致肾盂肾炎大肠杆菌粘附基因群的克隆及其抗血清的制备

以柯斯质粒pHC79为载体构建致肾盂肾炎大肠杆菌代表株E.coli J96染色体基因文库,获得两个能够表达粘附特性的重组柯斯质粒.进一步用鸟枪法亚克隆到载体pACYC184,得到三个阳性重组体.其中pCT10/E.coli K-12 p678-54能够稳定表达P菌毛和MRHA,分子量为14.6kb.用该克隆子免疫新西兰白兔,抗血清用带有载体质粒的受体菌(pACYC184/E.coli K-12 P678-54)吸收后,经菌毛粗提物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blotting和血凝抑制试验检测,其特异性仅针对致肾盂肾炎大肠杆菌的粘附基因群,可用于临床菌株的鉴定.     

氮源对重组大肠杆菌发酵产L-精氨酸的影响

考察有机氮源种类、蛋白胨用量以及(NH4)2SO4用量对重组E.coli发酵产L-精氨酸的影响.结果表明:以蛋白胨作为有机氮源且用量在10 g/L,( NH4 )2SO4用量在15 g/L时,摇瓶发酵产L-精氨酸产量最高,达到9.4g/L.在5L发酵罐进行补料分批培养,通过补加(NH4)2 SO4,L-精氨酸产量可以达到18.8 g/L,比未补加提高了108.9％.     

生长速度对β干扰素工程菌稳定性和产物表达的影响研究

为了研究发酵培养阶段生长速度对重组人干扰素β(hIFN-β)工程菌稳定性、菌体密度和干扰素表达的影响,采用日本LE．Marubishi MSJ-50L发酵罐,在发酵过程中于诱导后通过控制不同的补料速度,检测低和高生长速度及发酵结束后菌体密度、稳定性和重组人干扰素β的表达量。诱导后维持低生长速度,发酵结束后平均密度A600值为7．52,表达量达20．7％,质粒稳定率好,达到91％,粗制干扰素收获2．37克;维持高生长速度,发酵结束后平均密度A600值达20．57,而表达量降为4．13％,质粒稳定率降为27％,粗制干扰素收获仅为0．59克。诱导后生长速度对工程菌稳定性和产物表达有明显影响。     

大肠杆菌caiDE的基因克隆与表达

从E.coli MC4100菌体的染色体DNA中利用鸟枪法克隆含编码肉碱消旋酶及相关因子的caiDE基因片段,并经序列分析验证。由重组质粒pJX393亚克隆得到pDSW2重组表达质粒,后者转入E.coli BL21(DE3)菌株中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,在聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)上分子量为30kD和24kD附近可见明显的表达蛋白带。     

晚期糖基化终末产物与糖尿病血管并发症

晚期糖基化终末产物（AGEs）是蛋白质、脂质、核酸等大分子物质的氨基基团与葡萄糖或其他还原糖的醛基在非酶促条件下发生一系列反应生成的稳定的共价加成物。晚期糖基化终末产物（AGEs）通过直接修饰蛋白质、脂质、核酸等或者与其受体相互作用的方式诱导氧化应激反应,引起机体各类细胞发生增生、炎症、纤维化反应、形成血栓等,进而加速人体的衰老或导致多种慢性退化型疾病的发生。本文从糖尿病血管并发症的角度对晚期糖基化终末产物的形成过程、致病机制等予以综述。     

糖基化终末产物对3T3-L1脂肪细胞脂联素分泌的影响

目的糖基化终末产物(Advanced glycation end products,AGE)对3T3-L1脂肪细胞脂联素(adiponectin,APN)分泌的影响。方法3T3-L1小鼠前脂肪细胞体外培养并诱导分化为成熟的脂肪细胞,以PBS和BSA作为阴性对照,用含不同浓度梯度(50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml)AGE的培养液对成熟的脂肪细胞体外培养48h,收集细胞和上清液,用RT-PCR方法检测脂联素mRNA的表达,ELISA方法检测培养液中脂联素蛋白的分泌情况。结果AGE干预组脂联素的表达在mRNA和蛋白水平较对照组均明显下降(P<0.05),并且随着AGE浓度的升高脂联素的合成和分泌逐渐减少,其中100μg/ml、150μg/ml AGE干预组脂联素的减少较对照组有显著差异(P<0.001)。结论糖基化终末产物能够通过抑制3T3-L1细胞脂联素mRNA的合成,近而抑制脂联素的分泌,且这种抑制呈浓度依赖性。     

大肠杆菌半乳糖结合凝集素的提取纯化

采用琼脂糖凝胶CL-6B（Sepharose CL-6B）亲和层析以及Sephadex G-75凝胶分子筛等对大肠杆菌（Esche-richia coli,E.coli）半乳糖凝集素进行了纯化。结果显示,目标蛋白经简单的步骤即可以得到纯化,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及凝血实验证明纯化蛋白为E.coli半乳糖凝集素,蛋白提取回收率为11.4%。研究首次从E.coli蛋白提取液中分离得到纯的半乳糖凝集素,且此方法简单快捷,优越性明显。应用此方法将有利于微生物半乳糖凝集素的深入研究。     

MicroRNA参与调控睾丸支持细胞的增殖与粘附功能

精子发生过程需要生精细胞及睾丸体细胞的共同参与,这两种细胞也决定着睾丸的发育及雄性生育力。支持细胞是生精小管中唯一的体细胞,在正常精子发生过程中发挥重要的作用。支持细胞增殖与粘附功能的异常将导致精子发生异常,进而引发雄性不育。近年来研究发现,microRNA (miRNA)可调控支持细胞的增殖与粘附功能,其表达水平在激素、内分泌干扰素和营养状况等多种因素作用下发生特异性变化。本文总结了与睾丸支持细胞增殖与粘附功能相关的miRNA及其作用机制,以期发现并鉴定更多与支持细胞相关的miRNA,进而为探索与支持细胞相关不育症的病因提供理论依据。     

乳酸菌表面蛋白对免疫细胞的诱导增殖及粘附抑制效应

目的研究表面蛋白在乳酸菌体外粘附和激活免疫细胞中的作用。方法应用5mol/L氯化锂结合盐酸胍提取植物乳杆菌LpYZU09、干酪乳杆菌LcYZU02、鼠李糖乳杆菌LrGG、发酵乳杆菌LfYZU15及戊糖片球菌PpYZU32的表面蛋白,并分析提取物对乳酸菌粘附鼠肠上皮细胞、巨噬细胞和脾细胞的抑制作用及诱导增殖效应。结果表面蛋白对3种细胞粘附菌体均具有显著抑制效应,抑制作用具有细胞和菌株差异性,其中菌株LrGG表面蛋白对巨噬细胞粘附5种菌体普遍显示了较强的抑制作用,抑制率为38.7%~76.0%。不同菌株表面蛋白对肠上皮细胞的诱导增殖指数为0.05~0.35,对巨噬细胞为0.05~0.42,对脾细胞为0.02~0.40,诱导效应具有菌株和剂量依赖性,菌株LrGG的诱导增殖指数显著高于其他四种。结论乳酸菌表面的蛋白类因子在粘附和激活免疫细胞中发挥了重要作用。     

黄芩与止痢灵对大肠杆菌R质粒消除作用的研究

本研究从中药黄芩与止痢灵为质粒消除剂,用携带Ｒ质粒的多重耐药性大肠杆菌Ｅ．Ｏ１０株为靶细菌,进行了体外Ｒ质粒消除作用的实验研究。同时,观察了黄芩与止痢灵联合应用对Ｒ质粒消除的影响。实验结果表明：黄芩和止痢灵对大肠杆菌携带的Ｒ质粒具有消除作用。其消除率为２．４２％和２．１４％。从Ｒ质粒的消除表型来看：单用黄芩或止痢灵,绝大多数消除了表现为单一耐药性的丢失。黄芩和止痢灵联合应用,其消除率可提高至１８．１４％。而且细菌不仅表现为单一耐药性的丢失,还表现对ＳＭ＋ＴＣ,ＡＰ＋ＴＣ多重耐药性的丢失。     

糖基化终末产物（AGEs）诱导下SOCS基因在肾小管上皮细胞中的表达及意义

目的观察SOCS-1、SOCS-3在肾小管上皮细胞（HKC）中的基础表达及在糖基化终末产物（AGEs）诱导下的表达及意义。方法体外培养HKC细胞,随机分为正常对照组、AGEs组,倒置显微镜观察细胞形态学改变,采用流式细胞术,免疫细胞化学和检测SOCS-1、SOCS-3蛋白表达,RT-PCR法检测HKCSOCS-1、SOCS-3 mRNA表达。结果与正常组比较,AGES诱导的肾小管上皮细胞发生形态学改变;免疫细胞化学、流式细胞学发现SOCS-1、SOCS-3表达以胞浆为主,散在胞核表达;12、24、48hSOCS-1、SOCS-3蛋白表达AGEs组均高于正常对照组,差异有统计学意义,其中SOCS-1以12h表达量最大,SOCS-3以24h表达最高,RT-PCR检测SOCS-3 mRNA表达量,AGEs组高于正常组,差异有统计学意义。结论SOCS-1、SOCS-3在正常肾小管上皮细胞中有基础表达,AGEs可诱导肾小管上皮细胞SOCS-1、SOCS-3表达上调,为我们进一步研究SOCS基因与糖尿病肾病的关系提供了理论依据。     

晚期糖基化终产物对人脐静脉内皮细胞的肝细胞生长因子表达的影响

目的探讨晚期糖基化终产物(AGEs)对人脐静脉内皮细胞的肝细胞生长因子(HGF)mRNA及蛋白表达的影响。方法体外培养人脐静脉内皮细胞,予不同浓度(100mg/L、200mg/L、400mg/L)的AGEs刺激24h及400mg/LAGEs作用6h、12h、24h及48h,采用RT-PCR及免疫细胞化学法检测内皮细胞HGFmRNA及蛋白的表达水平。结果在一定范围内随着AGEs浓度增加,内皮细胞HGF表达逐渐增高;AGEs早期作用内皮细胞,促进HGFmR-NA及蛋白的表达,随着AGEs的持续作用,HGF表达减弱。结论随着AGEs作用时间的延长,HGF对受损内皮细胞的修复作用先增强后减弱。     

大肠埃希菌耐药性监测及耐药质粒的研究

为了解医院内感染大肠埃希菌的耐药情况,探讨其耐药发生、流行及传播机制,对从临床分离的32株大肠埃希菌进行了药敏试验、质粒图谱分析以及质粒接合、转化试验,结果表明大肠埃希菌对氨苄青霉素的耐药率＞88%,对庆大霉素的耐药率＞75%,其中28株大肠埃希菌检出质粒,均含有一条分子量为5.66 Mu的质粒带,是医院内感染大肠埃希菌的流行质粒.质粒的接合、转化试验证实了质粒具有横向传播的特点,是细菌产生耐药的主要原因.     

家蚕抗菌肽CM4对大肠杆菌超微结构影响的研究*(简报)

The effect of antibacterial peptide CM4 of Bombyx mori against E. coll K12 was investigated using scanning electron microscopy(SEM) and transmission electron microscopy (TEM). The ultrastructural changes of E. coli K12 were observed by the challenge of the purified antibacterial peptide CM4. The results showed that the antibacterial peptide caused a series of pathological changes on E. coli. SEM and TEM revealed aggregates of bacteria and SEM revealed wrin-kled bacterial surfaces in the early stage. Thereafter, plasmolysis was observed with irregular holes appearing in the two ends of bacteria and the cytoplasmic contents of the cells leaking out. Finally, bacteria became empty vesicles and disintegrated into small fragments subsequently. Comparatively, the bacterial membrane was normal and the bacterial structure remained intact in the control group.     

大肠杆菌cai DE的基因克隆与表达

从Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ４１００菌体的染色体ＤＮＡ中利用鸟枪法克隆含编码肉碱消旋酶及相关因子的ｃａｉＤＥ基因片段,并经序列分析验证,由重组质粒ｐｌＸ３９３亚克隆得到ｐＤＳＷ２重组表达质粒,后者转入Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中是丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导,在聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）上分子量为３０ｋＤ和２４ｋＤ附近可见明显的表达蛋白带。     

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) strains may carry virulence properties of diarrhoeagenic E. coli

To analyze whether Escherichia coli strains that cause urinary tract infections (UPEC) share virulence characteristics with the diarrheagenic E. coli (DEC) pathotypes and to recognize their genetic diversity, 225 UPEC strains were examined for the presence of various properties of DEC and UPEC (type of interaction with HeLa cells, serogroups and presence of 30 virulence genes). No correlation between adherence patterns and serogroups was observed. Forty-five serogroups were found, but 64% of the strains belonged to one of the 12 serogroups (O1, O2, O4, O6, O7, O14, O15, O18, O21, O25, O75, and O175) and carried UPEC virulence genes (pap, hly, aer, sfa, cnf). The DEC genes found were: aap, aatA, aggC, agg3C, aggR, astA, eae, ehly, iha, irp2, lpfA(O113), pet, pic, pilS, and shf. Sixteen strains presented aggregative adherence and/or the aatA sequence, which are characteristics of enteroaggregative E. coli (EAEC), one of the DEC pathotypes. In summary, certain UPEC strains may carry DEC virulence properties, mostly associated to the EAEC pathotype. This finding raises the possibility that at least some faecal EAEC strains might represent potential uropathogens. Alternatively, certain UPEC strains may have acquired EAEC properties, becoming a potential cause of diarrhoea.     

重组人钙调素的制备及其对细胞增殖作用影响的研究

用PCR方法获得人钙调素基因Ⅲ(hCaMⅢcDNA),将其插入表达载体pBV220,构建重组表达质粒hCaMⅢ/pBV220,阳性重组子在大肠杆菌DH5α中经温度诱导可高效表达CaM蛋白,经15%SDS-PAGE分析,可观察到一分子量与理论值相符(约17kD)的诱导表达条带.进一步分析表达产物的性质表明,CaM主要以可溶性形式表达.Westernblot结果证实,17kD的表达条带可与标准鼠抗CaMMcAb起特异反应.用Phenyl-SepharoseCL-4B疏水亲和层析法纯化重组菌超声上清表达产物,可获得纯度达95%以上的CaM,每1L菌液可获CaM纯品3～4mg.生物活性测定结果提示,rhCaM具有与标准人脑CaM(Sigma)同样的激活NAD激酶的活性.将K562细胞及SP2/0细胞分别接种于24孔或96孔培养板,加入不同浓度rhCaM、CaM拮抗剂三氟拉嗪(TFP),培养48h后,用MTI比色法检测细胞增殖状况.rhCaM在一定浓度范围内与细胞增殖率成显著正相关;CaM拮抗剂TFP可抑制细胞增殖.将rhCaM加入已受TFP抑制的细胞,可恢复正常的细胞增殖功能.     

核酶在大肠杆菌内对烟草花叶病毒靶RNA的切割作用

把一段取自TMV RNA的靶cDNA序列连接在一个体内表达转录载体内的报道基因CAT起译密码子ATG的下游组成了读码框不改变的CAT融合基因,通过测定载体在大肠杆菌内表达的CAT活力变化,观察了与CAT同时表达的核酶在体内对靶序列的作用。当专一核酶RZ1、RZ1A或RZ1表达时,CAT的酶活力下降了30%,但非专一核酶RZ3的表达并不改变CAT活力。凝胶电泳和引物延伸结果表明CAT活力的下降是由于这些核酶对融合CAT mRNA在5’靶序列区发生了专一切割从而影响了蛋白的合成所致。     

大肠杆菌合成的HBcAg转化为HBeAg的研究及其应用

37℃用1％β-巯基乙醇处理大肠杆菌HBcAg2小时,可使其全部转化成HBeAg。以常规ELISA方法不能检出HBcAg活性。该制品能被抗-HBe阳性血清特异中和。4℃以液体形式存放稳定,-20℃经过冻融活性下降。HBcAg转化成HBeAg后聚丙烯酰胺凝胶电泳行为有所改变。分别用转化的大肠杆菌HBeAg和血浆HBeAg作为酶联反应的诊断试剂,检测35份HBsAg阳性乙肝病人血清标本的抗-HBe,符合率为91.4％。同用Abbott-HBe(RIA)试剂盒测定的17份HBsAg阳性血清标本的试验结果比较,符合率为100％。说明转化的大肠杆菌HBeAg可代替血浆HBeAg作为检测抗-HBe的诊断试剂应用。