苏云金芽胞杆菌cry2Ab、cry9Ea基因的表达及活性分析

旨在为农业害虫防治提供更多的苏云金芽胞杆菌基因资源,从中国吉林市龙潭山土壤样品中分离得到野生菌株命名为Bt LTS-7,扫描电镜显示该菌株产生晶体形状为双锥体和正方体,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示该菌株产生130 kD和71 kD的晶体蛋白,通过PCR鉴定出该菌株中含有cry2Ab和cry9Ea基因,并成功克隆到了这两个新基因,并被Bt国际命名委员会正式命名为cry2Ab28和cry9Ea9,将两个基因分别在大肠杆菌Rosetta( DE3)中表达,并进一步对其表达蛋白进行杀虫活性测定.结果显示,Cry2Ab28蛋白对棉铃虫(Helicoverpa armigera)初孵幼虫具有杀虫活性,LC50为32.45 μg/mL.Cry9Ea9蛋白对小菜蛾初孵幼虫(Plutella xylostella)具有较高杀虫活性,LC50为0.77μg/mL.     

31株苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因型鉴定及表达产物研究

利用已建立的苏云金芽孢杆菌cry基因的PCRRFLP鉴定体系,鉴定了31株Bt菌株的cry基因类型,并进行了SDSPAGE分析和杀虫生物活性测定。研究表明：25株含cry1基因,表达蛋白130～150kD;其中16株含有对鞘翅目和鳞翅目害虫皆有活性的cry1I基因,其表达蛋白为81kD;15株同时含有cry1和cry2基因(13株表达蛋白约为60kD);10株含有未知待定基因;6株不含所鉴定的cry基因(其中2株有表达产物)。室内生物测定表明：cry1、cry2基因表达的菌株对鳞翅目害虫具有高杀虫活性,7株对舞毒蛾和膜翅目——杨叶蜂幼虫具有较高杀虫活性;含有cry1Aa\,cry1Ac\,cry2或cry1Ab\,cry1Ac\,cry2基因组合的菌株对棉铃虫幼虫均显示杀虫活性,其中6、12、30号菌株毒力最强。不含上述cry基因的菌株均无杀虫活性。以上结果证明,通过cry基因类型鉴定和表达产物的SDSPAGE分析可以预测菌株的杀虫活性。     

苏云金芽胞杆菌V4菌株cry杀虫基因的鉴定、表达及杀虫活性分析

旨在给生物防治提供更多的基因资源,以从本实验室分离的300株苏云金芽胞杆菌基因组为模板,利用cry1类全长通用引物进行PCR cry1类基因鉴定。经过PCR-RFLP鉴定出菌株V4含有cry1Ea基因,进一步研究发现该菌株还含有cry2Aa基因,并成功克隆到了这两个新基因,被Bt国际命名委员会正式命名为cry1Ea12和cry2Aa16。将两种基因在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达,表达蛋白进行杀虫活性测定,结果表明两种蛋白杀虫活性不理想,但对试虫存在明显的体重抑制,而V4菌株蛋白具有较高的杀虫活性。     

苏云金芽胞杆菌Rpp39杀虫晶体蛋白基因的鉴定及cry2Aa12基因的克隆表达

[目的]本研究的目的是分析从四川生态条件下分离的苏云金芽胞杆菌Rpp39菌株的特性,从分子水平上揭示该菌株对鳞翅目高毒力的原因;进一步从中分离克隆cry2Aa基因,并对其进行初步的表达研究.[方法]本研究主要采用扫描电镜观察、PCR-RFLP鉴定法和SDS-PAGE分析法研究菌株的特性;采用PCR直接克隆法克隆cry2Aa全长基因,并亚克隆到原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-2Aa,再转入受体菌E.coli.BL21(DE3)中进行诱导表达;采用室内生物测定法测定表达产物对小菜蛾和水稻二化螟的毒力.[结果]经扫描电镜观察菌株Rpp39主要产生菱形、方形和圆形3种伴胞晶体;SDS-PAGE分析表明主要产生130 kDa和60 kDa左右2种蛋白;经PCR-RFLP鉴定,该菌株含有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Ia和cry2Aa五类杀虫晶体蛋白基因;1种cry2Aa类杀虫晶体蛋白全长基因被克隆,序列分析显示该基因的开放阅读框(ORF)为1902 bps,编码由634个氨基酸组成的蛋白质,氨基酸序列与Cry2Aa1蛋白同源性为99.7%,被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry2Aa12.重组表达质粒pET-2Aa在E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导能正常表达,SDS-PAGE电泳验证含有65 kDa表达蛋白.生物活性测定表明表达的包涵体蛋白对小菜蛾和二化螟具有杀虫活性,LC50分别为5.4 μg/mL和22.3μg/mL.[结论]菌株Rpp39及从中分离克隆的cry2Aa12基因来自四川生态条件,丰富了菌株及基因的资源,在资源积累方面具有重要意义.     

一株海洋来源的高活性Bt菌的生物学特性研究

从连云港海域筛选获得苏云金芽胞杆菌h3菌株,血清型鉴定表明该菌属H5型.该菌株产生菱形、方形和双锥体形的蛋白晶体.生测试验表明该菌对小菜蛾24 h致死率迭100%.SDS-PAGE凝胶电泳显示其具有133、65、35和29 ku等多种蛋白.PCR-RFLP方法分析表明113菌株含有cry1Ac基因.cry1A基因的特异引物PCR扩增出的基因含3 537个碱基,和cry1Ac基因有5个核苷酸的差异,同源性达99%(序列登陆号AY730621),该基因被命名为cry1Ac16.并与其他cry基因比对,构建了系统发育树.     

土壤中对甲虫有活性苏云金芽胞杆菌的筛选

近几年来,甲虫已成为十字花科蔬菜的头号害虫。本文采集了湖北省各地区192份土壤样品,分离到苏云金芽胞杆菌(简称Bt)菌株74株,以甲虫代表——黄粉虫为靶标昆虫筛选了15株典型Bt,得到一株对甲虫有活性的Bt L1;生物测定该菌的半致死浓度(LC50)为221.20μg·g-1;聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示L1至少具有3个杀虫晶体蛋白;PCR扩增杀虫晶体蛋白基因,测序发现Bt L1中含有cry1Ac,cry1Aa,cry1Ia基因,推测Bt L1中对甲虫活性的杀虫晶体蛋白基因为cry1Ia。     

苏云金芽胞杆菌4.0718菌株中杀虫晶体蛋白基因的定位及鉴定

[目的]对苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)4.0718菌株中的杀虫晶体蛋白基因(insecticidal crystal protein gene,简称cry基因)进行定位和鉴定,系统分析高毒力Bt4.0718菌株的杀虫基因背景.[方法]采用脉冲电泳(PFGE)分离Bt 4.0718菌株的基因组DNA,确定该菌株的PFGE图谱和质粒图谱;采用Southern杂交分析该菌株中cry基因的定位,并使用PCR及PCR产物限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)方法鉴定该菌株染色体和质粒上含有的cry基因类型.[结果]确定了Bt 4.0718菌株的PFGE图谱和质粒图潜,鉴定到Bt4.0718菌株的染色体和质粒上均定位有cry基因,且分别包含crylAa、crylAc、cry2Aa和cry2Ab 4种基因成分.但染色体上含有的cry基因可能不如质粒上含有的cry基因具有完整的开放阅渎框.[结论]首次在Bt 4.0718菌株的染色体上发现有丰富的cry基因,且与质粒上含有的cry基因类型一致.     

苏云金芽胞杆菌6618杀虫菌株的分离和鉴定

从我国不同地区采集118份土样,利用温度筛选法分离获得一株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)6618,镜检观察发现该菌株能产生典型的菱形晶体,PCR分析表明其含有cry1类杀虫基因。采用SDS-PAGE和质谱分析发现该菌株主要产生130 k D原毒素,其组分由Cry1Ae和Cry1Ac原毒素组成。基因序列分析表明该菌株的cry1Ac基因为已知的cry1Ac1,而cry1Ae为新型杀虫基因。毒力生测表明该菌株对棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫具有显著的杀虫效果。筛选获得的高毒力Bt菌株6618为丰富我国苏云金芽胞杆菌储备和研发新型高效生物杀虫剂提供了菌株资源。     

对粉纹夜蛾高毒力cry9Eα基因的克隆及表达

[目的]从本实验室分离的Bt4菌株中克隆cry9Eα基因,并研究其表达和杀虫活性.[方法]以PCR-RFLP方法鉴定Bt4菌株含有cry9基因,然后以菌株Bt4的质粒为模板,利用全长引物F9EA/R9EA进行PCR扩增全长基因.[结果]将目的片段插入到表达载体pET21b,得到大肠杆菌重组表达质粒pETcrygEa.转化E.coli BL21(DE3),诱导后表达130 kDa的蛋白,再将cry9Eα7基因连接到穿梭载体pSXY422b,电激转化HD73-(cry-),得到工程菌BioHD9Ea7,提取Cry9Ea7晶体蛋白,并进行生物活性测定.生物活性测定结果显示CrygEa7蛋白对粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)初孵幼虫具有高毒力,LC_(50)为0.044 μg/mL,而对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)初孵幼虫未显示活性.[结论]克隆和表达了一个对粉纹夜蛾高毒力的基因cry9Eα7,并成功构建了工程菌BioHD9Ea7.     

Bt菌株QCL-1中cry2Ac10基因的克隆、表达和活性研究

目的:从高毒力Bt菌株中克隆cry2Ac10基因,并研究其表达和杀虫活性。方法:以Bt菌株QCL-1质粒为模板,利用cry2特异性引物FY2A5和FY2A3进行PCR扩增,将目的片段克隆到表达载体pET-21b( ),构建T7启动子控制的大肠杆菌重组表达质粒pET21b-cry2Ac。经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测基因表达情况,然后对表达产物进行生物活性测定。结果:从菌株QCL-1中克隆出目的基因,该基因的编码框由1 872个碱基组成,编码的蛋白质由623个氨基酸组成,与已报道的Cry2Ac氨基酸同源性为97.4%~99.7%。该基因(GenBank accession EF405952)已被国际Bt基因命名委员会正式命名为cry2Ac10。该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够正常表达70kDa的蛋白,表达产物对棉铃虫、粘虫和粉纹夜蛾幼虫具有高毒力,同时对甜菜夜蛾幼虫生长有抑制作用,其中对棉铃虫和粘虫初孵幼虫的LC50分别为30.0μg/g和16.7μg/g。结论:成功克隆和表达了cry2Ac10基因,并明确了cry2Ac10蛋白的活性,为该基因的研究和应用奠定基础。