螺旋藻的纯化

观察了螺旋藻生长过程中藻丝和杂菌的生长规律,发现中性细菌和碱性细菌的数量始终是藻丝的10^5～10^6倍。采用常规的稀释平板法、毛细管法和挑单藻法均无法可靠地获得无菌纯藻。设计用低速离心法洗涤下沉性藻丝,用过滤法洗涤上浮性藻丝,对藻丝进行预处理洗去大量杂菌;对迁移性和非迁移性藻株分别采用夹层法和平板法纯化藻株,使得单根藻丝在平板上形成藻落,获得无菌纯藻。     

甘草内生细菌的分离及拮抗菌株鉴定

从乌拉尔甘草健康植株的根茎叶中共分离到内生细菌98株,经初步鉴定芽孢杆菌属（Bacillus sp.）为优势种群,约占30%;从不同生长年份甘草的根、茎、叶组织中分离内生细菌种群密度从5.0×10⁴ cfu/g～2.9×10⁷ cfu/g鲜重不等。采用平板对峙方法筛选出6株对植物病原菌有明显体外拮抗活性的菌株,通过菌落、菌体形态观察、生理生化反应及16S rDNA序列分析,同时结合Biolog细菌自动鉴定系统验证,鉴定这6株拮抗菌分属萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、Paenibacillus ehimensis。     

乳糖发酵短杆菌L－氨酸产生菌的选育

从谷氨酸产生菌Brevibacterium lactofermentum XQ5121出发选育L-苏氨酸产生菌。以硫酸二乙酯(Des)和甲基磺酸乙酯(Ems)诱变处理,用α-氨基-β-羟基戊酸(Ahv)和s－(2－氨基乙基)－L－半胱氨酸(Aec)药物平板及琥珀酸培养基(Sam)平板定向筛选,最后获得一株L－苏氨酸高产菌Zt－1株(AHV^г AEC^г SAM^g),可在适宜的培养条件下积累16mg／m1 L－苏氨酸。试验结果表明,在以琥珀酸为唯一碳源的平板培养基(sAM)上生长迅速即sAM 变异可导致L－苏氨酸积累大幅度提高。 文中对B.lactofermentum L-苏氨酸产生菌的选育机理作了讨论。     

颗粒厌氧污泥中的产氢产乙酸细菌研究

本文报道颗粒厌氧污泥中产氢产乙酸细菌的含量及存在方式。在正常运行状态,随着颗粒污泥的培养和生长、产氢产乙酸细菌含量维持在10⁷-10⁸个/ml.一旦厌氧反应器“酸化”,颗粒污泥性能变差,产氢产乙酸细菌急剧下降,减小到约10⁵个/ml.比正常状态低2-3个数级,说明细菌生长受到了不可逆抑制。电镜观察表明,产氢产乙酸细菌的分布不是随机的,它们以微菌落方式存在并排列有序。除了与甲烷短杆菌互营共生外,还发现了一种和甲烷丝菌间的新型互营共生关系,分析     

大豆斑疹病菌铁摄取因子PiuB在致病性中的作用分析

铁作为生命必需的基本元素,在细菌生长代谢过程中具有重要作用。然而,大豆斑疹病菌(Xanthomonas axonopodis pv. glycines, Xag)中编码铁摄取因子的piuB基因是否参与病原菌的铁摄取和致病性并不清楚。为解析PiuB的作用,采用同源重组策略获得了Xag的piuB基因缺失突变株(ΔpiuB),并对该突变株进行功能研究。研究表明：相较于野生型,突变株ΔpiuB在寄主大豆上的毒性和生长能力显著削弱;铁载体分泌量激增;对Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺和Mn²⁺的敏感性显著增强。此外,该突变株的H₂O₂抗性、胞外多糖产量、生物膜形成能力以及游动性等相较于野生型均显著减弱;添加外源Fe³⁺不能有效恢复ΔpiuB的上述特性;功能互补株可完全恢复ΔpiuB的缺陷性表型至野生型水平。这说明PiuB是Xag摄取Fe³⁺的潜在因子,并且是Xag在寄主大豆上致病所需的。     

西藏扎布耶盐碱湖细菌的多样性与分离菌株的生长特性

【背景】扎布耶湖位于青藏高原地区,是以水体中富含高浓度CO₃²⁻、HCO₃⁻和Na⁺为显著特性的盐碱湖,因其地理位置高寒、高海拔,人迹罕至,涉及该盐湖微生物的研究相对较少。【目的】系统探究湖水中细菌多样性和菌种资源等,发掘可利用的潜在菌种。【方法】采用Illumina测序16S rRNA基因V3−V4区分析扎布耶湖细菌的群落结构组成、物种多样性特征;采用纯培养筛选分离可培养细菌,明确分离菌株分类学地位、生长特性及产酸能力,同时测定分离菌株四氢嘧啶(ectoine)、吲哚乙酸(3-indoleacetic acid, IAA)和胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)的积聚量。【结果】Illumina测序明确分类地位的细菌有21门44纲86目583属,其中优势门类群是变形菌门(Proteobacteria, 25.11%−67.60%)、拟杆菌门(Bacteroidetes, 4.84%−35.02%)和厚壁菌门(Firmicutes, 1.24%−11.01%),优势属类群是克雷伯氏菌属(Klebsiella, 0.01%−9.53%)、盐单胞菌属(Halomonas, 0.54%−8.75%)、芽单胞菌属(Gemmatimonas, 2.39%−6.00%)和腈基降解菌属(Nitriliruptor, 1.27%−6.26%)。纯培养法筛选获得嗜盐碱菌38株,其中芽孢杆菌属(Bacillus) 23株(60.53%)和盐单胞菌属(Halomonas) 10株(26.32%),菌株均具有耐盐碱和产酸能力(19.80%−29.68%)。大多数菌株能积聚四氢嘧啶、IAA和EPS,产量范围分别为1.36−175.59、0.27−8.69和0.02−0.22 g/g。【结论】扎布耶湖细菌群落结构与其他地区盐碱湖相似,但存在大量未明确分类学地位的细菌,分离菌株多具有耐盐碱及产酸特性。此外,还发现4株高效生产四氢嘧啶、3株生产吲哚乙酸和3株生产胞外聚合物的潜力菌株,为扎布耶盐湖微生物资源的开发利用奠定了基础。     

绿色荧光蛋白gfp基因在钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)A9藻株中的表达

将钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)A9藻株在24℃培养,经2 mmol/L的EDTA预处理24 h;采用功率300 W的超声波处理70 s获得单细胞样品,以本实验室构建的携带gfp基因的质粒p215t转化A9藻株单细胞藻液,利用Amp作为选择标记,使单细胞在平板上再生长出单藻落,获得17株具有Amp抗性的转化藻株,转化率3.73‰。在390 nm紫光激发下,生长30天的转化藻丝体发出稳定绿色荧光;培养45天后具有绿色荧光的藻丝出现断裂、具有荧光藻丝长度缩短的现象。实验结果初步表明:报告基因gfp在螺旋藻中得到稳定有效的表达,可以采用单细胞再生形成单藻落技术进行螺旋藻的基因克隆。     

粤北一种虫草分离菌的抗酵母现象

CR 95 1 2是一株分离自粤北一种虫草的无孢丝状真菌 ,经培养初步鉴定为无孢菌目(^{Agonomycetales})的丝核菌属 (^Rhizoctonia)。对包括革兰氏阳性及阴性细菌、放线菌、丝状真菌和酵母菌在内的 2 6株致敏菌株的抗性测定表明 ,CR 95 1 2对包括红酵母属 (^Rhodotorula)、酵母属 (^{Saccharomyces})、毕赤氏酵母属 (Pichia)和隐球酵母属 (^Cryptoc     

高产花色苷玫瑰茄细胞系的筛选

花色苷在植物中呈现粉红、红、紫红、紫等颜色,可以用作食品、药品及化妆品的着色剂,亦有药用价值。作为食品添加剂,颜色较合成色素自然,且安全无毒性。早在１９８７年,Ｍｉｚukami^[1]就建议用植物细胞培养物生产花色苷类代替合成色素。所有的植物培养细胞都是异源性的。各细胞之间产花色苷的能力相差很大^[2].因为产花色苷的细胞系带有颜色标记,所以容易识别并通过肉眼选择即可获得高产花色苷的细胞系。筛选的方法很多,如平板饲喂法^[3]、小细胞团法^[4]、细胞块法^[5]、肉眼观察直接挑选法及细胞分栋器法^[6]等。高产系花色苷的含量可增加几倍到几十倍,而且产量稳定。本文采用平板法及小细胞团法筛选高产花色苷的玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa L.)细胞系。     

L-苹果酸产生菌筛选及高产突变株诱变选育

通过广泛收集和分离,获得根霉属(Rhizopus)、曲霉属(Aspergillus)及裂褶菌属(Schizophyllum)等属菌株897株。产酸指示平板上的变色圈测定结果表明,它们中间628株为产酸菌。通过纸层析对产酸菌发酵液酸谱的分析,获得129株L-苹果酸产生菌,经进一步测定发酵液中L-苹果酸的含量,筛选出以葡萄糖为原料,摇瓶发酵140小时,L-苹果酸产率48．37g／L,对糖转化率48．37×10^-2 的菌株LMO2。经初步鉴定,这一菌株为曲霉(Asper-gillus sp.)以LM02作为出发株,采用亚硝基胍、自然污染细菌、甲基磺酸乙酯及紫外线进行诱变处理,选育出葡萄糖为原料,L-苹果酸产率较高的突变抹N1-14、N1-14、NE1412、NU1416及NU1419。其中N1-14 的L-苹果酸产量最高,比出发株提高46．2×10^-2。N1-14 的菌丝生长速度快,产孢能力强,摇瓶发酵葡萄糖140小时,平均L-苹果酸产率为72．53g／L,对糖转化率53．74×10^-2。全发酵液经薄层层析测定,不含黄曲霉毒素。发酵产物分离提纯后,得到白色粉末状结晶,经纸层析、质谱及红外光谱测定,证明为L-苹果酸。     

酵母完整细胞快速高效转化法

通过研究影响转化效率的诸因素,最终找到一种快速、高效酵母完整细胞转化法。整个转化步骤能在1．5h内完成。在实验中发现：小牛胸腺DNA的加入,在加入DNA后随即加入PEG4000;将42℃热冲击时间从5min延长到25min;热冲击后直接将转化混合物涂布到选择性平板上能得到高效转化效率。所用四种类型质粒的转化效率如下：Yrp;3．5—7．2×10⁴(线性pcN60／BamHⅠ：1·6×10⁵);Yep: l·7—2.6×10⁴(线性YEpl3／BarnHⅠ：8×10⁴),Ycp：3．7×10⁴;YIp5／stuI：7．6×10³。用快速法检测的7株受体菌的转化能力都达到10⁴个转化子/μg DNA。     

集胞藻6803的混合培养——光照强度和葡萄糖的影响

利用摇瓶研究了混合营养条件下单细胞蓝藻集胞藻6803(Synechocystissp.PCC6803)的生长特性,以及葡萄糖和光照强度对集胞藻6803生长的影响。实验结果表明,在葡萄糖消耗完之前,集胞藻6803的混合营养型生长处于对数生长期,且葡萄糖浓度及光照强度都对集胞藻6803的混合营养型生长有显著影响:在初始葡萄糖浓度097～480g/L范围内,同一光照强度培养下藻细胞的比生长速率随葡萄糖浓度的增大而降低;而在光照强度15～55μE·m^-2·s^-1范围内,初始葡萄糖浓度相同条件下藻细胞的比生长速率及对葡萄糖的藻体得率都随光照强度的增强而增大,但当光照强度在55～96μE·m^-2·s^-1时,集胞藻6803混合培养的比生长速率基本不变,出现了光饱和现象。     

Cr3+和Cd2+对普通小球藻生长及抗氧化酶活性的影响

[目的] 为探究重金属对淡水绿藻生长的影响。[方法] 选取对水质检测具有明显指示作用的普通小球藻（Chlorella vulgaris）为实验材料,CdCl₂·2H₂O和CrCl₃·7H₂O提供重金属离子,探究不同浓度Cr³⁺和Cd²⁺在单一和复合胁迫下对藻细胞浓度、叶绿素a及相关抗氧化酶活性的影响。[结果] 随着Cr³⁺和Cd²⁺浓度不断增加,藻细胞浓度呈先增长后下降趋势;叶绿素a含量呈现先下降后升高再下降的现象,浓度为1 mg/L的单一和复合胁迫下有最大值,且毒性作用表现为Cr³⁺ < Cd²⁺ < Cr³⁺+Cd²⁺;与藻细胞膜相关的丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O₂）含量随着重金属离子浓度的增大而增长;重金属离子浓度低于10 mg/L时对藻细胞内抗氧化酶系统中的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）表现为促进作用,而大于10 mg/L时具有抑制作用。[结论] 结果表明在单一或复合重金属胁迫下,普通小球藻会充分调动与抗逆性相关的酶来维持自身的正常生长。     

链霉菌原生质体种间融合——产抗生素的耐温型重组子的选育

以庆丰链霉菌(SM^r,42℃不能生长,产庆丰霉索,可抑制细菌生长)与吸水链霉菌井冈变种(sM5,42℃生长良好,产井冈霉素,不抑制细菌生长)为亲株,在42％PEGl000诱导下进行原生质体融合,在含SM 100μg／ml,42℃培养的再生平板上直接选择耐温型融合子,融台率为1O^-5—1O^－4左右,经分离传代后可得到稳定的耐温型的单倍体重组子,即可在42℃生长,并且有链霉素抗性和抑制细菌生长的活性。初步测定了四个重组子产生的抗菌物质的性质,都与亲株产生的庆丰霉素、井冈霉素不同,其中F1－38,F1－16和IFM3－32三个重组子的抗生素在波长274mm处有一个紫外吸收小峰,而重组子F6-6有二个活性部分,其一在紫外线下呈荧光,另一则具有酸碱指示剂特性。     

水稻白叶枯病菌单抗杂交瘤细胞株的建立及应用研究

经水稻白叶桔病原细菌(Xanthomonas campestris pv．oryzae)菌株Ks-6-6、Os-213、Yz－32,Yz－34,Yz－24’免疫的BALB／c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞sP2／0融台、筛选和克隆化,共获得12株稳定分泌该病原细菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。其抗体分属IgG3和IgG2b亚类。抗体与其它主要病原细菌的种或致病变种无交叉反应,能区分水稻自叶枯病原细菌3个不同血清型的菌株。腹水抗体效价在1：10　³--1：10⁶左右。初步用于抗原决定簇的识别,能区分出6个抗原决定簇,并能将获得的63个菌株分为9个菌株组。     

贪婪倔海绵中抗菌活性细菌的筛选及初步鉴定*

采用平板涂布法从我国南海三亚周边海域贪婪倔海绵(Dysidea avara)中分离海绵共附生细菌,采用金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白假丝酵母、宛氏拟青霉、黑曲霉7种指标菌进行抑菌试验筛选抗菌活性菌,同时对于得到的活性菌进行生理生化鉴定。共分离获得个149个细菌菌株,发现20株具有抑制真菌和革兰氏阳性细菌的活性,占细菌总数的13.4%。经过细菌形态观察和生理生化试验,发现此20株活性菌属于革兰氏阳性芽孢杆菌属(Bacillussp.)。     

几种因子对丛粒藻株A的效应

研究了温度、ＮａＦ和细菌对丛粒藻（ＢｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓｂｒａｕｎｉｉＫｕｔｚ．）纯培养物Ａ的效应。该藻最适生长温度为２５℃。ＮａＦ０．１ｍｇ／Ｌ促进该藻生长。该藻与棒杆菌协同培养可提高产烃量,由无菌对照的０．０８９ｇ／Ｌ提高到０．３９２ｇ／Ｌ,总烃水平由５６％提高到２４．２％。     

铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及耐噬菌体突变频率测定*

用铜绿假单胞菌为宿主菌自污水中分离到3株不同的铜绿假单胞菌噬菌体,命名为PaP1、PaP2及PaP3者均为DNA双链噬菌体,基因组大小分别约为47kb、34kb及24kb。3株噬菌体原液滴度（pfu）分别为10⁹/mL、10¹¹/mL和10¹¹/mL。PaP1为裂菌性噬菌体,PaP2及PaP3为溶原性噬菌体。电镜观察,3株噬菌体头部均为多面体立体对称颗粒,直径分别约为70nm、55nm和65nm。PaP1属肌尾噬菌体科,PaP2和PaP3属     

天山大峡谷原始森林黏细菌的分离鉴定及其抗菌活性

【背景】黏细菌是一类具有多细胞群体行为特征的高等原核生物,其对植物病原真菌和细菌的捕食特性使其在植物病害防治方面具有重要的应用潜力。【目的】探究乌鲁木齐天山大峡谷原始森林可培养黏细菌的多样性并分析其抗菌活性,为发掘黏细菌生防菌株奠定基础。【方法】以天山大峡谷原始森林采集的土样和腐木为分离材料,采用兔粪诱导法和被捕食菌诱导法从中分离纯化黏细菌菌株,结合形态学观察、生理生化测定和16S rRNA基因序列分析确定其分类地位,并以6种植物病原真菌[大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum)、拟轮枝链孢霉(Fusarium verticillioides)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)、细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)]和1种植物病原细菌[梨火疫病菌(Erwinia amylovora)]为靶标菌,通过平板对峙法和菌苔捕食法测定其抗菌活性。【结果】从采集的样品中分离出70株菌株,经纯化后获得36株黏细菌纯培养物。经鉴定隶属于4个属,黏球菌属(Myxococcus) 30株、孢囊杆菌属(Cystobacter) 3株、珊瑚球菌属(Corallococcus) 2株和原囊菌属(Archangium) 1株。抗菌活性分析显示,本研究获得的36株黏细菌至少对2种植物病原真菌有抗菌活性,表现出广谱的抗真菌活性,初步筛选出一株菌株NSE37-1兼具广谱和高效抗真菌活性;供试的15株黏细菌对梨火疫病菌均具有捕食活性,初步筛选出一株对梨火疫病菌具有较强捕食能力的黏细菌菌株NSE25。【结论】天山大峡谷可培养黏细菌资源比较丰富,黏球菌属是该地区可培养黏细菌菌群中的优势菌。分离纯化出的黏细菌菌株均表现出广谱的抗植物病原菌活性,具有进一步研究和开发的潜在价值。     

丝状真菌表达分泌系统中受体菌的构建

黑曲霉糖化酶高产菌株T21经紫外诱变后, 通过酪蛋白平板和蛋白酶活性测定筛选出胞外酸性蛋白酶活力仅为原株076%的菌株A.nigerT21-201,其生长特性和产糖化酶活力与原株基本一致。利用原生质体PEG法将含有报告基因vhb的表达分泌质粒Pgt10-vhb通过与选择标记质粒的共转化导入此蛋白酶部分缺陷株及其原株T21,检测在蛋白酶缺陷株Aspergillus niger T21-201 和原株T21中VHb的分泌表达,结果表明在A.nigerT21-201中VHb表达水平显著高于原株,但Northern blot却显示在两菌株中^vnb基因的转录水平近似,由此证明酸性蛋白酶缺陷对保护外源蛋白产生了显著效果。 