丙型肝炎病毒靶向药物及抗病毒药物筛选

丙型肝炎由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染所致,约80%感染者可发展成慢性肝炎,甚至肝硬化和肝癌。目前,临床主要应用干扰素结合利巴韦林联合疗法治疗丙型肝炎,但治疗后病毒有效应答率不高,并伴有明显的副作用产生,迫切需要研发靶向药物。随着HCV体外细胞培养技术获得的突破性进展以及在此基础上各种药物筛选方法的建立,利用现有的筛选模型筛选靶向药物成为抗病毒药物研发的重要途径。近年来,将GFP、hRLuc等报告基因插入HCV基因组中改造成具有明显标记的高通量药物筛选体系,已初步筛选出一些有效的HCV靶向药物,就现有抗丙型肝炎病毒靶向药物及抗病毒药物筛选方法进行综述。     

丙型肝炎病毒感染性细胞模型的研究进展

丙型肝炎病毒（HCV）是造成慢性肝炎,肝硬化及肝癌的重要原因之一,目前全球约有1.7亿人感染HCV。然而缺乏有效的HCV感染模型,严重阻碍了对HCV致病机制的认识。最近几年以JFH1株和Huh-7细胞系为基础,通过对不同病毒株基因组的重组和细胞系的优化,进一步提高其感染能力,在HCV感染系统的建立上取得了突破性进展。我们简要综述近几年在HCV感染细胞模型方面取得的进展。     

脑心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体进入位点活性的研究

脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus ,EMCV)的内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site ,IRES)已被广泛运用于蛋白的表达中,如应用于Clontech 公司推出的pIRES2 质粒对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达。但是由于对EMCV的IRES了解还不够深入而在利用EMCV的IRES进行基因表达过程中经常会遇到问题,很有必要对其进行更深入的研究。以红绿色荧光蛋白基因作为报告基因,通过分子克隆、荧光显微镜、荧光分光光度计、Western blot等分子细胞生物学手段,对EMCV的IRES末端序列与其活性的关系进行了深入研究。研究发现EMCV的IRES末端序列对其IRES的活性影响极大,而人们常用的报告基因EGFP本身也可能存在IRES。     

丙型肝炎病毒细胞和动物模型的研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)是造成慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要病因之一,目前全世界约1.7亿人感染HCV.HCV的自然宿主范围很窄,由于缺少有效的HCV细胞培养系统和小动物模型,人们对其生活周期、作用机制等仍不是很清楚,从而严重阻碍了HCV疫苗及治疗药物的开发与研制.我们简要综述了近几年在HCV细胞和动物模型方面的进展,同时...     

内部核糖体进入位点（IRES）调控细胞血清饥饿应激条件下PRDM13的翻译

PRDM13是锌指蛋白转录抑制因子（positive regulatory domain zinc finger protein,PRDM) 家族中的一员,其在细胞分化、肿瘤的发生和恶性转化中起着重要的作用。而对于PRDM13 基因侧翼序列是否含有内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES）及其功能所知甚少。本研究对PRDM13 5′端的非翻译区（5′UTR）进行IRES结构与功能分析,探索其在细胞血清饥饿应激条件下对PRDM13翻译的影响。实验发现,在血清饥饿的条件下,肝癌细胞Bel7402/WT中PRDM13的蛋白质水平增加,但是其mRNA水平基本没有变化。将PRDM13 5′UTR的序列插入双顺反子的报告载体(pRL-FL)中,并且将构建的载体(pRL-PRDM13-FL）转染进细胞中,结果显示,PRDM13 5′UTR含有IRES,且发现PRDM13 5′UTR中的105 nt（53～157）对其IRES的功能至关重要。在帽依赖的翻译（cap-dependent translation）机制被抑制时,IRES这种机制可有效维持PRDM13蛋白合成。本研究提供了在细胞压力条件下调节PRDM13蛋白合成的一种新的解释。     

HCV内部核糖体进入位点(IRES)结构域Ⅲ中连接点的位置对其三级结构形成的影响

丙型肝炎病毒(HCV)结构含有一个内部核糖体进入位点(IRES);该位点是一段高度保守序列,坐落于mRNA的5'-非翻译区域(5'-UTR).目前,对IRES的三级结构及相关功能研究较少.本实验通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射显影技术,研究在不同离子浓度、不同RNA浓度条件下,IRES结构域Ⅲ的连接点(junction)在不同位置时对结构域Ⅲ形成的影响,以及不同的结构域Ⅱ与结构域Ⅲ的相互作用关系.实验结果表明,HCV的IRES结构域Ⅲ连接点位置对结构域Ⅲ的形成至关重要,连接点位置不同,则结构域Ⅲ形成的结构不同.因此,在HCV的疫苗和相关药物设计中,可以针对结构域Ⅲ连接点进行研究,使之成为疫苗或药物作用靶点.     

HCVIRES介导萤火虫荧光素酶翻译的双顺反子载体的构建与在小鼠体内的表达

将HCVIRES插入双报告基因海肾荧光素酶 (Rluc)基因和萤火虫荧光素酶 (Fluc)基因之间 ,建立了“依赖帽子的扫描机制”翻译表达Rluc ,HCVIRES调控Fluc翻译的双顺反子表达载体pCI Rluc HCVIRES Fluc ,通过酶切反应及转染HepG2细胞鉴定双荧光素酶瞬间表达活性等试验 ,证实获得了表达双荧光素酶的双顺反子载体 .并应用水压转染法将双顺反子表达质粒导入小鼠体内 ,在小鼠肝脏检测到高水平表达的Rluc和Fluc .该研究成功构建一种HCVIRES介导萤火虫荧光素酶基因表达的双顺反子载体 ,并在HepG2细胞及小鼠体内进行了瞬时表达 ,为进一步建立稳定评价靶向HCVIRES药物作用的细胞及小动物模型研究奠定了基础     

雌激素受体2（ESR2）mRNA 5′非翻译区内部核糖体进入位点活性的鉴定与分析

真核生物除了传统的帽依赖型翻译机制外,还存在内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES）介导的翻译机制。雌激素受体2（estrogen receptor 2, ESR2）是雌激素受体家族成员之一,其编码的蛋白质在许多肿瘤中发挥重要的作用。ESR2蛋白的异常表达会导致众多肿瘤的发生,但其蛋白质翻译水平的调控机制至今仍不清楚。研究发现,在药物刺激的条件下,乳腺癌细胞MCF7/WT中ESR2蛋白的表达提高,但是其转录水平基本未见发生改变。猜测ESR2 mRNA 5′非翻译区（5′ untranslated region, 5′ UTR）具有IRES活性。为了验证ESR2 mRNA 5′ UTR是否具有IRES元件,将ESR2 mRNA 5′ UTR插入到双顺反子报告基因载体（pRF）中,构建pRL-ESR2-FL重组质粒载体,将其瞬时转染到HEK293细胞。结果发现,ESR2 mRNA 5′ UTR有假定的IRES活性。并且通过3个排除实验验证了ESR2 IRES活性与其5′ UTR中的内部潜在启动子（P<0.0001）、内部剪切位点以及核糖体通读无关。进一步对其序列进行截短研究发现,ESR2 IRES活性发挥的关键区域是3′端的439～468 nt,且ESR2 IRES最大活性的发挥依赖于5′ UTR序列的完整性。并且发现,ESR2 IRES活性的发挥不但需要特定的一级核酸序列,还要有稳定的二级茎环结构。此研究有望为ESR2蛋白调控的相关疾病提供新的药物治疗靶点。     

人apoA-I基因启动子转录上调剂筛选系统的建立与应用

PCR扩增含有apoA-I基因的转录调控序列的启动子片断(376 bp),克隆入含有荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的pGL3B-neo载体中,构成受apoA-I启动子调控的重组报告基因质粒pGL3B-neo::apo,稳定转染人肝癌细胞株HepG2。通过细胞有限稀释法筛选稳定表达荧光素酶活性的细胞株SAPOA-I。经apoA-I转录调控因子PPARα激动剂的鉴定和细胞接种密度、溶剂使用浓度等条件的优化,成功建立了靶向apoA-I基因启动子转录活性的报告基因筛选体系。应用该体系对400多种降脂中药提取物进行筛选,泽泻、罗布麻叶、山楂等提取物显示出较好的上调活性,与文献报道采用动物模型研究的结果一致。     

丙型肝炎病毒NS3/4A丝氨酸蛋白酶瞬时表达小鼠模型的建立

目的:建立丙型肝炎病毒NS3/4A丝氨酸蛋白酶体内活性评价模型。方法:利用NS4A/B是NS3/4A丝氨酸蛋白酶作用底物的特性,构建融合基因NS3/NS4A/B-SEAP,底物片段NS4A/B插在NS3/4A和人分泌性碱性磷酸酶(SEAP)之间,融合基因表达后SEAP的分泌依赖于有活性的NS3/4A在NS4A/B位点的切割。将含融合基因的质粒NS3/4A(△4AB)SEAP通过水动力转染技术转染到小鼠体内,检测小鼠血清中SEAP的活性,高活性的SEAP是该评价体系成立的证据。结果与结论:在瞬时表达NS3/4A的小鼠血清中检测到了高活性的SEAP,建立了可用于评价抗NS3/4A的小鼠体内瞬时模型。     

四个达摩凤蝶新孵幼虫细胞系的建立及其生物学特性

【目的】建立达摩凤蝶 Papilio demoleus Linnaeus新孵幼虫细胞系,并对其生物学特性进行研究。【方法】使用改良配方的Grace培养基并辅以20%胎牛血清,通过原代和传代培养建立达摩凤蝶新孵幼虫细胞系。通过显微观察、细胞活力分析、核型分析和分子鉴定,获得4个新建细胞系的生物学特性数据。使用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建重组分泌型碱性磷酸酶杆状病毒(AcMNPV-SEAP)。使用有限稀释法测定达摩凤蝶细胞系对AcMNPV-SEAP的半数组织培养感染剂量(TCID₅₀), 比较达摩凤蝶细胞系对AcMNPV-SEAP的敏感性。【结果】建立了4个贴壁生长的达摩凤蝶新孵幼虫细胞系(RIRI-PaDe-1, RIRI-PaDe-2, RIRI-PaDe-3及RIRI-PaDe-4),且均传至60代以上。形态学方面,细胞系RIRI-PaDe-1和RIRI-PaDe-4较为相近,均由圆形、梭形以及多边形细胞组成,细胞系RIRI-PaDe-2主要为圆形细胞,而RIRI-PaDe-3主要为类似表皮细胞和纤维状细胞。细胞增殖动力学方面,4个细胞系的群体倍增时间分别为69.77, 67.42, 81.48及65.43 h。核型分析显示4个细胞系染色体数量均呈正态分布,其中RIRI-PaDe-2, RIRI-PaDe-3以及RIRI-PaDe-4的染色体数目分布区间比较接近,在45~97条之间,RIRI-PaDe-1的染色体条数相比偏少,在36~90条之间。通过比对4个达摩凤蝶细胞系和虫卵的细胞色素c氧化酶亚基I(COI)基因序列,证明4个新建细胞系来源于达摩凤蝶组织。比较4个细胞系对AcMNPV-SEAP敏感性发现RIRI-PaDe-3对此病毒较为敏感,可作为重组杆状病毒表达的宿主。【结论】虽然4个新建达摩凤蝶细胞系的来源相同,具有相同的遗传背景,但其生物学特征仍有明显差异,具有进一步研究的价值。     

生物分子相互作用分析技术应用实例（三）——药物筛选和鉴定

美国Schering-Plough公司利用BIA技术成功地进行了药物筛选.他们选用抑制法从大量合成和天然小分子物文库中筛选细胞因子拮抗物.     

一种亨廷顿舞蹈症体外药物筛选细胞模型的建立

为建立以多聚谷氨酰胺（polyQ）为靶点的亨廷顿舞蹈症体外药物筛选细胞模型,以随机引物PCR法克隆了不同长度的 CAG片段,经序列测定正确后,分别融合到已经建立的氯霉素抗性融合蛋白表达系统pCAR中CAT的N端,重组质粒转化大肠杆菌,并在其中诱导表达,SDS-PAGE 和氯霉素抗性平板试验对目的蛋白可溶性与氯霉素活性进行测定。结果显示长度在40以上的polyQ为不溶性包涵体表达,表现为低水平的氯霉素抗性,40以下的polyQ则以可溶形式表达,表现为高水平氯霉素抗性,从而建立起能够模拟亨廷顿舞蹈症病理过程的体外细胞模型。通过检测模型细胞的氯霉素抗性,可以定性、定量地反映polyQ在体内的折叠状态和可溶性,故可以借助该模型对促溶药物或生物活性物质进行高通量筛选,为亨廷顿舞蹈症预防、诊断、治疗提供了新思路。     

人免疫缺陷病毒假病毒药物筛选模型的构建及其应用

目的:构建人免疫缺陷病毒(HIV)假病毒模型,用多种HIV逆转录酶和蛋白酶抑制剂作用于该模型,以检测其是否能有效用于HIV抑制药物的筛选。方法:通过载体改造获得最终慢病毒载体puc18-NL4-3-LUC-stop,其中含有萤光素酶基因,将该载体与包膜质粒VSV-G共转染293FT细胞,包装产生HIV假病毒,在假病毒包装和病毒感染293FT细胞的过程中加入蛋白酶和逆转录酶抑制剂,通过检测感染细胞中萤光素酶的表达来检测该模型的有效性,并利用此模型检测药物的抗病毒效果。结果:将HIV逆转录酶和蛋白酶抑制剂作用于该假病毒模型时发现萤光素酶的表达得到很大程度的抑制。结论:建立了HIV假病毒药物筛选模型,该模型以萤光素酶基因作为报告基因,快速灵敏,在抗HIV药物筛选中有一定的应用价值。     

以蛋白激酶G为靶点的抗结核药物筛选模型的建立和初步应用

结核分枝杆菌可以产生11种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其中蛋白激酶G(PknG)对于结核分枝杆菌在巨噬细胞内以"持留"状态长期存活有着重要作用。本研究以结核分枝杆菌基因组DNA为模板,在大肠杆菌中克隆表达了MTBPknG蛋白,并分离纯化得到PknG纯酶。本研究还采用三步级联反应方法测定了PknG酶活性,建立和优化了PknG抑制剂高通量筛选模型。利用此模型共筛选发酵液样品2120个,化合物样品2300个,筛选得到阳性化合物1个,阳性发酵液13个,阳性率0.32%。     

TNFalph 和 IL-1bet 靶点抗炎药物筛选细胞模型的构建

目的:构建两个高表达人TNFα和IL-1β细胞系,建立抗炎药物筛选细胞模型。方法:运用PCR的方法从载体pCMVSport-TNFα和p CMVSport-IL1β上扩增目的基因,以亚克隆方法将目的基因分别插入真核表达载体pcDNA3.1和pFLAG-CMV中,用单酶切、PCR扩增和基因测序的方法鉴定重组效果,然后将重组成功的质粒转入HEK293细胞系内,挑选能够稳定表达并遗传的单克隆细胞株,用蛋白免疫印迹(Western blot)法分析其表达效果。结果:三种鉴定方法均显示重组质粒构建成功。Western blot结果显示,细胞株T3、T4均能较高表达炎症因子TNF-α;细胞株I2、I3、I5均能较高表达炎症因子IL-1β。结论:成功构建了TNFα和IL-1β靶标的药物筛选细胞模型,为筛选具有抗炎作用的中药提供了一个新平台。     

High-Throughput Drug Screening Identifies a Potent Wnt Inhibitor that Promotes Airway Basal Stem Cell Homeostasis

1. Download : Download high-res image (99KB)
2. Download : Download full-size image