脂质体DC-Chol/DOPE对HEK293FT细胞的高效转染及其在腺病毒制备中的应用

重组病毒载体系统因为具有高效的基因转移能力得到了广泛应用,而病毒包装细胞的转染是重组病毒制备过程中的关键步骤。优化了脂质体DC-Chol/DOPE介导的转染常用的病毒包装细胞系HEK293FT的实验条件,比较了DC-Chol/DOPE、Lipofectamine2000和磷酸钙共沉淀法转染细胞的效率,并且比较了用DC-Chol/DOPE和磷酸钙共沉淀法转染293FT细胞制备重组腺病毒的结果,发现DC-Chol/DOPE对293FT细胞的转染效率以及最终收获的病毒滴度都远高于磷酸钙共沉淀法转染。所以,利用DC-Chol/DOPE转染293FT细胞制备重组病毒是一种简单、高效、成本低廉的方法。     

人c-myc转基因细胞的建立

目的:建立人c-myc转基因细胞。方法:通过成功构建c-myc逆转录病毒表达载体,并经脂质体介导转染包装细胞293T,收集产重组病毒的293T培养上清,运用NIH3T3细胞测定了病毒滴度,用适当浓度的病毒感染L929细胞,经用Zeocin选择性培养基筛选细胞。结果:得到稳定高表达c-myc基因的L929转基因细胞。结论:运用逆转录病毒转染法可得到高表达的转基因细胞。     

细胞培养液pH对慢病毒包装及感染效率的影响

为解决实验室中包装慢病毒转染效率低、感染效率低的问题,从培养液p H角度对病毒包装及感染进行优化。首先构建慢病毒载体cop GFP质粒,采用磷酸钙法和Lipofectamine2000法,转染不同p H培养液培养的293T细胞。在荧光显微镜下比较转染效率,发现磷酸钙法p H(6.5~7.5)转染效率高,培养液p H(6~8)对Lipofectamine2000法转染几乎无影响。使用标准p H(7.2~7.4)培养液包装慢病毒,收取病毒上清液后调节至不同p H,加或不加Polybrene感染293T细胞,发现p H在8~9附近感染效率高,调节慢病毒p H至弱碱性与Polybrene同时使用有助于提高感染效率。     

PDX-1表达质粒的构建及表达

目的:为进一步研究PDX-1基因的功能打下基础.方法:从人的胰腺cDNA中PCR扩增PDX-1基因的阅读框架,构建质粒pAAV-PDX-1.用pAAV-PDX-1转染293T细胞48小时后,用RT-PCR和Western Blot方法检测293T细胞中mRNA和蛋白水平PDX-1的表达.结果:转染了pAAV-PDX-1的293T细胞中有PDX-1的表达,而在转染质粒pAAV-MCS和未转染的293T细胞中均没有检测到PDX-1的表达.结论:构建的pAAV-PDX-1质粒在mRNA和蛋白水平都能表达PDX-1.     

TALEN质粒转染HEK-293T细胞的条件优化

本研究探讨了TALEN质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件。以TALEN质粒右臂中的绿色荧光蛋白为报告基因,分别研究转染试剂、质粒DNA的量、转染试剂与质粒DNA的比例对转染效果的影响,转染24 h后荧光显微镜下统计具有代表性视野的绿色荧光细胞,计算绿色荧光细胞/总细胞数的比例得出转染率,并利用CCK-8试剂盒检测细胞存活率。实验结果表明,TALEN质粒转染293T细胞,采用Fugene HD转染试剂比Lipofectamine 2000转染试剂细胞存活率高;以6孔板为例,转染质粒DNA量为4μg时转染效率最高(49.0±8.0)%;Fugene HD与质粒DNA比例(μg/μL)为3:1时转染效率最高。本研究建立TALEN表达质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件,可作为相关研究或应用提供参考。     

ARG1基因对人胚肾细胞293砷染毒前后增殖及凋亡的影响

目的:观察ARG1基因对不同浓度的亚砷酸钠(NaAsO2)染毒后的293细胞的增殖及凋亡的影响,并讨论ARG1的抗砷性.方法:将ARG1表达质粒pcDNA3.1-ARG1及空载体对照质粒pcDNA3.1分别经阳离子脂质(Lipofectamine2000)介导转染293细胞后,荧光共聚焦显微镜观察细胞转染率;将实验组pcDNA3.1.ARG1-293细胞、空白对照组pcDNA3.1-293细胞及阴性对照组293细胞用不同浓度的NaAsO2浓度染毒48h后,使用MTT法检测ARG1基因对砷染毒后293细胞的增殖的影响;将实验组、空白对照纽及阴性对照组按不同浓度NaAsO2染毒,加入Annexin V FITC/PI凋亡试剂,采用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况.结果:(1)荧光共聚焦显微镜观察转染结果显示转染率可达75-85%;(2)NaAsO2在1-8 μ mol/L时其对实验组细胞增值的抑制率明显低于对照组,而在浓度>8μ mol/L时则没有明显差异;(3)实验组细胞在NaAsO2浓度<8 μ mol/L其凋亡率明显低于对照组.结论:ARG1能够降低NaAsO2对293细胞增值的抑制率,减轻其对293细胞的促凋亡作用,主要是在低浓度时发挥作用.     

重组人可溶性TIM-3稳转细胞株的构建及其分泌蛋白的表达

该研究通过慢病毒感染的方式构建携带T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3及可结晶区域[T cell immunoglobulin and mucin domain 3 and fragment of crystallizable,TIM-3(Fc)]目的基因的稳定转染细胞株并检测TIM-3(Fc)分泌蛋白的表达。设计特异性引物PCR扩增TIM-3(Fc)片段,重组插入慢病毒表达载体pCD513中并鉴定阳性克隆,无内毒素提取质粒pCD513-TIM-3(Fc)、pSPAX2和pMD2.G共转染293T细胞包装慢病毒,再利用慢病毒感染悬浮HEK293细胞,最后通过嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞株293/TIM-3。再通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测TIM-3(Fc)目的基因在转录和翻译水平上的表达,用时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)检测细胞产生TIM-3(Fc)分泌蛋白的能力。成功构建了pCD513-TIM-3(Fc)慢病毒表达载体,qRT-PCR、WB和TRFIA检测表明,293/TIM-3细胞株成功表达了TIM-3(Fc)分泌蛋白。成功构建了重组人可溶性TIM-3稳定转染细胞株293/TIM-3并成功表达了TIM-3(Fc)分泌蛋白,为进一步研究可溶性TIM-3蛋白的生物学功能提供基础。     

结核分枝杆菌38kD蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的分泌性表达

目的:构建含结核分枝杆菌38kD蛋白基因的真核表达载体并转染HEK293T细胞,高效表达分泌性38kD蛋白。方法:设计合成的结核分枝杆菌38kD基因被克隆到T载体,然后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.0,经酶切鉴定正确后,PEI转染法导入293T细胞,换不含血清的DMEM培养基培养3 d后收集细胞及上清,采用Western印迹检测38kD蛋白的表达。结果:酶切结果显示,获得正确的含38kD基因的重组表达载体;Western印迹结果显示表达载体导入293T细胞中后能在细胞及上清中检测到38kD蛋白表达。结论:构建了含重组结核分枝杆菌38kD蛋白基因的真核表达载体pcDNA3.0-38kD,该载体可在哺乳动物细胞HEK293T中高效分泌性表达38kD蛋白,为结核病诊断试剂盒研发奠定了基础。     

准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698在真核细胞中的表达与鉴定

目的:构建真核表达质粒pEGFP-N1-mpafp698,转染人胚肾293T细胞,并表达准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698.方法:PCR扩增出mpafp698序列,将其克隆入本室保存的真核表达载体pEGFP-N1中,转染293T细胞;利用RT-PCR、流式细胞仪、免疫荧光、Western 印迹检测蛋白表达.结果:构...     

重组水疱性口炎病毒载体病毒包装体系的建立及优化

目的:建立并优化重组水疱性口炎病毒(VSV)载体病毒包装体系,以获得稳定高效的重组VSV载体疫苗包装系统。方法:以prVSVΔG-GFP为骨架载体,pBS-N、pBS-P、pBS-G、pBS-L为辅助载体,探索不同的骨架质粒及辅助质粒用量、包装细胞系、重组痘病毒vTF7-3作用时间、转染试剂作用时间等因素对重组VSV载体病毒包装的影响,用光学显微镜及荧光显微镜观测重组VSV载体病毒的包装效果,应用TCID50法测定重组VSV的滴度。结果:重组VSV的包装效率随着辅助质粒或包装质粒总量的减少而降低,293T细胞较BHK21-WI2细胞包装效率更高,适当延长重组痘病毒vTF7-3作用时间或转染试剂作用时间能提高VSV包装效率。优化的病毒包装条件为:选用293T细胞,v TF7-3以5～15 MOI感染细胞1 h或以5 MOI感染细胞1～4 h,总质粒用量为3.67～22μg,转染细胞6～14 h可获得高效包装的rVSVΔG-GFP。采用优化包装条件高效包装了rVSVΔG-ZE病毒。结论:获得了稳定高效的重组VSV包装体系,为重组VSV载体的疫苗研究奠定了基础。