红细胞血影介导7sRNA对大鼠肝癌细胞(CBRH-7919)DNA复制、转录和甲胎蛋白合成的影响

本文总结了用红细胞血影介导正常肝7sRNA进入肝癌细胞的定位及其对细胞DNA复制、转录和蛋白合成的影响。装载~(125)I-78RNA的血影与肝癌细胞融合后,放射自显影标本显示7sRNA在细胞内的分布,主要定位于细胞质,也有见于细胞核内。7sRNA进入细胞后对细胞的DNA复制、转录和蛋白合成有抑制作用。免疫荧光和免疫沉淀法检测肝癌细胞甲胎蛋白合成的结果表明,7sRNA导入晚G_1期同步细胞后继续培养4小时,甲胎蛋白合成减少。由于细胞DNA复制和转录被抑制,在一定程度上影响了甲胎蛋白基因的表达。     

丁酸钠对大鼠肝癌细胞(CBRH—7919)的增殖和甲胎蛋白合成的影响

本文报道丁酸钠对大鼠肝癌细胞(CBRH—7919)的形态、生长和甲胎蛋白合成产生的影响。5mM丁酸钠作用24小时后,细胞体积增大,形态改变呈现上皮样;细胞生长率降低;~3H-TdR脉冲标记细胞,显示细胞的标记指数明显下降;扫描电镜观察细胞的表面形态,结构特点近似于这株细胞的G_1期,说明细胞生长受抑制与细胞被阻止在G_1期有关。此时,免疫荧光和免疫沉淀方法显示细胞内合成的甲胎蛋白受抑制。除去丁酸钠作用后,细胞的形态和生长率恢复,甲胎蛋白合成增多,表明CBRH-7919细胞的甲胎蛋白合成能力与细胞的增殖分裂有平行关系,丁酸钠通过控制细胞周期进程抑制细胞的增殖,可以调节肝癌细胞的甲胎蛋白合成。     

丁酸钠对M期同步的HeLa细胞的阻断效应

5mM的丁酸钠对M期的同步的HeLa细胞主要阻断在早G_1期,并且给药后立即发挥阻断效应,9小时以内完全阻断在早G_1期,9小时以后有少量细胞进入中、晚G_1期及S期。早G_1细胞进入中、晚G_1期的中位数时间,5mM丁酸钠处理组比对照组长4倍,G_1期进入S期的速率完全是由早G_1期进入中、晚G_1的速率所决定的。看来丁酸钠的主要作用点是阻断和大大减缓早G_1期向中、晚G_1的进入。     

P15INK4B高表达对人黑色素瘤细胞G1/S进程的阻滞及与MAPK信号相关性之初探

利用TdR-N_2O同步法分别获得P15高表达的MLIK6和表达空载体的MLC2的M期细胞和G_1期细胞,~3H-TdR掺入结果显示,与对照组细胞MLC2相比,实验组细胞MLIK6从G_1期进入S期时间延长2h,并且掺入强度明显减弱,DNA合成被抑制。进一步观察了P15~(INK4B)对G_1/S相关调控蛋白的影响,在M期细胞释放8h(晚G_1期细胞)后,与对照组MLC2细胞相比,实验组MLIK6细胞中CyclinD1,CyclinE,Cdk4,C-Myc蛋白水平均降低。相反,P27~(KIP1)的表达却上升。同时探讨了MAPK信号在P15~(INK4B)阻抑A375细胞G_1/S转换中的作用与相关性,结果显示晚G_1期的MLIK6细胞中ERK1,ERK2水平变化不大,而具有活性的P-ERK1和P-ERK2均表现出下降。上述实验表明,P15~(INK4B)可能通过作用于G_1期相关的周期调节蛋白和抑制ERK1和ERK2活性,阻滞G_1/S转换与抑制DNA合成。     

HPD在胃癌细胞各时相中的转运分布和损伤部位的关系

本文探讨了HPD衍生物加红光对人胃低分化腺癌MGC 80-3细胞不同周期的生物学效应。我们观察到HPD的转运与分布决定于细胞周期。G_1期在30分至60分钟内HPD从膜转运至胞质;S、G_2期则直接进入胞质的不同部位;而M期在核部位弥散分布。同步化细胞经HPD加红光处理后,引起细胞大量光敏杀伤,S与G_1期较明显,而M期光敏性最小。我们还观察到:不同周期细胞HPD的分布和HPD的光敏损伤部位密切相关。核仁对HPD的选择性结合也很明显。     

肝癌细胞与内皮细胞的粘附力学特性研究

采用细胞同步技术和微管吸吮技术,从细胞周期的角度研究不同细胞周期肝癌细胞(hepatocellularcarcinoma cells,HCC)与脐静脉内皮细胞(HUVEC)的粘附力学特性。结果表明,未同步化肝癌细胞各周期时相的细胞百分比为:G_0/G_1期,53.51％;G_2/M期,11.01％;S期,35.48％。采用胸腺嘧啶脱氧核苷、秋水仙碱顺序阻断和胸腺嘧啶脱氧核苷双阻断后释放培养的方法可分别获得G_1期和S期的肝癌细胞,其平均同步率分别为69.02％和96.50％。G_1期肝癌细胞与人脐静脉内皮细胞的粘附力比S期相应值明显降低(P<0.01),与未同步化肝癌细胞组比较也得到同样结果,而S期与未同步化肝癌细胞组的粘附力值无明显差别。肝癌细胞与脐静脉内皮细胞的粘附力随着粘附时间的变化而变化,在30～60min内迅速增长,60min之后维持在较稳定的水平,即300×10~(10)N左右。提示:在肝癌细胞与内皮细胞的粘附过程中,S期细胞可能起的作用更大;肝癌细胞和内皮细胞上粘附分子表达呈现时间效应,从而体现出粘附和去粘附的行为特征。     

微管解聚对生长因子在DNA合成中的作用

本实验探讨了生长因子和胞质微管在刺激G_0期C3H/10 T1/2细胞进入S期合成DNA中的作用及其相互关系。结果表明,PPP(pla- telet-poor plasma)不具有刺激DNA合成的能力,浓度在30ng/ml以上的EGF仅能刺激部分G_0期细胞进入S期,而50ng/ml EGF与5%PPP共同作用时,则表现出它们间具有较强的协同剌激作用,其刺激DNA合成的效果基本上达到与10%血清相同。Taxol可抑制微管的解聚,G_0期细胞经其处理后,使微管处于稳定状态时能明显抑制血清或EGF+PPP对细胞合成DNA的刺激作用。这种抑制作用在G_0期细胞进入S期的早期阶段即表现出来,说明只有生长因子的刺激作用而无微管的解聚,细胞便不能从G_0期进入S期。G_0期细胞经秋水仙酰胺处理使微管解聚后,则能提高血清或EGF+PPP对DNA合成的刺激作用。同样地,这种刺激作用也在G_0期细胞进入S期的早期阶段即表现出来。但秋水仙酰胺单独处理G_0期细胞,虽使微管处于解聚状态,若无生长因子存在,则无刺激作用,G_0期细胞便不能进入S期。因此,生长因子之间的协同刺激作用和微管的解聚是G_0期C3H/10 T1/2细胞进入S期进行DNA合成的两个必要条件。     

竹红菌甲素对体外培养细胞光敏作用的实验研究

本文用免疫荧光细胞化学、流式荧光分析等方法研究了光敏剂H_A对培养的HeLa细胞的光敏化作用。结果表明,H_A光敏化作用使细胞形态发生变化,细胞表面微绒毛丧失,细胞增殖受到抑制,上述变化随光照剂量增加而加剧,其中对肿瘤细胞的抑制作用较正常二倍体细胞更大,细胞群体中G_1期细胞下降,S期细胞增多。H_A的光敏化作用还使胞质微管变稀疏,微管中心的亮荧光近乎消失。以上实验说明,H_A的光敏作用对培养细胞的作用引起细胞膜、细胞骨架的损伤,使细胞周期部分阻断于S期,从而抑制了细胞的增殖。     

一种高效率细胞同步化方法的改良与运用

本实验改良了Rao的高压N_2O气阻断方法,获取高同步率和收获率的4个周期时相细胞,并进行了测定分析。将指数生长的细胞用过量TdR(2.5mmol/L)预处理后,放在新设计的高压罐内,并直接将罐放入恒温箱内,经高压N_2O气处理,细胞被阻断在有丝分裂中期。收集M期细胞在37℃下孵育释放2小时,细胞即可进入G_1期;在中G_1期再次用过量TdR处理与释放,于不同时间分别收集S期与G_2期细胞。各时相细胞通过膜表面ConA受体再分布也表现进显著的时相差异性。每个时相细胞均能继续贴壁生长,活力高,适于各种相关实验研究。     

钙调素抑制剂——三氟拉嗪对肿瘤细胞增殖和微管组装的影响

本文用钙调素抑制剂——三氟拉嗪处理人胃癌MGC-803细胞,用免疫荧光细胞化学方法,放射免疫法和速流荧光分析等方法研究了钙调素对细胞增殖,环核苷酸代谢及微管组装,有丝分裂等细胞功能的调节作用。实验结果表明,TFP明显地抑制了人胃癌细胞的增殖,这种抑制增殖的作用,具有剂量和时间依赖关系,细胞群体中G_1期细胞增多,S期细胞下降,DNA合成明显地受到抑制。TFP处理的胃癌细胞仅在短时间内(5'-30')cAMP含量升高,cGMP浓度降低,cAMP/ ??cGMP比值比对照组高4.4倍,但此后环核苷酸含量又很快恢复到对照组水平。本实验还观察到TFP处理后的MGC-803细胞胞质铺展,细胞形态的改变与胞质微管的分布有密切联系,实验结果表明TFP加强了人胃癌细胞MTOC对微管的组装能力,使微管分布得到恢复,微管纤维呈放射状延伸到细胞边缘,充满胞浆,使细胞呈现出展平的多边形,趋向于正常上皮细胞形态的变化,本实验结果表明TFP抑制癌细胞增殖及使微管组装加强可能是通过对CaM活性的抑制作用。此结果有助于说明转化细胞内钙调素的变化,可能是与转化细胞增殖失控和胞质微管消退有关。     

人胃癌不同周期细胞膜表面ConA受体的分布与侧向运动

本文研究了人胃低分化粘液性腺癌细胞MGC 80-3不同周期时相中ConA受体的分布与侧向运动。MGc 80-3细胞经同步化培养,用F-ConA标记。被标记细胞中G_1、S和G_2期呈不连续的分布,但它们之间又存在显著的差异。M期呈较均匀的强荧光分布(与其它时相细胞比较)。荧光漂白恢复方法测定ConA受体复合物侧向运动表明:各个周期时相之间不仅运动方式不同,而且运动速率也有显著差异。M期与G_1期主要表现出扩散型运动;而S期与G_2期表现为流动型运动。G_1期的扩散系数大干M期的;S期的流动速率大于G_2期的。但可动分子百分比以G_2期最高。这些结果表明了ConA受体的动力学性质。它受到细胞周期的调节。     

B7-2胚胎性癌细胞与其分化细胞的周期特性

本文用~3H-thymidine标记B7-2EC细胞及其经HMBA诱导的分化细胞。根据连续标记和脉冲标记核百分率,计算和分析这两种细胞的细胞周期各时相特点。结果表明,未分化EC细胞的周期是18小时,其中G_1期1.7小时,S期13.6小时;分化细胞的周期是30小时,G_1期8.6小时,S期17.1小时。因此,B7-2分化细胞与未分化的相比,主要是G_1期和S期时相相应拉长。     

N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶Ⅲ,Ⅳ及Ⅴ在7721人肝癌细胞周期中的变化

为了研究N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶(GlcNAc-T)Ⅲ,Ⅳ和Ⅴ在细胞周期中的变化,采用血清饥饿法对7721人肝癌细胞进行同步化培养,用流式细胞仪(FCM)测定处于不同生长期的细胞比例,同时测定P34~(cdc2)激酶活性验证细胞周期。GlcNAc-TⅢ的活性在G_0/G_1期细胞的高峰时相较高,与该期的细胞百分比存在着明显的相关性(r=0.760,P<0.05),而GlcNAc-T Ⅴ活性的升高出现在G_2/M期细胞最多的时相,且与该期的细胞百分比间亦存有明显的相关性(r=0.868,P<0.001)。GlcNAc-T Ⅳ的活性改变与细胞周期关系不大。GlcNAc-T Ⅲ和GlcNAc-T Ⅴ在细胞周期中的变化呈现出相反的趋势(r=-0.951,P<0.001),提示GlcNAc-T Ⅲ可能与细胞分裂的静止有关,或者说是抗增殖的,而GlcNAc-T Ⅴ则可能与细胞的增殖有关。用免疫组化法发现GlcNAc-TⅤ的蛋白含量在整个细胞周期中无明显改变,与酶活性之间无相关性存在,故此酶在细胞周期中活性变化不是由酶蛋白合成改变而引起的。GlcNAc-T Ⅴ其活性在细胞周期中的变化与p34~(cdc2)激酶活性改变相一致(r=0.752,P<0.05),推测该酶的活性变化可能受到p34~(cdc2)激酶的调控。     

integrin β1在不同细胞周期肝癌细胞与内皮细胞粘附中的作用

探讨了integrin β1在不同细胞周期人肝癌细胞(SMMC-7721)上的表达和在肝癌细胞与人脐静脉内皮细胞粘附过程中的作用.未同步处理的肝癌细胞(对照组)各细胞周期时相百分比为G0/G1期53.51%、G2/M期11.01%、S期35.48%,采用胸腺嘧啶脱氧核苷、秋水仙碱顺序阻断和胸腺嘧啶脱氧核苷双阻断后释放培养的方法获得G1期和S期的肝癌细胞,其同步率分别为74.09%和98.29%.G1期肝癌细胞integrin β1表达的荧光强度较S期和对照组相应值明显降低.利用微管吸吮技术定量研究了肝癌细胞与内皮细胞之间的粘附力学特性,发现G1期肝癌细胞的粘附力值比S期相应值明显降低(P＜0.01),而S期的粘附力值与对照组比较无明显差别,integrin β1在肝癌细胞与内皮细胞粘附过程中的贡献约50%.结果提示胸腺嘧啶脱氧核苷和秋水仙碱能较好地将肝癌细胞同步于G1期和S期,integrin β1在SMMC-7721肝癌细胞上的表达水平呈现周期差异,在肝癌细胞与内皮细胞粘附过程中,S期细胞可能起的作用更大,integrin β1在这一粘附过程中起着重要作用.     

细胞周期及DNA损伤剂引起的细胞NAD含量变化及其意义

本文观察了FL细胞中ADP-核糖基转移酶(ADPRT)底物NAD含量的细胞周期性变化及其与DNA复制之间的关系。FL细胞NAD含最在G_1期最高,而在S期DNA合成高峰后0—3小时(S/G_2期)达到最低点。ADPRT抑制剂3 AB能够抑制NAD含量的细胞周期性变化,而且S期DNA合成亦受到抑制,并呈现S期延长,提示ADP-核糖基化作用可能参与DNA复制过程。本文还观察了三种DNA损伤剂MNNG、MMS及4NQO对处于细胞周期不同时相的FL细胞NAD含量的影响,以及ADPRT抑制剂3 AB及尼克酰胺对此影响的作用。证明ADPRT抑制剂可以特异地抑制DNA损伤性NAD含量下降而对正常FL细胞NAD含量及代谢抑制剂2,4-DNP所致的NAD含量下降没有影响。从而有可能建立一个以测量细胞内NAD含量为指标的简便、快速、特异的检测DNA损伤因子的方法。     

剑尾鱼卵子发生的的组织学观察

应用光学显微镜对卵胎生硬骨鱼类剑尾鱼(Xiphophorus helleri)卵巢的组织结构进行了观察。结果显示,剑尾鱼卵子的发育过程可划分为6个时相。Ⅰ时相的卵母细胞呈原始分化状态,细胞外具一层细胞质膜。Ⅱ时相卵母细胞外不仅具有质膜,而且还包绕一层滤泡细胞。Ⅲ时相和Ⅳ时相的卵母细胞分化明显,胞质内开始积累脂滴和卵黄颗粒。Ⅴ时相为成熟卵子,卵子的卵膜极薄,胞质内含有丰富的脂滴和卵黄。Ⅵ时相卵母细胞进入退化期,滤泡细胞从卵周向中央突入,卵黄被完全吸收,滤泡细胞自身也变得肥大。结果表明,剑尾鱼卵巢中的卵母细胞的发育是不同步的。     

剑尾鱼卵子发生的组织学观察

应用光学显微镜对卵胎生硬骨鱼类剑尾鱼(Xiphophorus helleri)卵巢的组织结构进行了观察。结果显示,剑尾鱼卵子的发育过程可划分为6个时相。Ⅰ时相的卵母细胞呈原始分化状态,细胞外具一层细胞质膜。Ⅱ时相卵母细胞外不仅具有质膜,而且还包绕一层滤泡细胞。Ⅲ时相和Ⅳ时相的卵母细胞分化明显,胞质内开始积累脂滴和卵黄颗粒。Ⅴ时相为成熟卵子,卵子的卵膜极薄,胞质内含有丰富的脂滴和卵黄。Ⅵ时相卵母细胞进入退化期,滤泡细胞从卵周向中央突入,卵黄被完全吸收,滤泡细胞自身也变得肥大。结果表明,剑尾鱼卵巢中卵母细胞的发育是不同步的。     

用双参数流式细胞光度术(FCM)研究阿克拉霉素对L_(1210)白血病细胞周期的影响

本文用双参数FCM技术,对同一个细胞的DNA和RNA含量进行相关测量,比较了ACM B对小鼠L_(1210)白血病细胞周期和RNA含量的影响.结果发现在一次给药后8小时可导致早、中期S的积累,并抑制S期细胞的DNA合成;到24小时DNA合成恢复正常,并进入G_2期,但由于G_2期细胞进入M期受阻,造成G_2期细胞的积累,这时被阻断在G_2期的细胞RNA含量显著增加,形成正不平衡生长,而给药剂量较大的实验组(1/1.5LD_(50))S期细胞的RNA含量不随着DNA含量的增加而增加,形成负不平衡生长,ACM A和ACM B对体内Li_(210)细胞周期作用相同.     

人肝癌细胞BEL-7402中热休克蛋白70相伴甲胎蛋白的实验研究

为研究人肝癌细胞BEL-7402中热休克蛋白70(HSP70)与甲胎蛋白(AFP)的相互作用,采用免疫化学和免疫荧光检测HSP70和AFP在肝癌细胞中的表达和定位.HSP70与AFP的相互关系通过免疫共沉淀和蛋白印迹杂交进行分析.结果免疫化学显示人肝癌细胞BEL-7402中存在高水平的HSP70和AFP共表达,均定位于细胞浆.AFP存在于HSP70单抗的免疫沉淀中,而HSP70则存在于AFP单抗的免疫沉淀中.结果表明人肝癌细胞BEL-7402中HSP70与AFP相伴.两者之间的相互关系研究将成为探讨肝癌的发生和免疫治疗的新途径.     

菹草类胡萝卜素提取物对人肝癌细胞QGY-7703凋亡的影响

分别用含10、20、40、60μmol/L的菹草类胡萝卜素提取物(CEPC)培养液处理人肝癌细胞(QGY-7703)48h、96h和144h,在这三个处理时间各剂量组对肝癌细胞的抑制率平均值范围分别为0.14%-23.07%、39.59%-70.61%和71.65%-87.01%。经10、20和40μmol/L的CEPC培养液处理肝癌细胞24h、48h和72h,用激光扫描共聚焦显微术(LSCM)观察细胞形态,出现了肝癌细胞数量明显减少,细胞体积缩小、皱缩变形,细胞核呈现“新月状”、条状甚至碎片状,细胞核中呈黄色的DNA面积较明显地减小等典型的凋亡细胞形态特征。以流式细胞术分析用CEPC处理肝癌细胞后各时相细胞的百分比,与对照组比较,用10μmol/L和20μmol/L浓度的CEPC处理肝癌细胞48h后,使细胞周期中的G_0/G_1期的细胞比例极显著增加(P<0.01),分别增加了23.8%和35.6%,而在G_2/M期没有明显的变化,在S期则相应减少。用LSCM测定了肝癌细胞内的Ca~(2 )浓度,与对照组比较,经20μmol/LCEPC处理48h后能引起细胞内Ca~(2 )浓度极显著上升(P<0.01),剂量组细胞内Ca~(2 )荧光强度为对照组的1.5倍。以上结果表明CEPC对人肝癌细胞QGY-7703的增殖具有明显的抑制作用,且在一定程度上呈时间-效应和剂量-效应依赖关系。在较短的时间内及使用较小的CEPC剂量能有效地诱导肝癌细胞凋亡,CEPC使肝癌细胞阻滞于G_0/G_1期发生凋亡。CEPC能极显著提高肝癌细胞内的Ca~(2 )浓度,提示Ca~(2 )浓度升高可能是CEPC诱导肝癌细胞发生调亡的重要原因。本项研究结果为进一步研究和开发菹草类胡萝卜素的功能和价值打下了重要基础。