类似S-层蛋白的苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白基因的克隆

芽胞杆菌CTC菌株被鉴定为苏云金芽胞杆菌 ,鞭毛血清型H2 ,幕虫亚种 ;产生卵圆形伴胞晶体 ,伴胞晶体蛋白为 1 0 0kD ;测定了该蛋白的N 末端序列 ,该序列与炭疽芽胞杆菌的细胞表面S 层蛋白具 92 %～ 93%相似性 ;根据Southern杂交制作了该晶体蛋白基因ctc所在位置的限制性酶切图谱 ,分别克隆了该基因 5′和 3′端所在的 2 9kbXbaI片段和 3 1kbClaIDNA片段 ,彼此间具 0 6kb重叠 ,通过拼接获得含完整ctc基因的克隆。含该基因的大肠杆菌与表达S 层蛋白的大肠杆菌具相似生长特征。初步表明CTC菌株的伴胞晶体由细胞表面S 层蛋白组成。苏云金芽胞杆菌区别于蜡状芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌的唯一标准是能形成伴胞晶体 ,由于S 层是细胞表面的结构成分 ,本文对CTC菌株鉴定为苏云金芽胞杆菌以及伴胞晶体作为苏云金芽胞杆菌鉴别的唯一标准提出了质疑     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3A在枯草芽胞杆菌中的表达

枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis常被用于表达杀虫和抗菌蛋白.为了探讨苏云金芽胞杆菌B. thuringiensis营养期杀虫蛋白基因（vip3A）在枯草芽胞杆菌中的表达情况,促进杀虫防病工程菌构建,将枯草芽胞杆菌168菌株核糖体小亚基S4蛋白基因的启动子与苏云金芽胞杆菌WB7菌株vip3A基因的编码序列连接,插入大肠杆菌Escherichia coli与枯草芽胞杆菌穿梭载体pAD123,得到重组原核表达质粒pADpvip,将重组质粒转化枯草芽胞杆菌标准菌株168和分离自辣椒体内的生防内生枯草芽胞杆菌BS-2菌株中,获得工程菌株.SDS-PAGE分析表明在枯草芽胞杆菌168菌株的部分工程菌株中有约88 kDa大小的VIP条带,而BS-2的工程菌株中未见相应的条带,表明Vip3A蛋白仅在168菌株中表达.生物测定表明有5株168的工程菌株（168vip1-4,6）表现较高的杀虫活性,工程菌株发酵稀释液（约10⁷CFU/mL）处理的小白菜叶片饲喂斜纹夜蛾2龄幼虫72 h的杀虫效果可达87.64%~92.13%,但vip3A基因转入内生枯草芽胞杆菌BS-2中不表现杀虫作用.毒力测定表明168vip2菌株对斜纹夜蛾2龄幼虫72 h的LC₅₀为0.0194 mL/mL.这些结果为进一步研究基因在枯草芽胞杆菌中的表达构建杀虫防病工程菌打下了基础.     

利用S-层蛋白在苏云金芽胞杆菌细胞表面展示多聚组氨酸肽

S-层(S-layer)是由单一的蛋白或糖蛋白组成的薄层晶状结构,它广泛存在于古细菌和真细菌细胞的最外表面,可包裹整个细胞。S-层在结构化学、形态学、遗传学以及物理化学等方面具有独特的性质,使之在生物技术、分子纳米技术和仿生学等领域蕴藏着广泛的应用潜力。近年来,随着微生物表面展示技术的兴起和展示系统的逐渐成熟,继外膜蛋白、附屑结构蛋白、粘附蛋白以及凝集素等表面蛋白之后,S-层蛋白被作为一种新的表面展示载体成功的在细胞表面展示了一些外源大分子。多聚组氨酸肽是由若干个单位的六聚组氨酸串联而成的短肽。六聚组氨酸能够有效的吸附镍、镉等重金     

苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S-层蛋白可以形成伴胞晶体

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)CTC菌株产生卵圆形伴胞晶体,晶体蛋白分子量为100kD;透射电子显微镜观察结果表明该菌株有S—层结构,而且在母细胞内可以形成伴胞晶体和S—层的初体结构;其蛋白基因导入苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171后,扫描电子显微镜观察结果表明转化子能形成晶体,而其形状与CTC菌株的相同;转化子晶体蛋白的分子量大小也与CTC菌株的相同,为100kD。以上实验结果结合以前晶体蛋白N—末端测序和基因核苦酸序列,表明苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S—层蛋白可以形成伴胞晶体。     

类似S-层蛋白的苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白基因的克隆

芽胞杆菌CTC菌被鉴定为苏云金芽胞杆菌,鞭毛血清型H2,幕虫亚种;产生卵圆形伴胞晶体,伴胞晶体蛋白为100kD;测定了该蛋白 N－末端序列,该序列与炭疽芽胞杆菌的细胞表面S－层蛋白具92－93％相似性,根据Southern杂交制作了该晶体蛋白基因ctc所在位置的限制性酶切图谱,分别克隆了该基因5’和3’端所在2．9kb XbaI片段和3．1kb Cla I DNA片段,彼此间具0．6kb重叠,通过拼接获得含完整ctc基因的克隆,含该基因的大肠杆菌与表达S－层蛋白的大肠杆菌具相似生长特征,初步表明CTC菌株的伴胞晶体由细胞表面S－层蛋白组成,苏云金芽胞杆菌区别于蜡状芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌的唯一标准是能形成伴胞晶体,由于S－层是细胞表面的结构成分,本文对CTC菌株鉴定为苏云金芽胞杆菌以及伴胞晶体作为苏云金芽胞杆菌鉴别的唯一标准提出了质疑。     

利用S-层蛋白在苏云金芽胞杆菌细胞表面展示多聚组氨酸肽（简报）

S层(Slayer)是由单一的蛋白或糖蛋白组成的薄层晶状结构,它广泛存在于古细菌和真细菌细胞的最外表面,可包裹整个细胞。S层在结构化学、形态学、遗传学以及物理化学等方面具有独特的性质,使之在生物技术、分子纳米技术和仿生学等领域蕴藏着广泛的应用潜力。近年来,随着微生物表     

苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S-层蛋白可以形成伴胞晶体

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)CTC菌株产生卵圆形伴胞晶体,晶体蛋白分子量为100kD;透射电子显微镜观察结果表明该菌株有S层结构,而且在母细胞内可以形成伴胞晶体和S层的初体结构;其蛋白基因导入苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171后,扫描电子显微镜观察结果表明转化子能形成晶体,而其形状与CTC菌株的相同;转化子晶体蛋白的分子量大小也与CTC菌株的相同,为100kD。以上实验结果结合以前晶体蛋白N末端测序和基因核苷酸序列,表明苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S层蛋白可以形成伴胞晶体。     

利用苏云金芽胞杆菌细胞表面展示系统表达禽流感病毒NP蛋白

首次利用苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)S-层蛋白CTC表面展示系统研究在Bt细胞表面展示禽流感病毒NP蛋白的可行性和最佳方案,为研制能常温长期保藏和运输的禽用口服疫苗奠定基础。用全长np基因或部分np基因(npp)代替S-层蛋白ctc基因的3′-端或中部,构建了4个重组质粒pSNP(含ctc-np)、pCSA-SNP(csa-ctc-np)、pCTC-NPP(ctc-npp)和pCSNPP(csa-ctc-npp)。将重组质粒分别电转化入Bt受体菌株BMB171中,获得了5个重组菌株BN、BCN、C-S、BCCN和CN。用5个重组菌株的营养细胞做玻片凝集试验,结果显示5个重组菌株均成功地在细胞表面展示了NP蛋白。用5个重组菌株的营养细胞免疫小鼠,ELISA测定血清抗体效价,结果显示5个重组菌株均具有免疫原性,其中重组菌株CN的免疫原性最高,其含融合基因csa-ctc-npp,证明该种融合基因的构建方式最佳。这为利用S-层蛋白CTC表面展示系统构建展示其它禽类病原体抗原的重组菌株以研制禽用热稳定性口服疫苗奠定了基础。     

苏云金芽胞杆菌CcpA蛋白对几丁质酶基因chiA和chiB的表达调控作用

【目的】研究苏云金芽胞杆菌Bti75中糖代谢蛋白Ccp A对两种几丁质酶基因chi A和chi B的表达调控。【方法】利用PREDetector软件分析Bti75 chi A和chi B的基因上游区序列,EMSA方法在体外验证Ccp A是否能与chi A和chi B基因的启动子区域片段特异性结合。构建ccp A基因敲除载体以获得敲除突变株Δccp A,运用实时荧光定量PCR技术和Western blot技术比较有无葡萄糖存在的情况下,Ccp A对chi A和chi B基因表达的影响。【结果】计算机分析显示,chi B上游启动子区存在一个潜在的Ccp A结合位点crechi B,而chi A上游启动子区未发现类似序列。体外实验表明,Ccp A蛋白在共阻遏蛋白Hpr-Ser45-P的参与下可与chi B基因启动子区特异性结合,而与chi A基因启动子区没有特异性结合;实时荧光定量PCR和Western blot结果均显示,Bti75中ccp A基因敲除后,同样在葡萄糖存在下chi B的表达量提高而chi A的表达量变化不明显。【结论】在葡萄糖存在的情况下,Ccp A蛋白能抑制苏云金芽胞杆菌中几丁质酶chi B的表达,而chi A的表达不受Ccp A调控。     

苏云金芽胞杆菌肠毒素基因的PCR检测

采用多重引物PCR进行了 45株苏云金芽胞杆菌、2株蜡状芽胞杆菌和 2株球形芽胞杆菌溶血素BL ,肠毒素T和entS基因的检测 ,结果表明 95 6%苏云金芽胞杆菌含溶血素hblA基因 ,91 1 %含bceT基因 ,93 3%含entS基因。用两种商业化肠毒素检测试剂盒TECRA和RPLA进行所有菌株肠毒素的体外免疫测定 ,大部分苏云金芽胞杆菌和阳性蜡状芽胞杆菌都能产生不同水平的肠毒素活性 ,同hblA基因PCR检测结果基本相符。尽管DBT0 0 7和T2 4 0 0 1含有hblA基因 ,但用TECRA却检测不到肠毒素 ;Dmu39菌株不含肠毒素基因 ,但用TECRA却检测出高的肠毒素活性。苏云金芽胞杆菌BDT2 4 8和球性芽孢杆菌不含肠毒素基因和肠毒素。结果表明昆虫病原菌苏云金芽胞杆菌的安全性有待进一步研究     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的分类

１９８９年Ｈｏｆｔｅ和Ｗｈｉｔｅｌｅｙ根据氨基酸序列的同源性和杀虫谱双重标准将苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因划分为５类１４亚类。根据双重标准出现的问题和冲突,给分类带来了困扰,为此１９９５年,只根据氨基酸序列的同源性进行分类。现已将基因分为２１群,４４亚群,６４类,１１６个亚类。本文介绍了纳入新系统的条件、分类原则、命名方法、定名步骤和分类中值得注意的问题。     

影响苏云金芽孢杆菌基因在转基因植物中表达的因素

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）杀虫晶体蛋白基因是植物抗虫基因工程中应用最广泛的基因资源。影响Bt基因在转基因植物中表达的因素繁多,阐明这些因素的效应对于获得Bt基因在受体植物中的稳定高效表达具有重要意义。现对Bt基因表达的主要影响因子,如Bt基因表达单元、植物发育、外部环境条件、受体植物遗传背景、整合位点及Bt基因沉默现象等进行了综述。     

几丁质酶ChiAC不同时期表达对苏云金杆菌的影响

目的:研究几丁质酶在苏云金杆菌不同生长时期的异源表达对菌体生长、芽胞形成及杀虫活性的影响.方法:构建了几丁质酶基因chiAC分别在其自身营养期启动子和芽胞特异性强启动子一二元毒素启动子调控下的两个重组质粒pBC和pB-bC,将其转化进苏云金杆菌以色列亚种IPS78菌株(得到的重组菌株分别命名为Bti-pBC和Bti-pBbC).结果:菌株Bti-pBc在营养期表达(O～40h)ChiAC,ChiAC的表达显著影响其芽胞形成,进而导致对致倦库蚊毒力的显著下降(LC<,50>1×10<5'>ng/ml,原始菌株为5.61 ng/ml;菌株Bti-pBbC则在其整个生长阶段(O～80 h)均能大量稳定的表达ChiAC,且ChiAC的表达不影响其芽胞形成及对蚊幼的毒力(LC<,50>为7.16 ng/ml).结论:几丁质酶基因chiAC在二元毒素启动子调控下能在苏云金杆菌中强效稳定的表达且不影响其芽胞形成和杀虫活性.     

Genetic Engineering of Insect-Resistant Crop Plants with Bacillus thuringiensis Crystal Protein Genes

Bacillus thuringiensis, a soil bacterium, produces crystalline proteins which are toxic to the Insect larvae, The toxicity Is brought about by the protein fragments released due to the action of mid-gut proteases and their binding to the receptors on the epithelial membrane, which In turn loses Its selective permeability. The genes (cry) coding for these Insecticidal crystal proteins have been cloned, characterized and mobilized Into a number of crop plants. Such transgenic plants were shown to be resistant to insects. However, the expression of these bacterial genes in higher plants has been limited because of differential codon usage. Various strategies for maximizing the expression of these genes in transgenic plants have been described. In addition, alternative approaches have been suggested for circumventing the development of resistance in insects to the crystal proteins.     

融合蛋白NusA-hRI的高效异源表达、纯化及活性分析

人核糖核酸酶抑制因子 (human ribonuclease inhibitor, hRI) 是一种能够调节核糖核酸酶活性的酸性包浆蛋白。通过构建含SUMO、IF2、GST、NusA 、MsyB、Trx和 MBP融合标签的重组表达载体,以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌进行自诱导(auto-induction,AI)表达,从而使 hRI 的表达量得以提升。利用MagNi磁珠纯化及电泳分析hRI的表达状况,通过RNase/Sepharose亲和层析获得纯度较高的蛋白。纯化后获得的融合蛋白浓度为2 960.513mg/L,与其它公司的hRI活性进行比较,检测其酶活性约为50U/μl,并使其成功用于RNA的保护,为NusA-hRI的应用提供理论依据。     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析

选择本实验室分离的苏云金芽胞杆菌李氏亚种 (subsp. Leesis) 菌株YBT833、鲇泽亚种(subsp.Aizawai) 菌株YBT-1416和库斯塔克亚种(subsp. Kurstaki)菌株YBT1535为出发菌株,以营养期杀虫蛋白基因PCR扩增的特异片段为探针,进行总DNA酶切片段的Southern杂交定位。结果显示3株菌株的营养期杀虫蛋白基因,均位于经XbaI完全消化的4～5kb大小的DNA 片段上。将该区域DNA片段回收后克隆到pUC19载体,建立了3个较基因组文库小的亚基因组文库。通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定分别得到3个相应的营养期杀虫蛋白基因vip83、vip14和vip15,并对其测序。DNA序列比较发现基因vip83与已知营养期杀虫蛋白基因存在5个差异碱基。将vip83、vip14基因亚克隆到苏云金芽胞杆菌大肠杆菌穿梭载体pHT315, 分别得到重组质粒pBMB8901和pBMB8902。将它们电转化到vip^-的B.t.受体菌BMB171和4Q7,获得了相应的工程菌BMB8901-171,BMB8902-171,BMB8901-4Q7和BMB8902-4Q7。SDS-PAGE电泳检测均有88kD大小的蛋白表达。生物测定结果亦表明了,营养期杀虫蛋白Vip83和Vip14对鳞翅目棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾的三龄幼虫均有一定的杀虫活性;其中对小菜蛾的毒力最高,LC₅₀值分别为28.6,31.6,45.4和37.6μL/mL。该结果为构建高效广谱工程菌提供了实际材料和理论依据。      

Molecular Characterization and Genetic Diversity of Insecticidal Crystal Protein Genes in Native Bacillus thuringiensis Isolates

The Western Ghats of Karnataka natural ecosystem are among the most diverse and is one of the eight hottest hotspots of biological diversity in the world, that runs along the western part of India through four states including Karnataka. Bacillus thuringiensis (Bt) strains were isolated from soils of Western Ghats of Karnataka and characterized by molecular and analytical methods as a result of which 28 new Bt-like isolates were identified. Bt strains were isolated from soil samples using sodium acetate selection method. The morphology of crystals was studied using light and phase contrast microscopy. Isolates were further characterized for insecticidal cry gene by PCR, composition of toxins in bacterial crystals by SDS-PAGE cloning, sequencing and evaluation of toxicity was done. As a result 28 new Bt-like isolates were identified. Majority of the isolates showed the presence of a 55 kDa protein bands on SDS-PAGE while the rest showed 130, 73, 34, and 25 kDa bands. PCR analysis revealed predominance of Coleopteran-active cry genes in these isolates. The variations in the nucleotide sequences, crystal morphology, and mass of crystal protein(s) purified from the Bt isolates revealed genetic and molecular diversity. Three strains containing Coleopteran-active cry genes showed higher activity against larvae Myllocerus undecimpustulatus undatus Marshall (Coleoptera: Curculionidae) than B. thuringiensis subsp. Morrisoni. Results indicated that Bt isolates could be utilized for bioinsecticide production, aiming to reduce the use of chemical insecticide which could be useful to use in integrated pest management to control agriculturally important pests for sustainable crop production.     

炭疽芽胞杆菌A16R株FtsE蛋白的可溶性表达和纯化简

目的：构建炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白的原核表达载体,实现其在原核表达系统中的可溶性表达,并纯化融合蛋白。方法：用PCR方法从炭疽芽胞杆菌A16R株扩增得到厅sE基因片段,酶切后连接到pET28a原核表达载体,构建重组表达质粒pET28a-ftsE,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,筛选可溶性诱导表达与纯化融合蛋白的条件,以获得高纯度融合蛋白。结果：构建了FtsE蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;在20℃下,经0．1mmol/LIPTG诱导3h表达的产物主要是可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化获得了高纯度的FtsE融合蛋白,经Western印迹检测,目的蛋白表达正确。结论：实现了炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白原核表达系统的可溶性表达并获得了高纯度融合蛋白,为后续研究奠定了基础。