松墨天牛漆酶基因MaLac1的克隆、原核表达及表达谱分析

【目的】本研究旨在克隆并鉴定松墨天牛Monochamus alternatus内源漆酶基因MaLac1,分析其在松墨天牛不同发育阶段的表达水平,为进一步明确MaLac1功能提供依据。【方法】基于松墨天牛肠道转录组测序数据,通过RACE克隆松墨天牛MaLac1基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;将该基因与pET-32a载体链接构建表达载体pET-MaLac1,导入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3)使其表达;使用qPCR检测MaLac1基因在松墨天牛不同发育阶段(低龄幼虫、老熟幼虫、蛹、雌成虫和雄成虫)肠道中的表达差异。【结果】克隆获得松墨天牛MaLac1的cDNA全长序列(GenBank登录号:KY073340)。MaLac1开放阅读框全长2 067 bp,编码一个含688个氨基酸的蛋白质,预测分子量为78.34 kD,等电点为5.30。SignalP 4.1 Server预测MaLac1在N端包含一个15个氨基酸的信号肽。序列比对分析表明,MaLac1具有典型的昆虫漆酶基因特征,与赤拟谷盗Tribolium castaneum漆酶基因的氨基酸序列一致性达93%。SDS-PAGE检测发现IPTG诱导表达了一条大约78 kD的特异蛋白条带,与推测大小一致。qPCR结果显示,MaLac1在不同发育阶段的松墨天牛肠道中均有表达,其中,在雌成虫肠道中表达量最高,在雄成虫肠道中的次之,在幼虫肠道中的最低。【结论】MaLac1在松墨天牛成虫中表达量显著高于其在幼虫中的,这一结果可能与幼虫和成虫的取食习性差异相关。MaLac1在松墨天牛体内的功能还有待进一步研究。     

松墨天牛Mfe2基因的克隆、原核表达和表达谱分析

【目的】Mfe2为过氧化物酶体多功能酶类型2(peroxisomal multifunctional enzyme type 2)基因,在脂肪酸的β氧化中起到了极其重要的作用。本研究旨在获得和鉴定松墨天牛Monochamus alternatus的Mfe2基因,原核表达其编码蛋白,并分析其在该虫不同虫态和成虫不同组织中的表达模式。【方法】采用在载体与目的片段之间设计具有重叠区引物的快速克隆方法克隆松墨天牛Mfe2基因,并对克隆所得序列进行生物信息学分析;IPTG诱导原核表达,并以Western blot结果验证Mfe2基因表达的融合蛋白的成功表达;使用RT-q PCR技术分析这一基因在天牛不同虫态和成虫不同组织中的表达谱。【结果】克隆到松墨天牛Mfe2基因,并命名为Ma Mfe2(Gen Bank登录号:MF944109),其ORF序列全长为2 148 bp,编码716个氨基酸,预测分子量大小为77.56 k D。生物信息分析显示,Ma Mfe2具有AICARFT_IMPCHas保守结构域序列,与光肩星天牛Anoplophora glabripennis过氧化物酶体多功能酶2氨基酸序列一致性最高(为91%)。Western blot检测显示大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中Ma Mfe2表达的蛋白与抗体有特异性结合。发育表达谱结果表明,Ma Mfe2在松墨天牛蛹期表达量最高,在卵和幼虫期表达量较低;组织表达谱结果表明,在成虫不同组织中,Ma Mfe2在脂肪体中表达量最高,在前胸中表达量最低。【结论】松墨天牛Mfe2基因Ma Mfe2编码过氧化物酶体多功能酶,在不同虫态和成虫组织中存在差异表达。本研究为进一步探究该基因在松墨天牛中的功能奠定了基础。     

大豆食心虫储存蛋白hexamerin基因的克隆与表达分析

【目的】储存蛋白是昆虫发育、变态和生殖过程中氨基酸的主要来源,Hexamerin是储存蛋白家族重要成员,在昆虫的生长发育中起着重要作用。为了研究hexamerin基因(SpbHex)在大豆食心虫Leguminivora glycinivorella Matsumurav生长发育过程中的作用,对大豆食心虫SpbHex基因进行克隆与表达分析。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆SpbHex的cDNA全长序列,并通过qPCR研究其在不同发育阶段和幼虫不同组织的表达情况。【结果】SpbHex基因cDNA序列全长2 161 bp,其中开放阅读框2 112 bp,编码703个氨基酸。蛋白预测分子量84.15 ku。hexamerin基因在大豆食心虫不同发育阶段和不同组织中均有表达。在不同生长发育阶段中4龄幼虫的表达量较高,1龄和成虫的表达量较低;在不同组织中脂肪体的表达量较高,表皮中的表达量最低。【结论】本研究克隆了大豆食心虫储存蛋白hexamerin基因,并对其在大豆食心虫中表达模式进行分析,为进一步明确hexamerin基因在大豆食心虫生长发育中的作用奠定基础。     

棉铃虫HaTO-like基因的克隆、序列分析和表达特征

【目的】克隆和分析了棉铃虫Helicoverpa armigera HaTO-like基因的编码框序列,检测了该基因的时空表达谱以及在棉铃虫感染核型多角体病毒HaSNPV后的转录变化,为深入研究该基因的功能提供理论依据。【方法】本研究利用RT-PCR的方法首次克隆获得HaTO-like基因的全长cDNA序列,通过几种生物信息学软件对该基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析,并利用荧光定量PCR技术检测了该基因在棉铃虫不同发育阶段、幼虫组织和成虫组织的表达情况,以及HaSNPV感染对HaTO-like基因表达的影响。【结果】棉铃虫HaTO-like基因cDNA全长为994 bp,开放阅读框为756 bp,编码251个氨基酸,其蛋白序列的N端含有23个氨基酸的信号肽。进一步的序列分析表明棉铃虫HaTO-like与其他昆虫同源蛋白的氨基酸序列一致性不是太高,大概在39%~61%之间,其中与家蚕和脐橙螟在系统进化上关系最近。荧光定量PCR结果表明该基因在棉铃虫的5龄0 h和成虫第1天的的表达量相对较高,在幼虫的头部和表皮内的表达量较其他幼虫组织较高,在成虫的头部和足的表达量也相对较高。而病毒感染则显著地诱导了该基因在棉铃虫幼虫头部和表皮内的表达。【讨论】本研究克隆了棉铃虫HaTO-like基因的全长cDNA序列,分析了该基因的序列特征和表达谱,为进一步阐释该基因的功能奠定理论基础。     

松墨天牛小热激蛋白基因的克隆、表达谱及对温度胁迫的响应

【目的】松墨天牛Monochamus alternatus是我国南方松林中的重要蛀干害虫,也是林业检疫性病害——松材线虫病的主要媒介昆虫,其分布范围较广,对温度的适应性强,本研究旨在初步探讨松墨天牛对温度胁迫适应性的分子机制。【方法】采用RT-PCR与RACE技术克隆松墨天牛小热激蛋白(small heat shock protein,sHSP)基因的全长cDNA,结合生物信息学方法分析小热激蛋白的结构特征;利用qPCR技术测定该基因在松墨天牛不同发育阶段、4龄幼虫不同组织及不同低温和高温胁迫下4龄幼虫中的表达谱,并用geNorm,NormFinder和BestKeeper软件对不同温度下内参基因稳定性进行评价。【结果】获得松墨天牛sHSP基因的cDNA全长序列,命名为MaltHSP21.20(GenBank登录号:MH091811),全长为871 bp,编码187个氨基酸,信号肽预测表明其N末端含有18个氨基酸的信号肽,成熟蛋白预测分子质量为21.20 kD,等电点为8.65。结构域预测符合小热激蛋白家族的特征,共含有10个β折叠片,在α结构域内含有7个β折叠片。进化树分析表明该蛋白氨基酸序列与光肩星天牛Anoplophora glabripennis的sHSP有较高的同源性。不同软件分析得到最稳定的内参基因存在差异,结合3种方法评价得出RPL10最为稳定。MaltHSP21.20在不同发育阶段的松墨天牛体内均有表达,滞育幼虫中表达量最高,卵期及蛹期表达量次之;在4龄幼虫不同组织中均有分布,脂肪体中表达量最高;4龄幼虫MaltHSP21.20对低温诱导无响应,其表达量在35℃时显著上调,45℃处理2和3 h最高,50℃时下降。【结论】RPL10是不同温度胁迫下较稳定的内参基因。相比其他热激蛋白基因,MaltHSP21.20对低温敏感性较低,推测其在幼虫滞育越冬及抵抗高温中发挥重要作用。     

苹果蠹蛾NAPDH-细胞色素P450还原酶(CPR)基因的克隆及表达模式分析

【目的】本研究通过克隆苹果蠹蛾Cydia pomonella CPR (CpCPR)基因cDNA序列,并对该基因的表达模式进行分析,为深入研究P450酶系在苹果蠹蛾对植物次生物质和杀虫剂解毒代谢过程中的作用提供理论基础。【方法】以近缘昆虫的CPR氨基酸序列作为询问序列,在苹果蠹蛾转录组(SRX371333)中进行筛查比对,获得了苹果蠹蛾CPR(CpCPR)基因的cDNA序列。采用RT-PCR技术克隆目的基因的开放阅读框(ORF)。利用生物信息学软件分析目的基因的序列特征、3D结构和与其他昆虫CPR基因的系统进化关系。采用RT-qPCR技术测定CpCPR基因在苹果蠹蛾不同发育阶段(卵、幼虫、蛹和成虫)及幼虫不同组织部位(头部、表皮、脂肪体、中肠和马氏管)的表达水平。【结果】克隆获得的苹果蠹蛾CpCPR基因的ORF为2 052 bp,编码683个氨基酸残基,预测的蛋白质分子量(Mw)为77.326 ku,理论等电点(pI)为5.65。CpCPR包含FMN区域、NADPH区域和FAD等昆虫CPR的典型特征。系统发育分析表明,苹果蠹蛾CpCPR与鳞翅目昆虫CPR基因聚在一枝。RT-qPCR结果表明,CpCPR基因在苹果蠹蛾的整个发育阶段均有表达,在幼虫期表达量最高;CpCPR基因在4龄幼虫的各部位均有表达,在中肠中的表达量最高。【结论】克隆获得了苹果蠹蛾CpCPR基因的ORF序列,该基因在苹果蠹蛾主要取食阶段和消化器官中高表达,表明其可能在苹果蠹蛾对植物次生物质和杀虫剂解毒代谢过程中扮演重要作用。     

烟草甲clip丝氨酸蛋白酶基因的克隆及其对外源激素和免疫胁迫的表达响应(英文)

【目的】作为细胞外信号级联通路的重要组成部分,含有clip结构域的丝氨酸蛋白酶(clip-domain serine proteases, CLIPs)在昆虫发育和先天免疫过程中起着重要作用。本研究旨在克隆烟草甲Lasioderma serricorne CLIP基因,解析其在烟草甲不同发育阶段和幼虫不同组织中的表达模式,分析其在外源激素20-羟基蜕皮酮(20E)和免疫胁迫后的表达特征,为进一步研究其生理功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR技术克隆获得烟草甲两个CLIPs基因(LsCLIP1和LsCLIP2)全长cDNA序列,并利用生物信息学软件预测其编码蛋白的结构和特征,利用MEGA 6.06构建昆虫CLIPs系统发育树;利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)研究这两个基因在不同发育阶段［低龄幼虫(卵孵化后24 h内)、高龄幼虫(4龄以上)、蛹(化蛹后48 h以上)、早期成虫(化蛹后24 h内)和晚期成虫(化蛹后7 d)］、5龄幼虫不同组织(表皮、脂肪体、肠道和剩余组织)中以及注射20E(120 ng/幼虫)和来源于大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的肽聚糖(0.2 μL)后4龄幼虫中的表达模式。【结果】克隆获得烟草甲LsCLIP1和LsCLIP2基因的cDNA全序列,其开放阅读框长度均为1 194 bp,编码397个氨基酸。序列分析显示,其氨基酸序列各自具有一个clip结构域和胰蛋白酶结构域。系统发育分析表明,CLIP1和CLIP2都属于subfamily C CLIPs。qPCR结果表明,LsCLIP1和LsCLIP2基因在所检测的各发育阶段和幼虫各组织中均有表达,分别尤以蛹期和表皮中表达量最高;经20E和肽聚糖诱导后,烟草甲幼虫体内LsCLIP1和LsCLIP2基因的表达量明显提高。【结论】推测LsCLIP1和LsCLIP2可能参与了烟草甲的蜕皮发育和对免疫胁迫的应激响应。本研究将为后续研究昆虫CLIPs的分子调控提供参考。     

南亚实蝇鞣化激素基因的克隆与表达分析

【目的】克隆南亚实蝇Zeugodacus tau鞣化激素基因,分析其分子特征及时空表达模式,为探索其生理功能奠定基础。【方法】利用同源克隆和RACE技术从南亚实蝇刚羽化成虫中克隆鞣化激素基因bursicon-α和bursicon-β的全长cDNA序列,并用邻接法(neighbor-joining method)与其他昆虫同源序列构建系统发育进化树。利用荧光定量PCR技术检测这两个基因在南亚实蝇不同发育阶段(卵、1-3龄幼虫、预蛹、蛹和刚羽化成虫)的表达特性。【结果】克隆获得南亚实蝇鞣化激素基因bursicon-α(GenBank登录号:MH421861)和bursicon-β(GenBank登录号:MH421862)。bursicon-α基因开放阅读框为551 bp,编码183个氨基酸;bursicon-β基因开放阅读框为467 bp,编码156个氨基酸。基于两个鞣化激素基因的氨基酸序列的系统发育树分析显示,南亚实蝇Bursicon-α与Bursicon-β均与瓜实蝇Zeugodacus cucurbitae的同源蛋白亲缘关系最近,且与其他双翅目昆虫的同源蛋白聚为一类,形成独立的分支。荧光定量PCR结果表明,两个基因在南亚实蝇各龄期均有表达,均在第5天蛹和刚羽化成虫翅伸展时期表达量最高。【结论】bursicon-α和bursicon-β基因在南亚实蝇不同发育阶段表达量不同,推测其在南亚实蝇成虫表皮鞣化和翅的形成中发挥着重要作用。本研究为进一步探索鞣化激素在南亚实蝇生长过程中表皮的骨化、翅的重建等方面的功能机制奠定了基础。     

沙葱萤叶甲保幼激素结合蛋白基因GdJHBP的克隆及表达分析

【目的】克隆沙葱萤叶甲Galerucadaurica保幼激素结合蛋白基因(Juvenilehormonebinding protein,JHBP)cDNA全长序列,分析其分子特征和表达特性,为进一步明确其在沙葱萤叶甲生长发育及滞育中的作用奠定基础。【方法】基于本实验室组装的沙葱萤叶甲转录组数据库,采用RACE技术,克隆沙葱萤叶甲GdJHBP基因cDNA全长序列;运用ORF Finder、SignaIP、DNAMAN和TMHMM等软件分析其分子特征;利用MEGA6.0软件中的邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统发育树;应用荧光实时定量PCR(RT-qPCR)技术分析GdJHBP在沙葱萤叶甲不同发育时期、成虫不同组织及高温胁迫下的表达模式。【结果】克隆获得了沙葱萤叶甲保幼激素结合蛋白基因GdJHBP cDNA全长序列(GenBank登录号:MG460309),cDNA全长为826 bp,开放阅读框(ORF)为714 bp,编码237个氨基酸;蛋白质预测分子量为26.58ku,等电点为4.37;包含1条信号肽,无跨膜区,且在第27-189位氨基酸之间存在一个保幼激素结合蛋白家族JHBP保守结构域。序列比对分析表明,不同昆虫JHBP间氨基酸序列一致性较低,沙葱萤叶甲GdJHBP与棕榈象RhynchophorusferrugineusRfJHBP和马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata JHBP 3p2的氨基酸序列一致性最高也仅为30%。系统发育分析表明,GdJHBP与棕榈象血淋巴JHBP亲缘关系最近。RT-qPCR结果显示,GdJHBP在沙葱萤叶甲不同发育阶段均有表达,在幼虫期表达量最高,在卵和蛹期微量表达;在成虫滞育期间低表达,在滞育前与滞育结束后则有较高表达;在成虫发育过程中,头部的表达量显著低于腹部和胸部;高温(30-40℃)可诱导GdJHBP上调表达,在35℃时表达量达到最高值。【结论】沙葱萤叶甲GdJHBP属于血淋巴JHBP,在沙葱萤叶甲生长发育和成虫夏滞育中可能发挥着重要作用。     

沙葱萤叶甲表皮蛋白基因的鉴定及表达谱分析

【目的】表皮蛋白是昆虫体壁的主要组成部分,在昆虫生长发育中起着重要的作用。本研究旨在鉴定沙葱萤叶甲Galeruca daurica表皮蛋白基因,分析其表达模式,以期为进一步研究其在沙葱萤叶甲生长发育中的作用提供必要的基础。【方法】根据本实验室组装的沙葱萤叶甲转录组测序数据,应用生物信息学方法鉴定表皮蛋白基因全长开放阅读框(ORF);采用RT-qPCR技术测定鉴定的8个表皮蛋白基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段和3龄幼虫不同组织(头部、体壁、消化道和脂肪体)中的表达谱。【结果】基于转录组数据鉴定到8条沙葱萤叶甲表皮蛋白基因的开放阅读框(ORF)全长序列,命名为GdauCP1-8(GenBank登录号: MN629000-MN629007),ORF长417~810 bp,编码138~269个氨基酸,预测分子量为15~28 kD,等电点pI为4.45~8.62;具有16~20个氨基酸的信号肽;GdauCP1具有典型的跨膜结构,其余7个GdauCP蛋白无跨膜结构。同源序列比对和系统发育分析表明,GdauCP3与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata CP的氨基酸序列一致性最高,为60.00%;其余的GdauCPs与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera CP的氨基酸序列一致性最高,为58.52%~80.00%。GdauCP1-4属于RR-2亚家族,GdauCP5-7属于RR-1亚家族,GdauCP8的亚家族归属未确定。RT-qPCR分析表明,8个GdauCP基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段及3龄幼虫不同组织内均有表达,且表达量存在显著差异。GdauCP2, GdauCP4, GdauCP5和GdauCP6在1龄幼虫期高表达,GdauCP3, GdauCP7和GdauCP8在蛹期高表达,GdauCP1在3龄第3天幼虫期高表达;除GdauCP2在成虫中表达水平较高外,其他GdauCP基因在成虫中的表达水平均很低。GdauCP1在头部和体壁中高表达,GdauCP2和GdauCP8在脂肪体中高表达,GdauCP3, GdauCP4, GdauCP6和GdauCP7在消化道中高表达,而GdauCP5在体壁中高表达。【结论】8个GdauCP基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段和组织间差异表达,且表达模式不同,意味着不同GdauCP可能具有不同的功能。     

棉铃虫漆酶2基因的分子鉴定

【目的】黑化反应在昆虫表皮骨化以及免疫防御过程中起着重要作用, 酚氧化酶是黑化反应中的关键酶类, 漆酶2 (laccase2, LAC2)是酚氧化酶的一种, 在昆虫变态发育和免疫系统中起着重要的作用。本研究旨在探讨LAC2在棉铃虫Helicoverpa armigera表皮骨化中表达模式及激素调控作用。 【方法】采用PCR及RACE的方法, 从棉铃虫5龄幼虫中得到了lac2 cDNA全序列。利用荧光定量PCR、 激素处理及RNA干扰方法, 对LAC2的表达模式差异和激素调控作用进行分析。【结果】序列分析表明, lac2 cDNA全长3 221 bp, 编码框长度为2 268 bp, 编码756个氨基酸残基。发育时序表达分析发现, lac2在幼虫各龄期表达规律相似, 均在蜕皮期高水平表达, 在5龄96 h转录水平达到最高峰。组织表达结果分析, lac2基因在幼虫表皮和成虫卵巢以及触角表达量较高。激素处理实验发现, 保幼激素类似物（methoprene）对lac2基因转录有抑制作用; 蜕皮激素（20-hydroxyecdysone）则促进其表达。进一步利用RNA干扰蜕皮激素受体EcR （ecdysone receptor）和USP （ultraspiracle isoform）基因发现, 干扰后蜕皮激素受体的表达明显受到抑制, 同时lac2基因的表达也显著受到抑制, 表明蜕皮激素调控lac2基因转录。【结论】这些结果为进一步研究漆酶在昆虫表皮的骨化以及免疫防御等方面不同的生理功能提供理论依据。     

松墨天牛OBP基因MaltOBP2和MaltOBP6的克隆、序列分析及组织表达谱和原核表达研究

【目的】本研究旨在探索松墨天牛Monochamus alternatus Hope在嗅觉识别寄主植物过程中扮演重要角色的气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)的结构及功能。【方法】利用生物信息学方法对得到的Malt OBP2和Malt OBP6基因序列和蛋白结构进行分析,并通过实时荧光定量PCR分析Malt OBP2和Malt OBP6在松墨天牛雄虫不同组织和时空中的表达差异,利用p ET32a(+)原核表达载体对Malt OBP2和Malt OBP6进行了诱导蛋白表达。【结果】本研究得到两个松墨天牛气味结合蛋白基因——Malt OBP2(Gen Bank登录号:KP120891)和Malt OBP6(Gen Bank登录号:KP120892),ORF长度分别为402 bp和408 bp,翻译的氨基酸序列均含有4个保守的半胱氨酸位点,表明得到的两个OBP基因的编码蛋白均属于Minus-C OBP亚家族;推导的两个OBP蛋白均有6个α螺旋区域,且α螺旋区域在两个蛋白的位置非常相似,但是两个OBP蛋白推测的配体结合位点和位点极性却完全不同。组织表达模式表明,Malt OBP2和Malt OBP6在成虫头部、触角、下颚(唇)须、腹部末端和足中均有表达,表达程度不一,但都在头部显著表达,触角中的表达量相比其他组织中较低或只是持平。发育表达结果表明,Malt OBP2在蛹触角中的表达量最高,而Malt OBP6在幼虫头部的表达量最高。本研究成功构建了原核表达载体p ET32aMalt OBP2和p ET32a-Malt OBP6,并进行了OBP蛋白诱导表达,低温(16℃和20℃)条件利于蛋白表达在上清液中,延长诱导表达时间(12 h)可以增加蛋白的表达量。【结论】本研究从松墨天牛体内得到了Minus-C OBP蛋白亚家族的两个基因Malt OBP2和Malt OBP6,通过配体结合位点推测它们具有不同的生理功能;通过组织表达谱结果推测这两个OBP基因在松墨天牛中的功能不仅仅局限于嗅觉识别,或还有味觉感受、化学感受等其他生理功能。本研究结果为两个OBP蛋白的结构和功能研究奠定了基础,为探索松墨天牛的化学感受机制提供了条件。     

苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶cDNA的克隆、序列分析及原核表达

【目的】本研究旨在从苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca中肠克隆出丝氨酸蛋白酶（serine protease, SP）基因的cDNA序列,测定原核表达后的蛋白经纯化及复性后的活性。【方法】运用RT-PCR和cDNA末端快速扩增方法（rapid amplification of cDNA ends, RACE）克隆苜蓿夜蛾幼虫中肠丝氨酸蛋白酶cDNA全序列,用大肠杆菌Escherichia coli表达系统进行表达。重组蛋白经纯化后,利用梯度透析法进行复性,以BApNA为底物,进行活性测定。【结果】克隆获得的苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因命名为HvSP（GenBank登录号：JX866720）,该基因全长880 bp,开放阅读框长762 bp,编码254个氨基酸,推测分子量和pI值分别为26.9 kDa和9.49。由HvSP推导的氨基酸与鳞翅目昆虫SP氨基酸序列的一致性在52%~95%之间,其中与棉铃虫Helicoverpa armigera SP（GenBank登录号：CAA72962）的氨基酸序列一致性最高,达95%。成功构建重组载体pET21b-HvSP进行原核表达,Western-blot鉴定确定为目的蛋白。蛋白可溶性分析发现重组蛋白为包涵体。在Glycine-NaOH缓冲液中,当pH为10.0时,复性的重组蛋白活性达到最高,为35.74 U/mL。【结论】本研究在苜蓿夜蛾体内获得了一个新的丝氨酸蛋白酶基因,且原核表达后的重组蛋白经过变性、纯化及复性后具有活性。该结果为进一步研究丝氨酸蛋白酶在鳞翅目昆虫体内的生理功能奠定了基础。     

冷驯化对松墨天牛幼虫脂代谢的影响

【目的】在低温环境下,昆虫会启用体内的生理调控机制稳定自身代谢,脂肪代谢在昆虫抵御低温的过程中发挥重要作用。本研究旨在探究松墨天牛Monochamus alternatus幼虫脂肪代谢在低温条件下的变化及其对耐寒性的影响。【方法】将室内25℃下饲养的松墨天牛4龄幼虫分别置于25℃(对照)和4℃(冷驯化)恒温培养箱,7 d后解剖幼虫,收集其脂肪体,观察冷驯化后脂滴变化,测定脂肪体内脂肪含量;利用气相色谱 质谱分析,检测脂肪体内游离脂肪酸组分及含量;并用RT-qPCR方法检测脂肪体内脂肪酸β-氧化关键酶(CPT1, 4KCT, VLCAD, ECH和3HCD-1)基因的相对表达量。【结果】冷驯化(4℃)7 d后松墨天牛4龄幼虫脂肪体中脂滴较对照变小,密度降低,脂肪含量下降;但其脂肪酸组成种类未变,对照组和冷驯化组主要脂肪酸均为C16∶0, C16∶1, C18∶0, C18∶1和C18∶2,其中C18∶2的相对含量在两组中均最高,由未驯化时的31.83%±8.82%降至冷驯化后的25.16%±2.88%。冷驯化后,松墨天牛4龄幼虫脂肪体中C16∶0,C16∶1和C18∶2脂肪酸含量减少,C18∶0与C18∶1的相对含量上升。在5种主要脂肪酸中,冷驯化后各脂肪酸的相对丰度较对照均有所减少,其中C16∶0, C16∶1及C18∶2的相对丰度则显著下降。但冷驯化后松墨天牛4龄幼虫脂肪体中游离脂肪酸的双键指数较对照上升3.88%。且冷驯化组脂肪体中VLCAD基因表达量较对照组显著上调。【结论】低温环境中松墨天牛幼虫通过消耗脂肪维持基本代谢,幼虫脂肪体的脂肪酸分解代谢水平提高;不饱和脂肪酸在松墨天牛的耐寒性中起关键作用。脂代谢调控为松墨天牛应对低温的重要生存策略。     

Molecular cloning and characterization of a cDNA encoding a novel cuticle protein from the Chinese oak Silkmoth, Antheraea pernyi.

In our research to identify gene involved in the cuticle protein, we cloned a novel cuticle protein gene, ApCP13, from the Chinese oak silkmoth, Antheraea pernyi, larvae cDNA library. The ApCP13 gene encodes a 120 amino acid polypeptide with a predicted molecular mass of 13 kDa and a pI of 4.01, and is intron-less gene. The ApCP13 contained a type-specific consensus sequence identifiable in other insect cuticle proteins and the deduced amino acid sequence of the ApCP13 cDNA is most homologous to another wild silkmoth, A. yamamai CP12 (86% protein sequence identity), followed by Bombyx mori LCP18 (35% protein sequence identity). Northern blot analysis revealed that the ApCP13 showed the epidermis-specific expression. This is the first report of cuticle protein gene in the wild silkmoth, A. pernyi.     

携带与未携带松材线虫的松墨天牛转录组差异表达基因分析

【目的】本研究旨在建立携带与未携带松材线虫Bursaphelenchus xylophilus的松墨天牛Monochamus alternatus成虫各组织的转录组数据库,揭示松墨天牛对松材线虫响应的转录组整体表达特征。【方法】以携带和未携带松材线虫的松墨天牛成虫的表皮、气管和脂肪体为材料,采用Illumina HiSeq TM 2000测序平台开展转录组测序,利用Trinity软件对RNA-Seq数据进行从头组装,利用NCBI数据库进行基因注释。通过DEG-Seq分析携带和未携带松材线虫的松墨天牛成虫中的差异表达基因,对上调表达基因进行GO和KEGG代谢途径富集分析,并通过实时荧光定量PCR技术对部分差异表达的基因包括ENV,CDK1,HSP70-C,HSP70,HSP75,DUO,PABPN1和IGFP基因的表达水平进行验证。【结果】测序过滤后共获得55059条单基因簇(unigene),平均长度为1536 bp。将unigene与数据库中的序列进行BLASTX比对,成功注释24354条unigenes,其中4022条unigene在GO数据库中获得注释,6098条unigene在KEGG数据库中获得注释。经过GO与KEGG富集分析显示,松墨天牛成虫携带松材线虫后,差异表达基因主要为与其气管中压力调节、组织与DNA修复、激素响应方面相关的基因。实时荧光定量PCR分析结果显示CDK1,HSP70,HSP75,DUO,PABPN1和IGFP基因的表达量在携带松材线虫的松墨天牛气管中相比未携带松材线虫的松墨天牛气管中的显著上调。【结论】本研究初步阐明松墨天牛携带松材线虫后转录组的整体表达模式,为进一步研究松墨天牛的基因功能及对松材线虫的胁迫响应过程奠定了基础。     

松墨天牛成虫雌雄体型差异及蛹和成虫大小与越冬幼虫体重的关系

【目的】本研究旨在明确松墨天牛 Monochamus alteratus 成虫及越冬幼虫体型大小的差异,探讨该虫越冬后成虫体型大小和越冬幼虫体重大小关系及原因。【方法】于2014年5月1日至10月31日在浙江富阳野外诱捕松墨天牛,通过测量野外诱捕到的松墨天牛成虫体长、体宽,确定林间松墨天牛成虫体型的差异;松墨天牛越冬幼虫的采集和称重测量明确越冬幼虫的组成和体重大小差异;进而通过对越冬幼虫单头跟踪饲养至化蛹、羽化,确定越冬幼虫体重大小与发育所得蛹和成虫大小的关系,阐明林间松墨天牛成虫体型差异的原因。【结果】浙江富阳野外诱捕发现,松墨天牛的活动期间很长,从5月中旬到10月初一直能诱捕到松墨天牛成虫,高峰期在6和7月份。松墨天牛雌雄成虫体型差异很大,雌虫平均体长和体宽分别为20.59±0.19和6.59±0.06 mm;雄虫平均体长和体宽分别为19.90±0.26 和6.44±0.08 mm; 雌虫的平均体长明显高于雄虫,但二者体宽没有显著差异;并且雌雄成虫体长和体宽呈显著正相关。越冬幼虫的头宽测定表明头宽的变化很大,最小为2.20 mm,最大为4.24 mm,经比对越冬幼虫由4龄和5龄幼虫组成;幼虫体重差异大,平均体重为304.2 mg, 介于71.6~858.0 mg之间,其中5龄越冬幼虫显著重于4龄越冬幼虫。进一步将越冬幼虫单管饲养跟踪研究发现,越冬幼虫体重大小决定蛹和羽化后的成虫的大小,二者存在显著的正相关,并且由4龄越冬幼虫发育所得的蛹和成虫显著轻于由5龄幼虫发育所得的蛹和成虫。【结论】松墨天牛成虫体型差异很大,这与越冬幼虫体重差异相关;越冬幼虫的体重大小决定了其化蛹后的蛹重和羽化后成虫的体型和体重的大小;造成越冬幼虫体重差异的可能原因包括松墨天牛成虫扬飞周期长导致的产卵期长而使得天牛发育进度不一致以及寄主不同部位营养的差异。     

家蚕Wnt信号通路下游关键基因Pangolin转录剪接体X3的克隆和分析

【目的】克隆家蚕Bombyx mori Wnt信号通路下游关键基因Pangolin isoforms A/H/I/S转录剪接体X3 (Pangolin X3),分析其序列和表达特征。【方法】从NCBI数据库检索家蚕Pangolin X3,根据其编码序列(coding sequence, CDS)设计引物,利用PCR从家蚕幼虫中肠和血淋巴中进行克隆并测序验证。利用SilkDB 3.0, SMART,多序列比对和系统发育树分析Pangolin X3的序列特征。利用qRT-PCR分析Pangolin X3在家蚕5龄第3天幼虫不同组织(头、血淋巴、体壁、性腺、中肠、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺、脂肪体和马氏管)中的相对表达水平。【结果】从家蚕幼虫中肠和血淋巴克隆了Pangolin X3(GenBank登录号：XM＿038020921)的CDS,其开放阅读框长1 560 bp,编码519个氨基酸残基,预测分子量为55.86 kD,预测等电点为7.53。Pangolin X3蛋白含有保守的β-catenin结合位点和HMG结构域,其氨基酸序列在不同的昆虫中比较保守,特别是与DNA结合的HMG结构域...     

荒漠昆虫小胸鳖甲Ras GTP酶激活蛋白基因 MpRasGAP 的克隆及低温表达分析

【目的】丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinase, MAPK)级联是细胞的重要信息传递系统之一,Ras GTP酶激活蛋白（Ras GTPase-activating protein, RasGAP）基因 RasGAP 和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）基因 JNK 分别是MAPK信号转导途径的上、下游基因。本研究旨在确定荒漠昆虫小胸鳖甲 Microdera punctipennis RasGAP 及 JNK 基因对低温的响应情况。【方法】从荒漠甲虫小胸鳖甲中克隆获得 RasGAP 基因的cDNA序列,利用生物信息学分析软件分析其氨基酸序列并构建进化树,利用实时荧光定量PCR检测低温胁迫条件下 RasGAP 和 JNK 基因的表达情况。【结果】小胸鳖甲RasGAP cDNA的开放阅读框2 523 bp,命名为 MpRasGAP （GenBank登录号：KM677930）,编码840个氨基酸,分子量96.594 kDa,编码蛋白MpRasGAP属于RasGAP超家族。MpRasGAP与赤拟谷盗 Tribolium castaneum RasGAP的氨基酸序列一致性达89%。小胸鳖甲在4℃和-4℃低温胁迫1 h后,MpRasGAP 的mRNA水平都显著高于室温对照（25℃）。小胸鳖甲在4℃处理3 h或-4℃处理1 h后, MpJNK 的mRNA水平也显著升高。【结论】本研究结果表明小胸鳖甲MpRasGAP 和 MpJNK 的mRNA水平受低温诱导。研究结果有助于深入研究荒漠昆虫在低温下MAPK信号转导途径的作用机制。