小鼠骨髓源性树突状细胞的体外扩增、鉴定及生物学特性研究

目的:对树突状细胞体外大量扩增及树突状细胞的临床应用提供理论基础.方法:以重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重组小鼠白介素-4(rmIL-4)和重组小鼠肿瘤坏死因子-α(rm TNF-α)体外诱导小鼠骨髓细胞分化为DC,倒置显微镜动态观察细胞形态学变化,流式细胞术分析细胞表面分子,并应用混合淋巴细胞反应检测其刺激T淋巴细胞的增殖能力.结果:经体外诱导培养第2天即可见大量细胞集落形成;培养至第9天,DC成熟,具有典型的形态,同时DC可以显著刺激同种异体混合淋巴细胞增殖.结论:体外诱导培养可以获得大量小鼠骨髓来源的DC,可广泛应用于临床实验及实验研究.     

青钱柳多糖对小鼠骨髓来源树突状细胞表面分子表达的影响

为探讨青钱柳多糖（CPC）对小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDCs）细胞形态及表面分子的影响,首先采用细胞因子诱导法,以贴壁法获得贴壁单核细胞,添加重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rmGM—CSF）和重组白细胞介素-4（rmIL-4）进行体外诱导,倒置显微镜及透射电镜观察细胞形态的变化;流式细胞术检测培养第6dDCs的表面标志CD80,CD86和MHCⅡ类分子的表达的变化。经CPC刺激24h后,采用流式细胞术检测DCs表面MHCⅡ类分子表达的变化。结果发现：经rmGM—CSF和traiL-4诱导获得的DCs随着培养时间的延长,细胞形态发生改变,逐渐变成具有树状突起的DCs。经LPS刺激后的DCs能够发生典型的DCs的成熟,而培养第6天的DCs具有典型的DCs表型特征,可用于后续进一步实验。与阴性对照相比,CPC显著促进树突状细胞表面MHCⅡ的表达,在浓度（10～200μg／mL）范围内呈现剂量依赖性。初步表明CPC可以促进树突状细胞的成熟。     

枯草芽孢杆菌刺激小鼠肠上皮细胞分泌的IL-33在活化树突状细胞中发挥重要作用

【目的】枯草芽孢杆菌能有效诱导肠道黏膜免疫应答,但活化黏膜下树突状细胞(DC)的具体机制不完全清楚。【方法】本研究首先用不同浓度枯草芽孢杆菌刺激小鼠肠上皮CMT93细胞,用荧光定量PCR和ELISA检测细胞因子表达水平,然后将枯草芽孢杆菌刺激细胞的培养上清与小鼠骨髓源树突状细胞(BMDC)进行共孵育,用流式细胞术检测BMDC活化标志,最后用RNA干扰技术证明IL-33在活化BMDC中的作用。【结果】枯草芽孢杆菌能显著刺激CMT93细胞分泌IL-6、IL-33和IFN-γ等细胞因子,对刺激IL-33表达呈现剂量依赖性;枯草芽孢杆菌刺激CMT93细胞产生的细胞因子能活化BMDC,在RNA干扰IL-33基因表达和枯草芽孢杆菌刺激后,CMT93细胞培养上清活化BMDC的能力显著降低。【结论】本研究结果表明枯草芽孢杆菌刺激肠上皮细胞产生的IL-33在BMDC活化中具有重要作用。     

小鼠骨髓源性树突状细胞体外诱导培养方法的比较研究

目的探讨最佳体外诱导培养小鼠成熟树突状细胞（dendritic cells,DC）的方法。方法分离、纯化6周龄C57BL／6小鼠骨髓单核细胞,以含10％胎牛血清、20ng／ml重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）和10ng／ml重组小鼠白细胞介素-4（IL-4）的RPMI-1640培养基培养7d,然后将细胞分成对照未刺激组、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激组和TNF-α＋脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）刺激组。继续培养48h后,观察各组细胞形态,检测IL-12、IL-6浓度及细胞表面标志CD11c、CD80、CD86和MHC II。结果培养9d后,两刺激组培养的细胞经相差显微镜观察有DC生长。TNF—α刺激组细胞培养上清液中IL-6、IL-12含量显著高于对照组（P〈0．01）,但显著低于TNF—α＋LPS刺激组（P〈0．05）。3组均高表达CD11c,各组间无显著差异;而CD80、CD86和MHC II表达阳性率TNF-α刺激组显著高于对照组（P〈0．01）,TNF-α＋LPS刺激组显著高于单纯TNF—α刺激组（P〈0．05）。结论联合使用TNF-α与LPS刺激可使DC成熟度提高,分泌IL-6、IL-12增加。     

黑龙江立克次体重组外膜蛋白B激活树突状细胞诱导C3H/HeN小鼠特异性免疫应答

专性胞内寄生的黑龙江立克次体是远东斑点热的病原体,外膜蛋白B(OmpB)是其最主要的表面蛋白抗原.本研究将黑龙江立克次体ompB基因分成4段插入原核表达载体,制备出4个重组OmpB抗原(OmpB-P1,OmpB-P2,OmpB-P3和OmpB-P4).将4个重组OmpB抗原分别刺激体外培养的C3H/HeN小鼠树突状细胞,再将这些抗原激活树突状细胞分别腹腔接种正常C3H/HeN小鼠.接种第14天用黑龙江立克次体攻击小鼠,7天后活杀小鼠并用实时定量PCR检测小鼠主要脏器的立克次体的载量.结果显示,OmpB-P2,OmpB-P3或OmpB-P4激活树突状细胞受体小鼠的立克次体载量显著低于OmpB-P1激活树突状细胞受体小鼠.将不同抗原激活小鼠树突状细胞分别与同源抗原激活小鼠树突状细胞受体小鼠的CD4+和CD8+T细胞体外共培养.用流式细胞仪分析共培养后CD4+和CD8+T细胞的表面分子和细胞因子表达,结果显示,OmpB-P2,OmpB-P3或OmpB-P4抗原激活树突状细胞共培养的CD4+或CD8+T细胞的CD69表达水平高于OmpB-P1激活树突状细胞共培养的T细胞.此外,OmpB-P2,OmpB-P3或OmpB-P4激活树突状细胞共培养的CD4+或CD8+T细胞的TNF-?和IFN-?水平均显著高于OmpB-P1激活树突状细胞共培养的T细胞.本研究结果表明,OmpB-P2,OmpB-P3或OmpB-P4为保护性抗原,其激活的树突状细胞可以有效地诱导T淋巴细胞活化,使CD4+T细胞和CD8+T细胞分别向Th1细胞和Tc1细胞分化,产生高水平TNF-?和IFN-?共同对抗立克次体感染.     

GM-CSF体外诱导培养C57BL/6J小鼠BMDCs的动态观察及鉴定

本研究旨在通过培养并观察C57BL/6J小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)集落、形态、表型的动态变化,为BMDCs的形态、表型等方面提供参考数据。取C57BL/6J小鼠骨髓,用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导和培养BMDCs,在第3、6、9、12天拍照、HE染色观察BMDCs的集落、形态;FACS分析第3、6、9、12天以及LPS刺激后BMDCs的CD11c、CD80和CD86的表达;扫面电镜拍照LPS刺激后BMDCs的树突与形态。发现GM-CSF诱导和培养的C57BL/6J小鼠BMDCs在第3天形成明显的集落、第6天集落释放较多的BMDCs;显微镜下HE染色显示,第3天可见BMDCs有突起、第6天明显,第12天有明显突起的细胞数量增多;FACS分析显示,随着培养时间的增加,BMDCs的CD11c、CD80、CD86的表达逐渐上调,第12天表达较明显,LPS刺激能提高CD80、CD86的表达;扫描电镜显示,LPS刺激的BMDCs有明显的树突状突起。因此GM-CSF诱导和培养的C57BL/6J小鼠BMDC具有典型的树突状突起、表达CD11c、CD80、CD86等树突状细胞(DCs)分子标记,LPS刺激能促进CD11c、CD80、CD86的表达。     

透明质酸孵育树突状细胞对荷瘤小鼠免疫功能的影响

目的：研究透明质酸对小鼠骨髓来源树突状细胞功能的影响以及回输后荷黑色素瘤小鼠脾淋巴细胞增殖、活化和细胞因子 的变化,进而探讨透明质酸诱导的树突状细胞增强荷瘤小鼠免疫功能的机制。方法：体外细胞因子联合诱导培养小鼠骨髓细胞获 得树突状细胞（DCs）,免疫磁珠分选纯化获得CD11c+树突状细胞,经不同浓度透明质酸（HA）刺激后,采用酶联免疫吸附法 （ELISA）检测培养上清液中细胞因子IL-12p70 含量。建立小鼠皮下B16 黑色素瘤模型,肿瘤局部皮下回输HA 孵育DC后检测 肿瘤大小,应用ConA 检测脾淋巴细胞增殖情况,应用MTT 法检测脾淋巴细胞杀伤活性,ELISA 法检测脾淋巴细胞分泌的 TNF-alpha和IFN-r的表达,以单纯DC回输、生理盐水注射以及正常小鼠（无瘤）组作为对照。结果：在10～100 ug/mL 范围内,HA 以剂量依赖的方式上调DCs 分泌IL-12p70。HA 孵育DC处理组肿瘤生长明显受到抑制;淋巴细胞增殖反应、杀伤活性和细胞因 子TNF-alpha和IFN-r的表达明显高于单纯DC 组和生理盐水组(P < 0.05)。结论：透明质酸可促进小鼠骨髓DC 的成熟;透明质酸孵 育的DC 通过增强荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫功能而抑制肿瘤的生长。     

HPV16 E7_(86-93)纳米颗粒疫苗的免疫杀伤效果研究

目的:研究人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7_(86-93)CTL表位肽与免疫佐剂CpG-ODN自组装纳米颗粒疫苗在肿瘤模型中的免疫效果。方法:化学合成HPV16 E7_(86-93)CTL表位肽,与CpG-ODN通过静电相互作用自我组装形成纳米颗粒,采用透射电镜、动态光散射等方法鉴定纳米颗粒的性质;构建治疗性肿瘤动物模型,观察纳米颗粒疫苗在动物模型体内的抗瘤效应;通过流式细胞术测定瘤内浸润性T细胞比例、外周血及脾脏内T细胞比例;体外培养小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC),测定经纳米颗粒刺激的BMDC培养上清中的IL-6和IL-12p40浓度。结果:构建了直径约210 nm大小均匀的纳米颗粒,该纳米颗粒疫苗能显著抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长,且对于小鼠瘤内浸润性T淋巴细胞及脾脏内、外周血中的T淋巴细胞比例均有提升,同时能在体外有效刺激BMDC分泌细胞因子。结论:HPV16E7_(86-93)CTL表位肽联合CpG-ODN自组装纳米颗粒疫苗能有效杀伤肿瘤细胞,抑制肿瘤增长,改善体内免疫微环境。     

大鼠骨髓来源未成熟与成熟树突状细胞的对比研究

目的:对比培养大鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞与成熟树突状细胞,并从形态学、表型及功能检测等多方面进行对比研究,为后续的实验做出基础研究。方法:大鼠脱臼法处死后取两侧胫骨、股骨,PBS冲洗骨髓腔收集骨髓细胞,经GM-CSF和IL-4刺激培养六天后,对比研究经LPS刺激组与未经LPS刺激培养组细胞状况。结果:①成熟树突状细胞悬浮生长,集落分散,扫描电镜下见其突起数目明显多于未成熟树突状细胞。②成熟树突状细胞高表达表面标记分子CD80、CD86、MHCⅡ,而未成熟树突状细胞均低表达。③成熟树突状细胞培养基上清中IL-12水平高,而未成熟树突状细胞培养基上清中IL-12水平低。④成熟树突状细胞具有强的刺激T细胞增殖能力,而未成熟树突状细胞基本不具有诱导T细胞增殖能力。结论:未成熟状态的树突状细胞具备致耐受原性,可抑制T细胞的应答,而成熟状态的树突状细胞由于获得了免疫刺激潜能从而会对炎性刺激做出反应。     

TLR7刺激对系统性红斑狼疮易感型小鼠树突状细胞免疫功能的影响

目的研究TLR7通路对于系统性红斑狼疮易感Fas-/-MRLlpr/lpr小鼠树突状细胞免疫功能的影响。方法 从5周龄MRLlpr/lpr小鼠骨髓提取DC体外培养,以TLR7激活剂咪喹莫特处理48h,流式细胞仪检测细胞表面分子CD80、MHCⅡ表达。ELISA法检测细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-10。结果咪喹莫特处理后,树突状细胞表面抗原提呈相关分子MHCⅡ和CD80分子均降低,分泌的IFN-γ、TNF-α和IL-10均明显增加。结论 TLR7通路调节系统性红斑狼疮易感小鼠MRLlpr/lpr小鼠DC抗原呈递能力,具有影响免疫应答作用。     

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的建立一种从小鼠骨髓中分离培养间充质干细胞（MSCs）的高效方法。方法采取贴壁细胞分离法分离和纯化小鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs）,检测mMSCs在不同诱导条件下向成骨细胞及脂肪细胞分化能力,用流式细胞术及显微镜分别检测mMSCs纯度和形态特征。结果mMSCs贴壁生长后形态较均一,细胞形态呈成纤维细胞样,流式细胞术检测：CD45、CD11b、CD44及CD29分别为（3.34）%、（2.41）%、（98.46）%及（99.36）%。第4代mMSCs经诱导后可向成骨细胞和脂肪细胞分化。结论通过贴壁培养可以从小鼠骨髓中分离培养出高纯度mMSCs,该方法效率高,稳定性好。     

负载供者抗原的第三方树突状细胞延长大鼠移植心脏存活

目的观察负载供者抗原第三方未成熟DC对大鼠同种异体移植心脏存活期的影响。方法培养骨髓来源第三方大鼠未成熟DC,负载供者抗原,CTLA-4 Ig致耐受处理。建立大鼠心脏腹部移植模型,A组：心脏移植;B组：心脏移植,术前输注供者源未成熟DC;C组：心脏移植,术前输注第三方未成熟DC;D组：心脏移植,术前输注负载供者抗原致耐受第三方未成熟DC。分别行移植心病理、IFNγmRNA表达和移植心存活时间观察。结果D组的移植心病理改变轻,IFNγmRNA表达下调,移植心脏存活时间显著延长。结论负载供者抗原第三方致耐受未成熟DC能够诱导供者特异性免疫耐受,明显延长大鼠移植心脏存活时间。     

小型猪骨髓间充质干细胞的分离和培养

目的建立小型猪骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的体外分离和培养方法。方法穿刺小型猪髂后上嵴抽取骨髓,经密度梯度法离心得到骨髓单个核细胞,接种后形成单层贴壁细胞。用形态学方法鉴定培养的MSCs。结果经培养存活的MSCs原代和一代呈纺锤型、多边型或星型。至二代起呈均一纺锤型,似成纤维细胞样,长宽比例约为（2～3）？1。体外培养的原代MSCs8～10d达到融合,传代后仍具有较强的增殖能力。结论小型猪MSCs可在体外长期、稳定培养,其分离、培养体系的建立为基础研究和组织工程技术提供了一个有价值的动物模型。     

Hepal-6 RNA脉冲BMDCs瘤苗抗小鼠HCC免疫效应的研究

目的观察Hepal-6RNA脉冲BMDCs瘤苗能否激发有效的机体抗肿瘤免疫反应。方法用Hepal-6RNA脉冲骨髓分离培养5d的BMDCs,瘤苗的抗肿瘤效应通过C57BL/6J小鼠肝细胞癌(HCC)模型验证,即C57BL/6J小鼠皮下接种Hepal-6细胞8d后,成瘤小鼠分为2组:对照组(注射无血清RPMI-1640)和实验组(足垫部注射Hepal-6RNA脉冲BMDCs瘤苗),30d后处死小鼠并取淋巴结、脾和瘤体冰冻切片,进行CD4、CD8、CD25和Foxp3免疫组织化学染色。结果免疫组织化学检测显示,淋巴结、脾、肿瘤内有大量CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD25+T细胞和Foxp3+Tregs细胞浸润。与对照组小鼠比较,足垫部注射Hepal-6RNA脉冲BMDCs瘤苗的实验组小鼠淋巴结、脾、瘤内CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润显著增加,CD25+T细胞和Foxp3+Tregs浸润明显减少。结论 Hepal-6RNA脉冲BMDCs瘤苗能下调小鼠HCC瘤内CD25+T细胞和Foxp3+Tregs浸润,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖和活化,增强D4+T细胞、CD8+T细胞归巢至淋巴结和脾,具有抗瘤免疫效应。     

An improved diffusion chamber (DC) for culture of hematopoietic cells.

A DC with Nuclepore filter wall has been described. Recovery of in vitro incubated human nucleated peripheral blood cells and in vivo growth of mouse bone marrow cells in intraperitoneally implanted DCs were improved when compared to the growth obtained in the more commonly used Millipore filter chambers.     

SD大鼠骨髓间充质干细胞体外原代培养及鉴定

目的：探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养以及扩增的方法并鉴定。方法：取100g左右雄性SD大鼠后肢股骨、胫骨骨髓,原代全骨髓培养法,多次传代纯化,体外扩增后,观察细胞形态,并免疫组化及流式细胞仪检测cd34、cd90、cd105细胞因子,鉴定是否为BMSCs。结果：所获取的细胞呈长梭形,呈现特征性的漩涡状生长,CD34阴性,CD90、CD105阳性。结论：利用全骨髓培养法成功分离骨髓间充质干细胞,10代以内的细胞纯度高,活性好。全骨髓培养较为简便、易行。