酿酒酵母乙醇脱氢酶2(ADH2)基因的克隆表达及活性验证

为了从酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中克隆出乙醇脱氢酶2(Alcoholdehy drogenase2,ADH2)基因并使之在大肠杆菌中高效表达。以酿酒酵母细胞中提取的总RNA为模板,通过反转录获得酿酒酵母乙醇脱氢酶2基因,连接到表达载体pTAT上,得到重组表达质粒pTAT-ADH2,将此重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,重组工程菌株经IPTG诱导表达得到ADH2蛋白。将该蛋白纯化后,在体外进行活性检测和小鼠体内进行毒理试验,检测ADH2的酶活性。测序结果表明克隆的基因与GenBank中所报道的adh2基因序列有90%的同源性,经SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白得到了有效表达,蛋白条带扫描分析表明,表达量占总蛋白的50%左右,纯化得到的蛋白在小鼠体内进行毒理试验,显示出一定的活性。酿酒酵母adh2基因的克隆正确,不仅在大肠杆菌中进行了高效表达而且表现出了较好的酶活性。     

菊粉酶基因在酿酒酵母中的表达及乙醇发酵

以乙醇耐受力较强的酿酒酵母为受体菌,构建了能够分泌菊粉酶的基因工程菌并进行了菊芋粉的生料发酵。首先,以马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus中的基因组DNA为模板,PCR扩增菊粉酶编码基因inu,分别使用菊粉酶自身启动子和酵母磷酸甘油激酶 (Phosphoglycerate kinase,pgk) 启动子,构建重组表达质粒HO/p-inu和HO/pgk-inu。经NotⅠ线性化后,采用电击法转化酿酒酵母工业菌株Saccharomyces cerevisiae 6525,分别得到含菊     

乙醇脱氢酶Ⅰ类基因全长cDNA的克隆与表达

目的:克隆编码人Ⅰ类乙醇脱氢酶基因,并探讨Ⅰ类乙醇脱氢酶(ADH)在乙醇的肝代谢中的作用。方法:从胎儿肝,肾提取的总RNA;经RT-PCR扩增得到cDNA并克隆至pGEM-T载体。cDNA序列用Kpn I和Pst I酶切鉴定,并检测其在大肠杆菌中表达活性。通过吸光法检测酶的活性。结果:成功克隆了人Ⅰ类乙醇脱氢酶并在大肠杆菌中获得稳定表达。经检测其酶活性分别为0．81～1．31U/mg、0．09～0．15U/mg和0．76～1．11U/mg。结论:cDNA克隆成功,并发现其与肝脏中分离的酶具有相似的活性。     

定向进化Rho1提高酿酒酵母的乙醇耐受性和超高浓度乙醇发酵性能

燃料乙醇发酵过程中酿酒酵母细胞活性被高浓度乙醇严重抑制而导致发酵提前终止，生产强度严重降低，因此构建同时具有高耐受性、高发酵性能的菌株一直是发酵工业追求的目标。选取酿酒酵母细胞形态调节关键基因小GTP酶家族成员Rho1,构建易错PCR产物文库，以酿酒酵母S288c为出发菌株采取“富集-自然生长-复筛”的筛选策略，成功筛选得到两株乙醇胁迫耐受性与发酵性能均提高的突变株M2和M5。测序发现突变株过表达的Rho1序列出现了3～5个氨基酸的突变和大片段的缺失突变。以300 g/L起始葡萄糖进行乙醇发酵，72 h时，M2和M5的乙醇滴度比对照菌株分别提高了19.4%和22.3%,超高浓度乙醇发酵能力显著提高。本研究为利用蛋白定向进化方法改良酵母菌复杂表型提供了新的作用靶点。     

运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术,以基因组DNA为模板克隆得到运动发酵单胞菌(Zyrnomonas mobilis)乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenaseⅡ)基因adhB,连接到表达载体pSE380上,得到重组质粒pSE-adhB。将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株DH5α中,重组菌株经IPTG诱导后,在乙醛指示平板检测到乙醇脱氢酶活性。SDS-PAGE电泳结果显示出明显的40KD特异性蛋白质条带。重组菌株经诱导培养,每毫升发酵液酶活力为5u。     

FAD依赖的葡萄糖脱氢酶多拷贝毕赤酵母菌株的构建及高效表达

通过体外多拷贝构建实现FAD依赖的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)在毕赤酵母(Pichia pastoris)X33菌株中的高效表达。将前期构建的经密码子偏好性优化FAD-GDH基因插入到pPICZαA质粒中，通过同尾酶法酶切酶连构建含1～4个表达盒的重组表达质粒，分别电转至毕赤酵母X33中，成功筛选到各种重组菌株。qRT-PCR测定结果表明，载体所含的表达盒数目与嵌合进毕赤酵母基因组中的GDH基因拷贝数之间存在正相关关系。重组菌在试管水平用甲醇诱导72 h,酶活达到最高，其中4拷贝的转化子表达水平最高；选择1拷贝和4拷贝转化子进行10 L发酵罐扩大培养，1拷贝菌株诱导108 h酶活达到最高697.125 U/mL,4拷贝菌株诱导132 h酶活达到最高1 063.279 U/mL,比1拷贝酶活提高52.52%。结果表明通过增加目的基因拷贝数策略有助于提高FAD-GDH的表达量，为其进一步扩大生产提供参考。     

嗜热厌氧乙醇杆菌α-葡萄糖苷酶基因的表达及酶学性质的研究

用PCR方法从嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)JW200中扩增出编码a-葡萄糖苷酶的基因,将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pTrc99A上并获得表达a-葡萄糖苷酶的大肠杆菌重组菌。重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测出蛋白相对分子量约89kDa,经阴离子交换层析和凝胶层析纯化后的a-葡萄糖苷酶最适反应温度为70℃,最适反应pH为5～5.5,且在pH 5.5～6.5之间有较高的稳定性。重组a-葡萄糖苷酶在70℃下105 min后酶活仍达到80%。     

瑞氏木霉EGⅠ3′-UTR对基因在酿酒酵母中表达的影响

将纤维素降解菌丝状真菌瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ (EGⅠ )全长cDNA克隆于酿酒酵母H1 58中得到表达。重组酿酒酵母产生的EGⅠ的最适pH值为 5 0 ,最适作用温度为 50℃～ 60℃。EGⅠcDNA中的 3′ 非翻译区 (3′ UTR)序列的删除导致EGI基因在酵母菌中没有活性产物表达。通过RT PCR技术检测EGⅠmRNA转录水平的结果表明 ,带有 3′ UTR的EGⅠcDNA在酿酒酵母中具有明显的转录产物生成 ,但删除 3′ UTR之后的EGⅠcDNA却检测不到转录产物。这说明EGⅠ的 3′ UTR对基因在酵母菌中的表达具有重要作用。     

瑞氏木霉EG Ⅰ 3‘—UTR对基因在酿酒酵母中表达的影响

将纤维素降解菌丝状真菌瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ（EGⅠ）全长cDNA克隆于酿酒酵母H158中得到表达。重组酿酒酵母产生的EIⅠ的最适pH值为5．0,最适作用温度为50℃-60℃。EGⅠcDNA中的3‘- 非翻译区（3‘-UTR)序列的删除导致EGI基因在酵母菌中没有活性产物表达。通过RT－PCR技术检测EGⅠmRNA转录水平的结果表明,带有3‘-UTA的EGⅠcDNA在酿酒酵母中具有明显的转录产物生成,但删除3‘-UTR之后的EGⅠcDNA去检测不到转录产物。这说明EGⅠ的3‘-UTA对基因在酵母菌中的表达具有重要作用。     

雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

根据真菌Δ6-脂肪酸脱氢酶基因保守的组氨酸Ⅱ区和Ⅲ区附近保守序列设计兼并引物进行RT-PCR,得到雅致枝霉(Thamnidium elegans)As3.2806Δ6-脂肪酸脱氢酶基因459bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术(RACE)向两端延伸得到1504bp的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个1377bp、编码459个氨基酸的开放阅读框TED6。推测的氨基酸序列与已知其他真菌的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的氨基酸序列比对,具有3个组氨酸保守区、2个疏水区及N末端细胞色素b5融合区。将此编码区序列亚克隆到酿酒酵母缺陷型菌株INVSc1的表达载体pYES2.0中,构建表达载体pYTED6,并在酿酒酵母INVSc1中异源表达。通过气相色谱(GC)和气相色谱/质谱(GC-MS)分析表明,该序列在酿酒酵母中获得表达,产生γ-亚麻酸(GLA)的含量占酵母总脂肪酸的7.5%。证明此序列编码的蛋白能将外加的亚油酸转化为γ-亚麻酸,是一个新的有功能的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因(GenBank,AY941161)。     

雅致枝霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

根据真菌△^6 -脂肪酸脱氢酶基因保守的组氨酸Ⅱ区和Ⅲ区附近保守序列设计兼并引物进行RT-PCR,得到雅致枝霉（Thamnidium elegans）As3．2806△^6 -脂肪酸脱氢酶基因459bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术（RACE）向两端延伸得到1504bp的△^6 -脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个1377bp、编码459个氨基酸的开放阅读框TED6。推测的氨基酸序列与已知其他真菌的△^6 -脂肪酸脱氧酶基因的氨基酸序列比对,具有3个组氨酸保守区、2个疏水区及N末端细胞色素b5融合区。将此编码区序列亚克隆到酿酒酵母缺陷型菌株INVSel的表达载体pYES2.0中,构建表达载体pYTED6,并在酿酒酵母INVSel中异源表达。通过气相色谱（GC）和气相色谱,质谱（GC-MS）分析表明,该序列在酿酒酵母中获得表达,产生γ-亚麻酸（GLA）的含量占酵母总脂肪酸的7．5％。证明此序列编码的蛋白能将外加的亚油酸转化为γ-亚麻酸,是一个新的有功能的△^6 -脂肪酸脱氢酶基因（GenBank．AY941161）。     

酿酒酵母二腺苷四磷酸磷酸解酶Ⅰ片段的表达、纯化及晶体培养研究

[目的]为了培养用于X-衍射的酿酒酵母二腺苷四磷酸磷酸解酶Ⅰ的蛋白晶体,为研究该酶的三维结构和功能打下基础;[方法]构建了表达酿酒酵母二腺苷四磷酸磷酸解酶Ⅰ片段(Apaldn16)的表达质粒,用核苷酸序列分析证明了克隆片段的正确性.将重组载体转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),经.IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测了蛋白的表达情况.将粗蛋白用Ni-NTA亲和层析分离,收集组分进一步用Superdex 75分子筛纯化.纯化后的蛋白用SDS-PAGE和质谱检验其纯度和正确性,然后用悬滴气相扩散法进行了蛋白结晶条件的初筛.[结果]成功地用大肠杆菌可溶性地高效表达了Apaldn16蛋白.得到了分子量约为36 kD的单一蛋白条带,纯度在95%以上.质谱结果证明该蛋白纯度高,分子量正确.将纯化后的蛋白用悬滴气相扩散法进行晶体初筛,得到了针状簇晶.此晶体经SDS-PAGE检测,证明为Apaldn16蛋白晶体.[结论]利用大肠杆菌高效表达体系可以正确表达Apalan16蛋白,蛋白经过纯化后,用悬滴气相扩散法可以生长出针状晶体,适合于进一步的三维结构研究.     

长梗木霉内切葡聚糖酶Ⅰ基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

一株纤维素酶高产菌株经ITS序列鉴定并命名为长梗木霉SSL(Trichoderma longi-brachiatum,SSL).利用RT-PCR的方法从该菌株中克隆出内切-1-4-β-D-葡聚糖酶Ⅰ的基因(eg1),该基因全长1386 bp,编码461个氨基酸.序列分析表明:该基因序列与T. longibrachiatum egl1基因具有90%以上的同源性.将该基因的成熟肽编码序列插入到Pichiapastoris表达载体pPIC9k中,构建重组表达质粒pPIC9k-eg1,转化P.pastoris GS115.重组P.pastoris菌株,经甲醇诱导后,胞外重组内切葡聚糖酶Ⅰ的活力达73 U/mL.SDS-PAGE中出现一条明显加强的蛋白质条带,其分子量大约为58 kD.     

斜卧青霉L-06内切葡聚糖酶Ⅰ基因的克隆与表达

【目的】克隆斜卧青霉L-06的内切葡聚糖酶Ⅰ基因(egI),并实现其在大肠杆菌内的高效表达。【方法】利用RT-PCR技术克隆了斜卧青霉L-06的内切葡聚糖酶Ⅰ基因(egI),并将egI基因克隆到原核表达载体中,构建了重组质粒pET32a-egI。【结果】转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE检测结果表明:重组表达产物的相对分子质量约为80 kD,与预期相符。重组表达的菌悬液,经破碎离心,取其上清液,进行纤维素酶活性染色,获得了活性条带。DNS法测得内切酶活力为2.56 IU/mL。【结论】构建了斜卧青霉L-06内切葡聚糖酶Ⅰ的原核表达系统。     

高表达人cyclin G2基因的SGC-7901细胞克隆筛选和鉴定

应用脂质体基因转染技术建立稳定表达cyclin G2基因的胃癌克隆细胞,为深入研究cyclin G2在胃癌细胞周期调控的作用和机制提供理想的生物学模型.构建以新霉素基因作为筛选标志基因的包含人cyclin G2基因真核重组表达载体pIRES-G2,大量扩增纯化后经限制性内切酶BamH I/BstXI双酶切鉴定;利用阳离子脂质体介导的基因转染法将其和对照空载体pIRESneo转染人胃癌细胞SGC-7901,经G418选择性培养基筛选后有限稀释法连续克隆化,免疫细胞化学染色检测cyclin G2蛋白表达情况.酶切结果表明cyclin G2cDNA已成功插入pIRESneo的多克隆位点内;经G418筛选后在转染pIRES-G2和转染pIRESneo组均见多个细胞克隆出现,细胞化学染色证实pIRES-G2转染组cyclin G2蛋白的表达水平明显高于pIRESneo转染组;经过多次有限稀释获得稳定高表达cyclin G2的细胞克隆.应用脂质体转基因技术成功建立高表达cyclin G2基因的人胃癌细胞克隆.     

中间锦鸡儿种子特异性fad2基因克隆及fad2-1A基因酵母表达载体的构建

△12脂肪酸脱氢酶(△ 12 fatty acid desaturase,△ 12 FAD,也称为fad2)催化油酸生成亚油酸,是植物体内生成多不饱和脂肪酸的关键酶,种子中特异表达的fad2基因负责种子贮脂中多不饱和脂肪酸亚油酸的生成,决定种子油脂的成分和营养价值.采用RT-PCR和RACE技术从中间锦鸡儿未成熟种子中克隆了种子特异表达的fad2-1A,fad2-1B基因,fad2-1A编码的前283个氨基酸与fad2-1B的同源性高达98.9%,前者比后者多编码97个氨基酸,全部氨基酸残基的同源性为70.71%.将fad2-1A克隆到真核表达载体pYES2中,构建了重组质粒pYES2-fad2-1A,经PCR检测、质粒酶切、测序等检测,目的基因确实插入重组质粒,且方向正确,为进一步研究fad2基因的功能和表达调控机理奠定了基础.