC。通过脂质体介导将其转染到sf9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒rBacσC。通过Western Blot、间接免疫荧光试验(IFA)进行检测,结果显示:σC蛋白在重组杆状病毒rBacσC感染的sf9昆虫细胞中获得正确表达,分子质量约为37kD,表达的σC蛋白具有良好的反应活性。     

鼻咽癌侯选抑瘤基因BRD7原核表达载体的构建及其表达

BRD7基因是一个鼻咽癌侯选抑瘤基因,为了构建BRD7基因的原核表达载体并使其在大肠杆菌得到表达,设计了带有SalⅠ,NotⅠ酶切位点的引物,以已构建好的质粒pGEM-T Easy/BRD7为模板,用PCR扩增出BRD7基因的完整阅读框架,并用SalⅠ,NotⅠ酶切PCR产物和原核表达载体PGEX-4T-2,然后用T4 DNA连接酶将其连接,得到重组表达质粒PGEX-4T-2/BRD7,经双酶切鉴定和测序验证,表达载体构建正确.重组表达质粒转化感受态大肠杆菌Jm105后用IPTG诱导,成功表达了一分子质量约为90 ku的融合蛋白;37℃诱导4 h后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳后,经扫描分析该融合蛋白产量占菌体蛋白总量28.48%, 蛋白质印迹(Western-blot)证实了该融合蛋白的表达获得成功.这为BRD7基因的蛋白纯化及抗体制备,进一步开展其功能研究奠定了基础.     

日本血吸虫26kD抗原基因在BCG中的表达

研究了外源基因日本血吸虫２６ｋＤ抗原（Ｓｊ２６ＧＳＴ）在卡介苗（ｂａｃｉｌｕｓＣａｌｍｅｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ,ＢＣＧ）、耻垢分枝杆菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）和大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达．运用重组ＤＮＡ和聚合酶链反应（ＰＣＲ）等分子生物学技术,以表达Ｓｊ２６ＧＳＴ的Ｅ．ｃｏｌｉｐＧＥＸ衍生质粒为模板,经ＰＣＲ得到编码Ｓｊ２６ＧＳＴ的全长ｃＤＮＡ片段．将其按正确的阅读框顺序,克隆到人结核杆菌热休克蛋白（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ,ＨＳＰ）７０的启动子下游,再将ＨＳＰ７０启动子和Ｓｊ２６ＧＳＴ基因一起亚克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－２０００中,得到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭表达质粒ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６．ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６电转化入ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍｃ２１５５中表达Ｓｊ２６ＧＳＴ抗原,所表达的天然重组Ｓｊ２６ＧＳＴ（ｒＳｊ２６ＧＳＴ）为可溶性蛋白,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上分子量为２６ｋＤ处可见明显的表达蛋白带．其表达量分别占ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌体总蛋白的１５％和１０％．可见,Ｓｊ２６ＧＳＴ基因能在ＢＣＧ中高效表达．     

HSP70基因上游调控序列对GST基因在耻垢分枝杆菌中表达效率的 影响

将外源基因———日本血吸虫２６ｋＤ抗原（Ｓｊ２６ＧＳＴ）基因克隆到大肠杆菌分枝杆菌穿梭质粒中,构建成四个不同的表达截体,研究它们在耻垢后分枝杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｍｅｇｍａｔｉｓ）中的表达效率。首先将含有结核杆菌热休克蛋白７０（ＨｅａｔＳｈｏｃｋＰｒｏｔｅｉｎ,ＨＳＰ７０）的启动子的质粒ｐＭＴ７０用ＮｃｏＩ切,进行两种不同的修饰后,得到不同的ＳＤ序列;将Ｓｊ２６ＧＳＴ基因克隆进去。再将含ＨＳＰ７０启动子和Ｓｊ２６ＧＳＴ基因的片段切下,克隆到分枝杆菌大肠杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ２０００中,筛选出不同ＳＤ序列、不同方向和不同拷贝数的分枝杆菌表达载体四个。所表达的重组天然Ｓｊ２６ＧＳＴ（ｒＳｊ２６ＧＳＴ）为可溶性蛋白,在ＳＤＳＰＡＧＥ上分子量为２６ｋＤ处可见明显的表达蛋白带。通过薄层扫描分析,发现表达质粒中双拷贝启动子外源基因组合,表达效率最高,是单拷贝组合的１６倍,占分枝杆菌菌体总蛋白的２８％。而不同的克隆方向和不同的ＳＤ序列（两者相差３个碱基）对表达效率的影响不明显。     

B型肉毒毒素受体结合区C片段在大肠杆菌中的表达及免疫原性研究

目的:在大肠杆菌中表达、纯化B型肉毒毒素受体结合区C片段(BHc-C),研究其免疫原性。方法:将BHc-C基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达GST-BHc-C融合蛋白并通过亲和纯化;以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备免疫血清,采用ELISA检测免疫血清的效价并测定其抗B型肉毒毒素中和活性。结果:在大肠杆菌中表达了GST-BHc-C融合蛋白;以该融合蛋白免疫小鼠获得高效价免疫血清,且该免疫血清具有中和活性。结论:获得了GST-BHc-C融合蛋白,并证实其具有免疫原性。