人清道夫受体AII胞外部分在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的分泌表达

清道夫受体A(SR-A)介导巨噬细胞无限制摄取修饰的低密度脂蛋白(mLDL)形成泡沫细胞,继而形成动脉粥样硬化病灶,在动脉粥样硬化的发生、发展过程中具有重要作用,被认为是治疗动脉粥样硬化的潜在靶点。本文应用RT-PCR方法扩增得到编码人Ⅱ型SR-A胞外部分(shSR-AII)的cDNA,将其克隆至毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达载体pPIC9K构建重组表达质粒p9K-shSR-AII。将重组表达质粒线性化后,电转化毕赤酵母GS115,用原位双膜法筛选获得高表达shSR-AII的重组菌株GS115／p9K-shSR-AII。重组菌株经1％甲醇诱导,SDS-PAGE、Western blot分析表明shSR-AII获得了分泌表达。Ligand binding blot结果表明表达的shSR-AII具有与配基oxLDL结合的生物活性。U937泡沫细胞模型进一步表明shSR-AII可通过竞争性结合oxLDL来抑制泡沫细胞的形成,为以shSR-AII为靶点建立抗动脉粥样硬化药物筛选模型奠定了基础。     

利用重组Pichia pastoris生产腺苷甲硫氨酸

为改造甲醇利用型酵母Pichia pastoris来生产腺苷甲硫氨酸（SAM,S-adenosylL-methionine）,我们将一个带有SAM合成酶基因的胞内表达质粒转化入Pichia pastoris菌株GS115,经过G418抗性筛选得到一株有两个基因拷贝的转化子。该菌在含有甲醇和甲硫氨酸的培养基中生长5d后,其细胞内的SAM的产量比原始菌株提高了30余倍。对该菌生产SAM的培养基中的碳源与氮源进行了优化,结果显示碳源的控制对该菌SAM产量的影响很大。在试管水平,该菌在含有0.75％的L-methionine并且碳源和有机氮源经过一定程度优化的培养基中,生长6d后SAM产量达到1.58g/L。     

人可溶性低密度脂蛋白受体在甲醇酵母中的表达

为获得低密度脂蛋白受体配基结合结构域在甲醇酵母中的分泌表达 ,首先用RT PCR方法以人肝癌Bel 740 2总RNA为模板扩增了编码低密度脂蛋白受体配基结合结构域的基因片段。核酸测序分析表明克隆到的DNA片段的序列与报道的人LDLR的cDNA序列相同。然后构建了甲醇酵母表达质粒pPIC9K sLDLr ,并将其线性化后用电穿孔法导入PichiapastorisGS115。分别用SDS PAGE、Westernblot和Ligandbindingblot对GS115 pPIC9K sLDLr上清中的重组sLDLR进行鉴定。SDS PAGE和Westernblot分析表明表达的sLDLR的表观分子量为 36kD。Ligandbindingblot分析表明表达的sLDLR具有配基结合的生物学活性     

人p53蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表

将人p53基因装入Pichia分泌型质粒Phil-S1中,酶切线性化后电穿孔导入酵母细胞进行整合,经筛选得到一高表达p53蛋白的克隆。SDS-PAGE显示表达量约占分泌总量的30%。ELISA验证重组人p53存在免疫学活性。在诱导时就降低Pichia酵母系统水解酶活力等方面进行优化,经FPLC分离纯化得到约200mg/L表达量。     

人血管内皮细胞生长因子在毕赤酵母中的高效表达

血管内皮细胞生长因子 (Ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃ ｔｏｒ,简称ＶＥＧＦ)是一类多功能细胞因子 ,特异地作用于血管内皮受体ＫＤＲ和Ｆｌｔ 1,促进新生血管形成并增加微血管的渗透性[1] 。ＶＥＧＦ在生理和病理 ,如肿瘤血管发生、伤口愈和、类风湿性关节炎、胚胎发育及冠心病等过程中起着非常重要的作用。天然ＶＥＧＦ是由两条糖蛋白链形成的二聚体。目前发现ＶＥＧＦ至少有 5种亚型 ,根据单体残基数不同分别为ＶＥＧＦ12 1,ＶＥＧＦ14 5,ＶＥＧＦ165,ＶＥＧＦ189和ＶＥＧＦ2 0 6,其中ＶＥＧＦ12 1和ＶＥＧ…     

结核杆菌热休克蛋白70在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定

获得结核杆菌热休克蛋白70在毕赤酵母中的分泌表达。构建了酵母表达质粒pPIC9K-hsp70,并将其线性化后用电穿孔法导入Pichia pastoris GS115,经PCR方法筛选出阳性菌落,在0.5%甲醇诱导下分泌表达。所得产物经离心收集上清、超滤浓缩脱盐、亲和层析后,分别用 SDSPAGE、Western blot和动物免疫实验对上清中的重组Hsp70进行鉴定,并考察产物对DC的作用。经SDSPAGE、Western blot分析表明表达的Hsp70表观分子量为70kD并能特异性地与抗Mt.Hsp70单抗结合,动物实验表明重组的Hsp70能在体诱导免疫应答。重组Hsp70能够诱导DC成熟并释放Th1型细胞因子。摇瓶发酵表达量达120mg/L,占培养上清30%以上。这为研究结核杆菌热休克蛋白70的生理功能提供了必要的物质条件。     

氨离子浓度对重组毕赤酵母的生长和血管生长抑制素表达的影响*

本研究采用流加补料培养方式培养重组巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）,表达血管生长抑制素（Angiostatin）。整个培养过程分为以甘油为碳源的生长阶段和以甲醇为碳源的诱导阶段。全过程用氨水调节pH时,诱导阶段菌体生长受到抑制,蛋白的最大表达量为9.08mg/L。进行不同氨离子浓度的摇瓶培养,证实在以甲醇为碳源时,氨离子浓度对菌体的生长有明显的影响。高密度培养中改用 2 mol/L的 KOH溶液调节 pH,诱导阶段菌体有缓慢的生长,蛋白最大表达量增为20mg/L。     

重组人载脂蛋白A-Ⅰ在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高表达

高密度脂蛋白 (High densityLipoprotein ,HDL)是血浆中重要的脂蛋白 ,其主要成分为载脂蛋白AⅠ(ApoliproteinAⅠ ,ApoAⅠ为了大量制备该蛋白 ,首先尝试利用Pichiapastoris表达系统高效表达ApoAⅠ。通过PCR扩增获得天然含人载脂蛋白ApoAⅠ的基因片段 ,将其插入到P .pastoris分泌型载体pPIC9K上 ,BglⅡ酶切线性化后电转化P .pastorisGS115 ,将获得的 1000多个转化子依次在含不同G₄₁₈浓度的YPD平板筛选高抗性转化子 ,得到的2 2个高抗性转化子经甲醇诱导 ,SDS PAGE检测得到 6株高表达菌。然后对其中的高表达菌株AP16的培养及诱导条件进行了优化 ,结果显示 :接种后培养 24～ 28h ,转入诱导阶段 ,培养基pH值在 7～ 7.5 ,菌体密度OD₆₀₀ =80左右 ,以 1%甲醇诱导 96h最有利于ApoAⅠ的表达 ,表达水平达 160mg/L。 14L发酵罐结果显示表达水平与摇瓶相当 ,均高于其它表达系统 ,为大批量制备奠定了基础.     

猪白细胞介素_6在巴斯德毕氏酵母（Pichia pastoris）中的分泌表达

白细胞介素6（Interleukin_6, IL_6）是一种具有多种生物学效应的细胞因子,在疾病诊断与疫苗佐剂领域有广阔的应用前景。在本试验中,猪白细胞介素_6（pIL_6）的cDNA序列被克隆入甲醇酵母（Pichia pastoris）分泌表达载体pPIC9K中,并转化入P. pastoris GS115菌株。其重组菌株GS115/pPIC9K_IL6经1% 甲醇诱导后,能分泌表达分子量约为24.5KD的重组蛋白,Western blot确证为pIL_6。该酵母表达产物无N端糖基化修饰。用依赖IL6生长的B9细胞株检测提纯后的pIL_6,其生物学活性可达8×104IU/mg。     

重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅰ在巴氏毕赤酵母中的表达及纯化

纹捕鸟蛛毒素Ⅰ是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化,具有镇痛活性的肽类神经毒素。对巴氏毕赤酵母生产的重组HWTX-Ⅰ进行多步纯化,首先将分泌到培养上清的rHWTX-Ⅰ进行90％饱和度的（NH₄）₂SO₄沉淀,再用截留分子量3kD的滤膜脱盐,再用CM阳离子交换层析分离,最后用C₁₈反相层析脱盐纯化,真空干燥后得到的rHWTX-Ⅰ经Tricine SDS-PAGE,质谱鉴定,氨基酸组成分析,N-端序列测定及活性鉴定,证明已获得高纯度的重组HWTX-Ⅰ,摇瓶表达量约为80mg/L,约占总分泌量的23.6%,并对摇瓶发酵条件进行了优化,为利用基因工程方法生产HWTX－I的规模化生产及临床应用提供了证据。     

重组人卵透明带ZP3蛋白在毕赤酵母中的表达

利用P.pastoris表达人卵透明带ZP3蛋白。设计特定引物从全长hZP3 cDNA上扩增含跨膜区序列的人卵透明带ZP3基因片段,并在N末端接上串联组氨酸编码序列的重组基因序列;扩增片段插入表达载体pPIC9K中;线性化后的重组质粒转入P.pastoris中,用高浓度G418筛选高拷贝菌株,然后甲醇诱导目的蛋白表达。用SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。结果发现P.pastoris表达的人ZP3蛋白可以分泌到培养液中,并且可溶性好。纯化前后的重组人ZP3蛋白均能与兔抗猪ZP3蛋白抗体发生交叉反应,证实表达的目的蛋白具有反应原性。     

重组人血清白蛋白在Pichia pastoris中分泌表达影响因素的研究

为获得高产稳产重组人血清白蛋白的Pichia pastoris细胞株用于高密度发酵,构建了多种分泌表达载体,在Pichia pastoris中作表达,研究表达载体构建等因素对表达量的影响。发现采用酿酒酵母α性成熟因子前导肽比人血清白蛋白天然前导肽作为分泌信号肽的表达量要高10%左右。而载体整合方式、整合拷贝数、5’非翻译区的改造和甲醇利用表型等对表达量无规律性影响。筛选到的高表达株经高密度发酵,细胞湿重达460 g/L,发酵液上清的人血清白蛋白含量为1.0 g/L。     

甲醇酵母Pichia pastoris高水平表达有活性的辣根过氧化物酶

表达有活性的辣根过氧化物酶(HRP)不仅可以深入揭示HRP结构与功能及其生理作用规律,而且为HRP的广泛需要提供新的来源.为了在甲醇酵母P.pastoris中成功表达,将编码HRP-C成熟肽的cDNA构建到pPIC9上,再转化到P.pastoris中,筛选到了分泌表达非糖基化HRP和高糖基化HRP(分子质量超过100 ku)两种主要产物的重组细胞株.优化表达条件,目标产物在摇瓶发酵液中高效表达,可达4～6 g/L.并且直接从发酵液中可获得具有活性的高糖基化HRP,每毫升发酵液中酶活力约有2 U,经初步的纯化HRP具有最大吸收峰403 nm.     

人β神经生长因子在大肠杆菌中的高表达

将编码人β神经生长因子(Huβ-HGF)的基因克隆到由T7噬菌体启动子控制的pET11c大肠杆菌表达载体中,重组质粒经鉴定含有Huβ-NGF基因,未解聚的表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),结果显示出二聚体27kD的蛋白带。而完全解聚的表达产物SDS-PAGE显示出一条13β5kD单体带。经凝胶电泳扫描,表达带占菌体总蛋白的14.5％。用兔抗鼠β—NGF的多克隆抗体进行的Western-Blot的结果表明,二聚体同单体都有免疫原性。在生物活性的鉴定中,菌体表达产物可以使小鸡鸡胚的背根神经节产生神经元突起,由此可以证明该表达产物有较高的生物活性。     

NAC1上游调控区表达特征及其与侧根激素诱导的关系

从拟南芥(Arabidopsis thaliana）中克隆到与侧根原基发生相关的转录因子基因NAC1上游调控区序列,构建由该序列驱动β-葡聚糖苷酶基因(GUS)的植物表达载体并转化烟草(Nicotiana Tabaccum),经筛选获得了在根组织高GUS活性而地上部痕量表达的转基因烟草植株。对转基因植株进行GUS活性和染色分析,结果表明NAC1上游调控区驱动的GUS基因表达具有根部组织特异性,在侧根顶端分生组织区、侧根原基基部和幼嫩侧根基部表达。用IBA,GA₃,GA₄₊₇处理转基因植株根部,NAC1上游调控区驱动的GUS表达均增强,表明生长素、赤霉素可显著诱导NAC1上游调控区的表达,并参与侧根发生的调控。     

对水稻MADS-box基因M79的表达模式和功能的分析

利用简并引物和T引物,通过RT-PCR, 从水稻减数分裂时期的小花中扩增并克隆出一个MADS-box基因M79,序列分析表明M79与OsMADS7在DNA水平上同源性达到97.5%,推导的蛋白序列同源性却只有91.0%.M79的转录本有5个不同的 poly (A)添加位点,它同OsMADS7一样在水稻中为单拷贝基因,也定位在水稻的第8号染色体上.M79仅在花器官中表达,其表达从减数分裂前期开始贯穿整个花的发育各时期,并且成熟雌蕊中的表达量比成熟雄蕊中多.对两代转基因水稻的分析表明,M79涉及水稻的花时控制,异位表达可使烟草的花期提前,并且还可能参与控制营养生长中的分枝以形成更多的花芽.     

以甘油为碳源发酵Pichia pastoris组成型表达人血管生成抑制素

在Pichia pastoris组成型表达外源蛋白中碳源起着重要的调控作用。分别以葡萄糖、甘油、甲醇和油酸为碳源研究它们对摇瓶发酵GS115（pGAP9K-AS）表达hAS的影响。结果如下：油酸（163mg/L）,甘油（83mg/L）,葡萄糖 （76mg/L）,甲醇（57mg/L）。 根据以上结果,以甘油为碳源在30L生物反应器中进行GS115（pGAP9K-AS）工程菌的高密度发酵。48h后测得hAS的产量为169mg/L。产物hAS具有免疫活性并能抑制bFGF 诱导的CAM血管生成和实验小鼠黑色素瘤的生长。治疗12d后,抑瘤率达到90%,统计学分析结果表明hAS治疗组和PBS治疗组小鼠的肿瘤体积呈现显著性差异(P<0.01)。     

毕赤酵母基因操作技术的改进及其在水蛭素表达中的应用

毕赤酵母是日益受到重视的基因工程受体菌,但是目前尚没有一种简便、高效的转化方法,也没有一种稳定、可靠的菌落PCR方法。本文通过在通常筛选重组子的MD培养基中增添1mol/L山梨糖醇使毕赤酵母电穿孔转化效率提高10倍以上。并比较系统地分析了其他影响电穿孔转化效率的因素,如毕赤酵母生长状况即OD600,不同的整合位点(BglⅡ,SacⅠ,SalⅠ,StuⅠ),及不同的毕赤酵母受体菌(GS115和KM71)等。本文描述的转化方法所能达到的转化效率比目前大多数文献报道的效率要高,可使每微克质粒DNA产生的整合到受体菌染色体上的转化子述2800个;另外,我们经过一种冷热处理毕赤酵母菌落的方法使其细胞壁裂解,并改变通常PCR缓冲液的组成成分后,毕赤酵母菌落PCR方法几乎和大肠杆菌的操作一样简便可靠。借助本文所描述的电穿孔转化方法和菌落PCR方法,成功实现了水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达,表达量为每毫升培养上清20μg,其生物活性达每毫升培养上清82个国际单位。     

以甘油为碳源发酵Pichia pastoris组成型表达人血管生成抑制素

在Pichia pastoris组成型表达外源蛋白中碳源起着重要的调控作用。分别以葡萄糖、甘油、甲醇和油酸为碳源研究它们对摇瓶发酵GS115（pGAP9K-AS）表达hAS的影响。结果如下：油酸（163mg/L）,甘油（83mg/L）,葡萄糖 （76mg/L）,甲醇（57mg/L）。 根据以上结果,以甘油为碳源在30L生物反应器中进行GS115（pGAP9K-AS）工程菌的高密度发酵。48h后测得hAS的产量为169mg/L。产物hAS具有免疫活性并能抑制bFGF 诱导的CAM血管生成和实验小鼠黑色素瘤的生长。治疗12d后,抑瘤率达到90%,统计学分析结果表明hAS治疗组和PBS治疗组小鼠的肿瘤体积呈现显著性差异(P<0.01)。     

飞蝗(Locusta migratoria)地理种群在中国的遗传分化

随机扩增多态DNA(RAPD)的方法被用于研究中国飞蝗11个地理种群的遗传分化、种群间相互关系以及空间隔离在种群分化中的作用. AMOVA对所有种群变异分析说明包含在种群内的变异(79.55%)显著高于种群间的(20.45%), 种群间分化程度显著; 所有种群划分成四个大的地区组, 组内的变异占总变异的82.99%, 显著高于包含在组间的(17.01%), 地区间的种群分化显 著. 对四个组进行两两比较, 保留在组内的变异都极显著高于组间的变异, 说明这些组间的种群分化显著. 其中, 组间种群差异最大的是海南和西藏种群, 变异约是组内种群间的7倍; 差异最小的是海南与新疆和内蒙古地区, 组间仅是组内种群间的0.5倍. 用遗传距离和空间距离进行Mantel测验发现它们存在极显著的相关性(P<0.01), 说明地理隔离在飞蝗地理种群分化的过程中起重要的作用, 飞蝗地理种群的分化与地理隔离关系密切. 飞蝗种群聚类分成由黄淮平原、新疆和内蒙古、西藏和海南种群组成的四大分支. 主成分分析发现11个种群明显聚集成4簇: 黄淮 平原种群、新疆和内蒙古种群、海南种群和西藏种群. 所有个体聚类则分成5个分支: 黄淮平原种群、海南种群、新疆和内蒙古种群、新疆哈密种群和西藏种群. 飞蝗在中国东部呈明显的连续和梯度变异特点, 进一步划分亚种既不实际也无必要. 对中国主要飞蝗地理种群的亚种地位进行了讨论.