基于mtDNA COI基因的离腹寡毛实蝇属常见种DNA条形码识别和系统发育分析

【目的】离腹寡毛实蝇属Bactrocera昆虫是最具经济重要性的实蝇类害虫,本研究依据mtDNA COI基因碱基序列对离腹寡毛实蝇属常见实蝇种类进行识别鉴定与系统发育分析。【方法】以口岸经常截获的离腹寡毛实蝇属8个亚属21种实蝇为对象,采用DNA条形码技术,通过对mtDNA COI基因片段 (约650 bp)的测序和比对,以MEGA软件的K2-P双参数模型计算种内及种间遗传距离,以邻接法(NJ) 构建系统发育树。【结果】聚类分析与形态学鉴定结果一致,除11种单一序列实蝇外,其他10种实蝇均各自形成一个单系,节点支持率为99%以上。种内（10种）遗传距离为0.0003~0.0068,平均为0.0043;种间（21种）遗传距离为0.0154~0.2395,平均为0.1540;种间遗传距离为种内遗传距离的35.8倍,而且种内、种间遗传距离没有重叠区域。【结论】基于mtDNA COI基因的DNA条形码技术可以用于离腹寡毛实蝇属昆虫的快速鉴定识别,该技术体系的建立对实蝇类害虫的检测监测具有重要意义。     

DNA条形码技术对重大潜在入侵害虫大洋臀纹粉蚧的鉴定有效性研究

【目的】粉蚧是一类重要的世界性检疫性害虫,对果蔬产业以及水果的进出口贸易造成了巨大威胁。通常,口岸截获的粉蚧多为若虫或残体,加之隐存种的存在和较小的近缘种间差异,严重影响了基于形态学特征的粉蚧类害虫识别鉴定的准确性和及时性。本研究旨在明确DNA条形码技术对重大潜在入侵害虫大洋臀纹粉蚧Planococcus minor(Maskell)的鉴定有效性。【方法】以旅检截获的36头大洋臀纹粉蚧为对象、其近缘种柑橘臀纹粉蚧Pl.citri(Risso)为参照,以线粒体COI基因5'端和3'端序列以及核糖体28S r DNA D2-D3区段序列为分子标记进行比对分析,以K-2-P模型计算种内种间遗传距离,以最大似然法(maximum likelihood,ML)构建进化树并进行系统发育分析,同时利用Species Identifier物种识别软件评价3种基因片段对大洋臀纹粉蚧的鉴定效果。【结果】当分别以COI基因5'端和3'端序列为分子标记时,截获大洋臀纹粉蚧的碱基序列与NCBI中大洋臀纹粉蚧的序列一致性分别为100%和99%~100%,而与近缘种柑橘臀纹粉蚧COI基因5'端和3'端的核苷酸序列一致性分别为97%~98%和96%~98%;且大洋臀纹粉蚧和柑橘臀纹粉蚧分别存在5个和11个稳定的物种特异性识别位点;系统发育分析显示,截获的大洋臀纹粉蚧均与数据库中的大洋臀纹粉蚧聚为一支。当以28S r DNA D2-D3区段序列为分子标记时,臀纹粉蚧属各物种间高度保守,无法区分大洋臀纹粉蚧与其近缘种柑橘臀纹粉蚧;种间遗传距离仅为0.004。此外,物种识别软件评价结果显示,基于COI基因5'端和3'端序列的鉴定结果完全正确,而基于28S r DNA D2-D3区段序列的鉴定结果却存在45.2%~61.9%的模糊鉴定。【结论】基于COI基因5'端和3'端的DNA条形码技术完全可用于大洋臀纹粉蚧的快速准确鉴定及检测,对有效阻截其入侵和进一步扩散蔓延意义重大。     

基于线粒体COI基因的青海省44种蚤类的分子鉴定及系统发育分析

【目的】本研究应用DNA条形码技术对青海省部分蚤种进行鉴定,旨在弥补蚤类传统形态分类方法的不足。【方法】通过PCR扩增3总科6科22属44种共182头蚤类标本的线粒体COI基因片段(约600 bp)并进行测序和比对;用K2P模型计算种内及种间遗传距离;以邻接法(neighborjoining,NJ)构建系统发育树。【结果】共测得182条COI基因序列片段(GenBank登录号:MG138154-MG138335);分析可知蚤种内遗传距离0.01%~2.90%,种间遗传距离4%~12%,种间遗传距离显著大于种内遗传距离。系统发育树显示,同一物种的不同个体均形成高支持率的单系,种间分支很明显。【结论】本研究结果表明COI基因可以用于蚤类的快速鉴定。     

巨疖蝙蛾不同虫态的COI基因条形码识别

【目的】巨疖蝙蛾Endoclita davidi(Poujade,1886)是雪峰虫草菌Ophiocordyceps xuefengensis的重要寄主。本研究分析了该虫线粒体DNA COI基因条形码,以在不同虫态及被虫草菌寄生的僵虫状态下能快速准确鉴定寄主种类。【方法】PCR扩增巨疖蝙蛾成虫(足一对,胸肌,翅基部)、卵(单粒)、幼虫(胸足一对)、蛹(少量体壁组织)及虫草僵虫(胸足或体壁)组织共计21个样品的COI基因片段(约658 bp)并进行测序和比对;以MEGA6.0软件的K2-P双参数模型计算种内及种间遗传距离;以邻接法(neighbor-joining,NJ)和最大简约法(maximum parsimony,MP)两种方法构建系统发育树。【结果】聚类分析与形态学鉴定结果一致,所纳入分析的20个样品均为同一物种,节点支持率可达99%。种内遗传距离为0.00%~1.08%,平均0.54%。与蝙蝠蛾科其他6种昆虫种间遗传距离为5.36%~13.31%,平均10.47%;种间遗传距离为种内遗传距离的19.39倍(10.47%vs 0.54%),而且种内与种间遗传距离没有重叠区域。【结论】基于mtDNA COI基因DNA条形码技术可以用于巨疖蝙蛾的快速准确鉴定,并对蝙蝠蛾科(Hepialidae)昆虫的分子系统发育分析有重要意义。     

DNA条形码技术在田间常见蓟马种类识别中的应用

蓟马类害虫种类多、 体型小, 传统的形态学鉴定方法难以快速准确识别。本研究利用DNA条形码通用型引物, 以我国田间常见的25种蓟马为靶标扩增其线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ (mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅰ gene, mtDNA COⅠ) 基因 (约650 bp), 通过对靶标片段碱基序列的测序及比对分析, 以邻接法 (NJ法) 构建系统发育树, 并以Kimura双参数模型计算种内、 种间遗传距离。结果表明： 聚类分析与形态学鉴定结果一致, 表现为较长的种间分支和较短的种内分支, 每个单系分支对应一个物种, 同一物种不同单倍型的最初分支自展值均为100%。25种蓟马的种内平均遗传距离为0.0027, 种间平均遗传距离为0.2757, 种间遗传距离为种内遗传距离的102.1倍; 而且种内、 种间遗传距离没有重叠区域。结果说明基于COⅠ基因的DNA条形码技术可以用于不同种类蓟马的快速准确鉴别。     

基于种特异性COI标记的新入侵种甘蓝粉虱快速鉴定技术

【目的】针对粉虱类害虫种类多、体型微小、形态相似、难以准确快速识别的问题,以新入侵我国大陆的甘蓝粉虱 Aleyrodes proletella (L.)为靶标,以田间常见的其他10种/隐种粉虱为参照,采用基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I (mitochondrial DNA cytochrome c oxidase subunit I, mtDNA COI) 基因的种特异性 (species-specific COI, SS-COI) PCR方法,研究其快速分子检测技术。【方法】利用mtDNA COI基因通用型引物LCO-1490/HCO-2198获得甘蓝粉虱及其他常见粉虱的COI序列,根据测序结果设计种特异性SS-COI引物1对（APZYJF/APZYJR）,其扩增片段大小为384 bp,同时对该对引物的种特异性及灵敏性进行检测。【结果】种特异性检验结果显示,该对引物仅对甘蓝粉虱的mtDNA COI基因具有扩增效果,对我国常见的其他种类的粉虱包括温室粉虱 Trialeurodes vaporariorum (Westwood)、柑橘粉虱 Dialeurodes citri (Ashmead)、螺旋粉虱 Aleurodicus disperses (Russell)、双钩巢粉虱 Paraleyrodes pseudonaranjae Martin、非洲伯粉虱 Bemisia afer (Priesner et Hosny)以及烟粉虱B. tabaci (Gennadius)5个隐种（MED, Asia I, Asia II 1, Asia II 3和China 1）等不具有交叉反应扩增能力。灵敏性检验结果显示,该对引物不仅对不同性别的成虫具有良好的扩增效能,对2-4龄若虫甚至单粒卵或单头初孵若虫亦具有同样的扩增能力,其最低检测阈值为14.00±0.37 pg/μL（相当于1/25 600头雌性成虫）。【结论】该技术体系完全可用于甘蓝粉虱的快速准确识别及检测监测,对有效阻截其进一步扩张蔓延意义重大。     

基于mtDNA COI基因序列的中国柑橘果实蝇的分子鉴定及柑橘大实蝇种群的遗传多样性分析

【目的】探明危害我国柑橘的实蝇种类以及柑橘大实蝇Bactrocera minax不同地理种群和不同寄主种群的遗传多样性。【方法】利用mtDNA COI基因对危害柑橘的果实蝇进行种类鉴定,采用MEGA软件对其中28个地理种群的535头果实蝇COI基因片段(约505 bp)序列进行比对,分析种间及种内遗传距离,构建系统发育树。使用DnaSP软件分析柑橘大实蝇不同地理种群和不同寄主种群的遗传多样性。【结果】从柑橘虫果内共鉴定出4种实蝇,分别为柑橘大实蝇B.minax、桔小实蝇B.dorsalis、蜜柑大实蝇B.tsuneonis和瑞丽果实蝇B.ruiliensis。这4种实蝇的种间遗传距离为0.0264～0.2410,种内遗传距离为0.0000～0.0140,种间与种内遗传距离没有重叠区域。单个柑橘虫果内一般仅有1种实蝇,极个别柑橘果实可同时被两种实蝇危害(4/43);在这些为害柑橘的实蝇种类中,以柑橘大实蝇的个体数量比例最大,占90.70%。柑橘大实蝇地理种群遗传多样性高,28个种群共有17个单倍型。【结论】柑橘大实蝇是所调查地区柑橘实蝇的绝对优势种,其种群遗传分化程度较高,扩散危害风险大。本研究结果对柑橘果实蝇类的监测和防控具有重要意义。     

Application of DNA barcoding technology for species identification of common thrips ( Insecta: Thysanoptera) in China

蓟马类害虫种类多、体型小,传统的形态学鉴定方法难以快速准确识别.本研究利用DNA条形码通用型引物,以我国田间常见的25种蓟马为靶标扩增其线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(mitochondrial cytochrome coxidase subunit Ⅰ gene,mtDNA CO Ⅰ)基因(约650 bp),通过对靶标片段碱基序列的测序及比对分析,以邻接法(NJ法)构建系统发育树,并以Kimura双参数模型计算种内、种间遗传距离.结果表明:聚类分析与形态学签定结果一致,表现为较长的种间分支和较短的种内分支,每个单系分支对应一个物种,同一物种不同单倍型的最初分支白展值均为100％.25种蓟马的种内平均遗传距离为0.0027,种间平均遗传距离为0.2757,种间遗传距离为种内遗传距离的102.1倍;而且种内、种间遗传距离没有重叠区域.结果说明基于COⅠ基因的DNA条形码技术可以用于不同种类蓟马的快速准确鉴别.     

双钩巢粉虱的种特异性SS-COⅠ检测技术

【背景】双钩巢粉虱是近年在我国南方新发现的一种入侵害虫,其寄主范围广,危害严重,进一步扩散蔓延趋势明显。【方法】针对粉虱类害虫体型微小、形态相似、难以准确快速识别的问题,以双钩巢粉虱为靶标,以我国常见的其他8种／隐种粉虱为参照,采用基于mtDNACOI基因的种特异性SS—COI方法,研究其快速分子检测技术。利用COI通用型引物LCO．1490／HCO．2198获得双钩巢粉虱及其他常见粉虱的COI序列,根据测序结果设计特异性SS—COI引物1对（PPZYFl／PPZYRl）,其扩增片段大小为233bp。【结果】种特异性检验结果显示,该引物只对双钩巢粉虱的COI基因具有扩增能力,对其他种／隐种粉虱,包括烟粉虱的不同隐种（MEAMl隐种、MED隐种、AsiaⅡ3隐种和AsiaII1隐种）以及温室粉虱、柑橘粉虱、黑刺粉虱、螺旋粉虱等不具有扩增效果。该引物不仅对不同性别的成虫具有良好的扩增能力,对1—4龄若虫和单粒卵亦具有同样的扩增效能,其最低检测阈值为1／40960头雌性成虫。【结论与意义】本检测技术对口岸检疫以及观赏植物、果树及其种苗调运中的害虫检测、监测意义重大。     

基于三个分子标记的粉毛蚜亚科DNA条形码

【目的】粉毛蚜亚科昆虫是重要的林业害虫,但是由于蚜虫体型较小,形态特征趋于简化,可用于物种鉴定的有效特征非常有限,因此一般基于外部形态特征难以对蚜虫物种实现快速准确的鉴定。本研究获取该亚科2属10种的DNA条形码标准序列,解决部分物种的分类问题,同时比较了3种标记对粉毛蚜亚科（Pterocommatinae）物种快速鉴定的效率。【方法】基于蚜虫的线粒体细胞色素氧化酶C亚基I（cytochrome oxidase subunit I, COI）基因、细胞色素b（cytochrome b, Cytb）基因和蚜虫初级内共生菌Buchnera 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（gluconate-6-phosphate dehydrogenase, gnd）基因,对2属10种共197号样品进行NJ分析、遗传距离的计算以及基于相似性的物种鉴定分析。【结果】与K-2P模型相比,基于p-distance模型计算得到的遗传距离更小,序列差异频次图上种内距离与种间距离的重叠区域也小于前者;COI序列的物种鉴定成功率最高。获取了粉毛蚜亚科近200条DNA条形码标准序列,并建立了基于3个标记的该亚科物种DNA条形码序列库。【结论】在粉毛蚜亚科DNA条形码研究中,p-distance模型要优于K-2P模型;COI序列具有最高的条形码分析效率;增毛卷粉毛蚜Plocamaphis assetacea可能为蜡卷粉毛蚜Plocamaphis flocculosa的同物异名。     

云南边境地区果实蝇属种类DNA条形码鉴定

【目的】果实蝇属Bactrocera中有国际上重要的检疫性害虫, 基于形态的物种鉴定有一定的局限性。另一方面, 云南边境地区为东南亚地区实蝇入侵我国的重要通道。因此, 对该地区实蝇分子鉴定方法的研究对于该属物种的快速准确鉴定具有重要意义。本研究旨在探讨DNA条形码技术在果实蝇属物种鉴定中的有效性。【方法】使用线粒体基因COI和COII序列的通用引物对果实蝇属20个物种60份样品进行PCR扩增、测序和序列分析; 采取距离方法和建树方法评价2种序列的鉴别能力。【结果】COI和COII序列平均长度分别为682 bp和339 bp, 种内和种间遗传差异较大, 有较明显的遗传距离间隔（barcoding gap）, 鉴定成功率分别为91.2%和90.7%。另外, 分子系统树表明华实蝇亚属Sinodacus不是单系群。【结论】COI和COII序列均能够将绝大多数果实蝇属物种进行准确鉴别, 应用COI或COII序列进行果实蝇属物种鉴定具有一定的可行性。     

基于线粒体COI、Cytb和COII基因的中国草地螟不同地理种群遗传分化分析

【目的】揭示中国草地螟Loxostege sticticalis不同地理种群的遗传分化程度。【方法】采用PCR技术扩增中国西北和华北地区草地螟11个地理种群的线粒体 COI, Cytb和COII基因序列,基于其序列变异及单倍型贝叶斯系统发育树和单倍型网络图分析,探讨不同地理种群间的遗传距离、分子系统发生关系及遗传分化程度。【结果】草地螟11个地理种群的线粒体 COI, Cytb和COII基因序列分别有24, 12和69个变异位点(分别占总序列的3.6%, 2.7%和8.8%),检测到的单倍型分别为22, 14和16个,单倍型多样度(Hd)分别为0.7600, 0.5842和0.7341,核苷酸平均差异度(K)分别为1.704, 0.752和3.997,不同单倍型间的遗传距离平均值分别为0.004, 0.005和0.013。总种群的Tajima’s D和Fu’s Fs值皆不显著,表明草地螟不同地理种群间的遗传分化不明显,群体大小稳定。根据各地理种群的单倍型建立的系统发育树和单倍型网络图表明,各单倍型散布在不同的地理种群中,无明显的地理分布格局。【结论】草地螟各地理种群的遗传距离与地理距离间不具有显著的相关性,其遗传分化不明显。     

中国新疆地区粉虱种类（半翅目：粉虱科）记述

记述了新疆地区粉虱5属6种,即欧洲甘蓝粉虱Aleyrodes proletella(Linnaeus),葡萄穴粉虱Aleurolobus shantungi Tang,非洲小粉虱Bemisia afer(PriesnerHosny),烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius),桑粉虱Pealius mori(Takahashi),温室白粉虱Trialeurodes vaporariorum(Westwood),其中葡萄穴粉虱为新疆新记录种。并且用扫描电镜对其伪蛹进行拍照,并依据玻片标本进行了描述。编制了新疆地区粉虱分类检索表。     

中国北方常见芫菁分子物种界定(鞘翅目: 芫菁科)

【目的】应用线粒体COI和核CAD基因片段探讨自动条形码间隔探索(automatic barcode gapdiscovery, ABGD)、广义混合Yule溯祖模型(generalized mixed Yule coalescent, GMYC)、贝叶斯泊松树进程(Bayesian Poisson tree processes, bPTP)和贝叶斯系统发育和系统地理分析(Bayesianphylogenetics and phylogeography, BPP) 4种分析方法在芫菁科(Meloidae)昆虫分子物种界定中的适用性。【方法】分别基于COI, CAD和COI+CAD串联序列数据集,应用ABGD, GMYC, bPTP和BPP 4种方法对中国北方芫菁科常见的6属(沟芫菁属Hycleus、斑芫菁属Mylabris、豆芫菁属Epicauta、绿芫菁属Lytta、星芫菁属Megatrachelus和短翅芫菁属Meloe)18个形态种进行分子物种界定,并与形态学鉴定结果进行比较。【结果】利用COI+CAD串联序列数据集所得物种界定结果与形态鉴定结果一致;COI数据集使用ABGD和GMYC方法的界定结果与形态鉴定结果一致,而bPTP划分的物种数较形态鉴定结果多;基于CAD序列在3种单基因物种界定方法的结果中,除GMYC与形态划分一致外,其余均显示部分结果与形态划分不同。【结论】在芫菁科分子物种界定中,多基因联合序列、多种界定方法分析所得结果优于单一基因片段和界定方法的分析结果。本研究的结果为芫菁科昆虫的分子物种界定和整合分类提供了数据支持和参考。     

青海省6种裂腹鱼COI基因作为DNA条形码的适用性初探

青海省裂腹鱼鱼类至少有20种,占土著鱼类的40%以上,具有重要的生态价值。由于生态环境的恶化和人为因素的干扰,很多物种群已濒临灭绝。快速和准确的物种鉴定对于这些物种的保护至关重要,而基于形态学的传统分类法很难满足这一需求。因此,本研究通过DNA条形码技术初步探讨了在青海省裂腹鱼物种鉴定中的适用性。本研究中,测序获得了青海26尾裂腹鱼(6个物种)的细胞色素c氧化酶亚基I (COI)基因,并经GenBank数据库进行比对;基于K2P模型分析COI序列变异;运用贝叶斯法(BI)和最大似然法(ML)构建系统发育树。结果显示,6种裂腹鱼COI序列检测得到15个单倍型,且各物种间无共享的单倍型。基于K2P模型,最大种内遗传距离和最小种间遗传距离分别为(0.621±0.297)%和(2.792±0.644)%。种间平均遗传距离为(12.205±1.307)%,约为种内平均遗传距离((0.327±0.162)%)的37倍,表明各物种的COI序列间已经形成明显"条形码间隙"。AMOVA分析显示,遗传变异主要来自种间,约占97.05%;FST=0.970 54,p<0.01,说明各物种间分化程度极高。此外,基于BI和ML方法构建的系统树具有一致的拓扑结构,分辨率较高;各物种均单独聚为一个发育枝,拓扑结构合理。以上结果表明,COI基因作为DNA条形码在青海裂腹鱼物种鉴定中具有较高的适用性。