美洲斑潜蝇SS PCR检测技术研究

【背景】美洲斑潜蝇是一种严重威胁瓜果蔬菜、烟草、棉花等经济作物和花卉生产的入侵性害虫。由于潜叶蝇类害虫体型较小、生活方式隐蔽、形态相似,本文针对其难以快速准确地进行形态鉴别的问题,以美洲斑潜蝇为研究对象,以菜田常见的4种潜叶蝇类害虫为参照,采用种特异性PCR方法（species specific PCR, SS PCR）,研究其快速分子检测鉴定技术。【方法】调用GenBank中一段936 bp的美洲斑潜蝇线粒体DNA（mtDNA）细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因（CO[KG-*2]Ⅰ）的序列（GenBank登录号为EU219613）,并根据此基因片段的碱基序列设计引物1对,其扩增片段大小为294 bp。【结果】种特异性检验结果显示,该引物只对美洲斑潜蝇的CO[KG-*2]Ⅰ基因具有扩增能力,对其他种类如南美斑潜蝇、三叶斑潜蝇、葱斑潜蝇、豌豆潜叶蝇等没有扩增能力。该引物不仅对成虫具有良好的扩增效果,对蛹、幼虫以及单粒卵也具有同样的扩增效果,其最低检出阈值为1/3840头成虫。【结论与意义】SS PCR技术体系可用于美洲斑潜蝇的鉴定识别与检测监测,对阻止其进一步扩散蔓延具有重要意义。     

重大潜在入侵害虫番茄潜叶蛾的SS-COⅠ快速检测技术

【背景】番茄潜叶蛾是源自南美洲的一种最具毁灭性的世界性入侵害虫,其适生区范围广,且与其他潜叶类昆虫难以准确、快速识别。【方法】以田间常见的其他6种潜叶类害虫为对照,采用基于mtDNA COⅠ基因的种特异性SS-COⅠ方法,研究番茄潜叶蛾快速分子检测技术。【结果】种特异性检测结果显示,SS-COⅠ引物只对番茄潜叶蛾mtDNA具有扩增能力,对美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇、葱斑潜蝇、豌豆潜叶蝇、桃潜叶蛾等其他潜叶类害虫不具有扩增效果。该引物不仅对成虫和单粒卵具有很好的扩增效能,对单根触角、头部、胸部、腹部以及翅和足等成虫残体亦具有同样的扩增能力,其最低检出阈值为312.5 pg·μL-1。【结论与意义】该方法在有效防范番茄潜叶蛾侵入我国,保障农业生产安全和生态环境安全中意义重大。     

重大潜在入侵害虫番茄潜叶蛾的SS-CoI快速检测技术

【背景】番茄潜叶蛾是源自南美洲的一种最具毁灭性的世界性入侵害虫,其适生区范围广,且与其他潜叶类昆虫难以准确、快速识别。【方法】以田间常见的其他6种潜叶类害虫为对照,采用基于mtDNACOl基因的种特异性SS—COI方法,研究番茄潜叶蛾快速分子检测技术。【结果】种特异性检测结果显示,SS-COl引物只对番茄潜叶蛾mtDNA具有扩增能力,对美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇、葱斑潜蝇、豌豆潜叶蝇、桃潜叶蛾等其他潜叶类害虫不具有扩增效果。该引物不仅对成虫和单粒卵具有很好的扩增效能,对单根触角、头部、胸部、腹部以及翅和足等成虫残体亦具有同样的扩增能力,其最低检出阈值为312．5Pg·μL^-1。【结论与意义】该方法在有效防范番茄潜叶蛾侵入我国,保障农业生产安全和生态环境安全中意义重大。     

美洲斑潜蝇等重要潜蝇的鉴别

双翅目中的潜蝇科、花蝇科、果蝇科、实蝇科和水蝇科等类群虽然都含有潜叶种类,但只有潜蝇科绝大部分种类以潜叶为主,其潜叶种类包含不少农作物和花卉害虫。在潜蝇科的这些害虫种类中,又以豌豆彩潜蝇ＣｈｒｏｍａｔｏｍｙｉａｈｏｒｔｉｃｏｌａＧｏｕｒｅａｕ,番茄斑潜蝇Ｌｉｒｉｏｍｙｚａｂｒｙｏｎｉａｅ（Ｋａｌｔｅｎｂａｃｈ）,拉美斑潜蝇Ｌ．ｈｕｔｈｅｂｒｅｓｉｓ（Ｂｌａｎ－ｃｈａｒｄ）,美洲斑潜蝇Ｌ．ｓａｔｉｖａｅ　Ｂｌａｎｃｈａｒｄ和三叶斑潜蝇Ｌ．ｔｒｉｆｏｌｉｉ（Ｂｕｒｇｅｓｓ）最为重要,造成较大的损失,…     

甘肃白银地区潜叶蝇及其寄生蜂的组成和发生调查

【目的】明确严重危害甘肃省白银地区作物的潜叶蝇及天敌寄生蜂的多样性和种群组成。【方法】采用五点取样法田间调查潜叶蝇危害的蔬菜、花卉、杂草并采样,室内对潜叶蝇及其寄生蜂进行形态鉴定和分子鉴定。【结果】在2016-2020年在甘肃白银地区采集的样本中发现6种常见潜叶蝇,包括本地种豌豆彩潜蝇Chromatomyia horticola和葱斑潜蝇Liriomyza chinensis,入侵种南美斑潜蝇L. huidobrensis、三叶草斑潜蝇L. trifolii、番茄斑潜蝇L. bryoniae和美洲斑潜蝇L. sativae。其中,豌豆彩潜蝇为优势种,可危害多科寄主植物;葱斑潜蝇仅在大葱上发现危害;南美斑潜蝇在温室内的蔬菜上发生严重;三叶草斑潜蝇首次在白银市发现;番茄斑潜蝇与美洲斑潜蝇的危害相对较轻。此外,调查的潜叶蝇寄生蜂包括3科12属24种,优势种包括豌豆潜蝇姬小蜂Diglyphus isaea、芙新姬小蜂Neochrysocharis formosa、万氏潜蝇姬小蜂D. wani和西伯利亚离颚茧蜂Dacnusa sibirica。【结论】一方面白银市应加强监测和预警入侵性潜叶蝇的发生,另一方面白银市潜叶蝇的天敌寄生蜂种类丰富,对田间主要危害的潜叶蝇可能发挥着重要的自然防控作用,建议保护利用本地寄生蜂天敌。     

入侵害虫梣粉虱的种特异性SS-COⅠ检测技术

【目的】梣粉虱是新近入侵中国大陆的一种危险性果树和园林植物害虫,针对其体型微小,与近缘种粉虱形态相仿,很难快速准确区分的问题,以田间常见的11种/隐种粉虱为参考,采用基于mt DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(mitochondrial DNA cytochrome c oxidase subunitⅠ,mt DNA COⅠ)基因的物种特异性(species-specific COⅠ,SS-COⅠ)PCR法,研究梣粉虱快速分子检测鉴定技术。【方法】利用mt DNA COⅠ基因通用型引物对LCO-1490/HCO-2198获得梣粉虱和其他常见粉虱的COⅠ基因序列,根据测序结果设计梣粉虱特异性SS-COⅠ引物1对(SPZWCF1/SPZWCR1),之后确定其对目的片段的扩增长度,并对该引物对的物种特异性和检测灵敏性进行检验。【结果】引物对SPZWCF1/SPZWCR1扩增片段的长度为426 bp。物种特异性检验结果显示,该对引物只对梣粉虱的mt DNA COⅠ基因具有扩增效果,对我国常见的其他种类的粉虱包括5种烟粉虱隐种(AsiaⅠ、AsiaⅡ1、AsiaⅡ3、MED、MEAM1隐种)以及桑粉虱、螺旋粉虱、黑刺粉虱、柑橘粉虱、双钩巢粉虱和温室粉虱等不具有交叉反应和扩增能力。灵敏性检验结果显示,该对引物不仅对不同性别、不同采集地的成虫具有良好的扩增效能,对2~4龄若虫以及单粒卵和初孵若虫亦具有同样的扩增效力,其最低检测阈值为75.1 pg·μL-1(相当于1/10240头雌性成虫)。【结论】该技术体系可用于梣粉虱的快速准确鉴定及其检测和监测,对有效阻截其进一步传播扩散具有重要作用。     

双钩巢粉虱的种特异性SS-COⅠ检测技术

【背景】双钩巢粉虱是近年在我国南方新发现的一种入侵害虫,其寄主范围广,危害严重,进一步扩散蔓延趋势明显。【方法】针对粉虱类害虫体型微小、形态相似、难以准确快速识别的问题,以双钩巢粉虱为靶标,以我国常见的其他8种／隐种粉虱为参照,采用基于mtDNACOI基因的种特异性SS—COI方法,研究其快速分子检测技术。利用COI通用型引物LCO．1490／HCO．2198获得双钩巢粉虱及其他常见粉虱的COI序列,根据测序结果设计特异性SS—COI引物1对（PPZYFl／PPZYRl）,其扩增片段大小为233bp。【结果】种特异性检验结果显示,该引物只对双钩巢粉虱的COI基因具有扩增能力,对其他种／隐种粉虱,包括烟粉虱的不同隐种（MEAMl隐种、MED隐种、AsiaⅡ3隐种和AsiaII1隐种）以及温室粉虱、柑橘粉虱、黑刺粉虱、螺旋粉虱等不具有扩增效果。该引物不仅对不同性别的成虫具有良好的扩增能力,对1—4龄若虫和单粒卵亦具有同样的扩增效能,其最低检测阈值为1／40960头雌性成虫。【结论与意义】本检测技术对口岸检疫以及观赏植物、果树及其种苗调运中的害虫检测、监测意义重大。     

基于16S rDNA基因的谷斑皮蠹PCR检测技术

【目的】谷斑皮蠹是一种重要的检疫性害虫,在新疆周边多个国家分布,口岸检疫人员多次从进境货物中截获谷斑皮蠹,该虫对新疆的农业生产极具威胁。【方法】以谷斑皮蠹的16S rDNA基因为靶序列,用昆虫通用引物对4种供试皮蠹进行PCR扩增,将扩增产物进行克隆和测序,用生物软件设计检测谷斑皮蠹的特异性引物与探针。【结果】设计的特异性引物(TG-SNP-F/TG-SNP-R)及所建立的常规PCR方法能有效检测出谷斑皮蠹,其扩增产物的片段大小为250 bp,灵敏度为3 ng·μL~(-1)。设计的特异性引物(TG-F/TG-R)和探针(TG-probe),以及所建立的实时荧光PCR方法,对谷斑皮蠹的检测特异性强,灵敏度达0.8 fg·μL~(-1)。【结论】建立的常规PCR方法和实时荧光PCR检测方法能够对谷斑皮蠹进行准确鉴定,为口岸检疫人员检测进境货物中携带的谷斑皮蠹提供技术支持。     

利用多重PCR反应同时筛选番茄Cf-9和Tm-1基因

利用同一PCR反应体系,对分别与番茄抗叶霉病的Cf-9基因和抗番茄烟草花叶病毒病的Tm-1基因紧密连锁的PCR标记进行了同时扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段吻合。其中与Cf-9基因紧密连锁的CAPs标记在抗感试材均可扩增出560bp的特异片段,且都存在TaqⅠ酶切位点,抗病基因型酶切后分别产生了450bp、330bp和290bp的不同特异性片段,而感病基因型试材酶切后产生450bp和290bp的特异性片段;与Tm-1基因紧密连锁的SCAR标记为显性标记,只有抗病试材产生750bp的特异片段,不能被TaqⅠ酶切。经反复验证,结果稳定准确,可用于在同一PCR反应体系中对两个抗病基因进行同时筛选鉴定。该体系的建立不仅省时、省工、节省费用,而且可用于苗期辅助选育,加快番茄抗病育种进程。     

米尔顿姬小蜂线粒体16S rRNA与COⅠ基因片段序列测定及分析

【背景】米尔顿姬小蜂是一种入侵我国台湾地区的植食性小蜂,能够严重影响水果的产量和食用价值。目前在我国大陆没有分布,由于其个体微小,与近似种区别较小,通过传统的形态学分类方法难以鉴定,因此有必要研究其基因片段序列,探讨分子鉴定方法。【方法】利用PCR方法扩增并测定了米尔顿姬小蜂线粒体16SrRNA和COⅠ基因的部分序列,并对各序列的碱基组成进行了分析。然后根据COⅠ基因部分序列,利用DNAMAN的Maximum Likelihood方法构建了米尔顿姬小蜂与膜翅目其他科的系统发育树。【结果】16SrRNA基因的PCR扩增产物为426bp,COⅠ基因的PCR扩增产物为488bp。通过测序获得米尔顿姬小蜂16SrRNA和COⅠ基因部分序列,序列分析表明,16SrRNA和COⅠ基因的A+T含量均较高,存在较强的A+T偏向性。系统发育树显示,米尔顿姬小蜂与蚜小蜂科的Encarsia berlesei亲缘关系最近,与姬小蜂科的Chrysocharis nautius、C.eurynota亲缘关系较远。【结论与意义】本研究为米尔顿姬小蜂的分子鉴定提供了依据。     

葫芦素B对美洲斑潜蝇成虫产卵和取食的抑制作用研究

美洲斑潜蝇是严重危害瓜、豆类蔬菜的世界性害虫之一,主要以幼虫潜伏在叶表皮下的叶肉组织中为害,给防治带来很大困难。本研究测定了葫芦素B对美洲斑潜蝇成虫产卵和取食的抑制作用。在非选择性试验中,当葫芦素B使用浓度为500~2000 mg/L时,对美洲斑潜蝇成虫的产卵抑制率达31.2~69.9%,对美洲斑潜蝇成虫的取食抑制率达61.7~64.9%;在选择性试验中,葫芦素B使用浓度达1000~2000 mg/L时,对美洲斑潜蝇成虫的产卵抑制率和取食抑制率分别为54.8~71.1%和57.2~65.2%;研究结果表明:利用葫芦素B可有效地抑制美洲斑潜蝇成虫的产卵和取食,减轻其幼虫的为害,为安全、有效地控制美洲斑潜蝇提供了一条新途径。     

Species displacements are common to two invasive species of leafminer fly in China, Japan, and the United States

Under field conditions, species displacements have occurred in different directions between the same invasive species of leafminers (Diptera: Agromyzidae). Liriomyza sativae (Blanchard) was displaced by L. trifolii (Burgess) in the western United States, with evidence suggesting that lower insecticide susceptibility of L. trifolii is a factor. However, in Japan, the opposite has occurred, as L. trifolii was recently displaced by L. sativae. This displacement is probably because of the higher fecundity of L. sativae and differential effects of parasitoids on the two leafminer species. Here, we carried out long-term surveys of these same two invasive leafminer species during January through March in 1999, 2007, and 2011, as well as June through July in 2011, in eight locations (Sanya, Dongfang, Haikou, Leidong, Lingshui, Wuzhisan, Qionghai, and Danzhou) across Hainan Island of southern China. Our results indicate that, between 2007 and 2011, L. trifolii rapidly replaced L. sativae as the predominant leafminer of vegetables on Hainan Island, similar to the situation in the western United States. Further surveys of growers revealed that avermectins and cyromazine are the two most frequently used insecticides against leafminers on Hainan Island. Dose-mortality tests showed that L. trifolii populations from Hainan Island are less susceptible to avermectins and cyromazine compared with L. sativae populations. This lower insecticide susceptibility of L. trifolii may be associated with the displacement of L. sativae by L. trifolii, although additional ecological or environmental factors cannot be ruled out.     

美洲斑潜蝇的寄主植物种类、适合度及其为害性的评价

在山西省调查结果,美洲斑潜蝇的寄生有２９种栽培植物,１１种野生植物,它们分属１６个科,其中以葫芦科,茄科和豆科的种类居多。应用选择系数法和适合性指数法定量测定了１６种常见寄生对美洲斑潜蝇的适合度,建立了选择强度与适合度估测模。根据适合度将美洲斑潜蝇的寄生植物划分为３个类型,即适宜寄主、较适宜寄主和次要寄主,在上述研究的基础上,测定了该在不同寄主上的虫道面积和蛹的重量,明确了不同寄主植物对害虫发育的     

Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism assays to distinguish Liriomyza huidobrensis (Diptera: Agromyzidae) from associated species on lettuce cropping systems in Italy

The pea leafminer, Liriomyza huidobrensis (Blanchard) (Diptera: Agromyzidae), is a serious insect pest infesting open field lettuce plantings in northern Italy. In these cropping systems, it coexists with several other agromyzid species that have negligible economic importance on open field vegetables. The rapid detection of L. huidobrensis is crucial for effective management strategies, but the identification of agromyzids to species can be very difficult at adult as well at immature stages. In this study, a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism assay is proposed to separate L. huidobrensis from Liriomyza bryoniae (Kaltenbach), Liriomyza trifolii (Burgess), and Chromatomyia horticola (Goureau), which usually occur in the same lettuce plantings. An approximately 1,031-bp region of the mitochondrial genome encompassing the 3' region of cytochrome oxidase I, the whole leucine tRNA, and all of the cytochrome oxidase II was amplified by PCR and digested using the enzymes PvuII and SnaBI separately. Both endonucleases cut the amplicons of L. huidobrensis in two fragments, whereas the original band was not cleaved in the other analyzed species. The presence of Dacnusa spp. DNA does not bias the assay, because the PCR conditions and the primer set here described do not amplify any tract of this endoparasitic wasp genome.     

寄主挥发物、叶色和表皮毛在美洲斑潜蝇寄主选择中的作用

在室内条件下 ,初步研究了寄主挥发物、叶色和表皮毛在美洲斑潜蝇寄主选择中的作用。在嗅觉仪试验中 ,寄主叶片挥发物对美洲斑潜蝇雌成虫没有明显的引诱作用 ;在叶色反应试验中 ,美洲斑潜蝇雌成虫在叶子圆片上停留的时间明显大于在滤纸圆片上停留的时间 (p<0 .0 1) ,其在有叶片区域分布的数量明显多于空白对照 (p <0 .0 1) ;在表皮毛试验中 ,美洲斑潜蝇在无毛叶片上的产卵量明显大于在有毛叶片上的产卵量 (p <0 .0 1)。上述结果表明 ,在对寄主的定向和定位过程中 ,美洲斑潜蝇的视觉起着重要的作用 ,而嗅觉不起作用 ;叶片表皮毛有抑制产卵的作用     

外来斑潜蝇入侵和适应机理及管理对策

重要外来斑潜蝇（美洲斑潜蝇Liriomyza sativae Blanchard,南美斑潜蝇L.huidobrensis Blanchard)已对我国蔬菜和花卉生产造成了重大的经济损失。介绍了我国外来斑潜蝇的主侵形势,入侵途径和特点及采取的防治对策;分析了外来斑潜蝇在我国与寄主植物,气候,人类活动等作用过程中的适应机理,并针对我国目前外来斑潜蝇入侵现状提出了可行的管理措施,以期对预防了管制我国外来生物入侵提供参考。     

Juvenile and sublethal effects of selected pesticides on the leafminer parasitoids Hemiptarsenus varicornis and Diglyphus isaea (Hymenoptera: Eulophidae) from Australia

The pest leafminers Liriomyza huidobrensis (Blanchard), Liriomyza sativae (Blanchard), and Liriomyza trifolii (Burgess) (Diptera: Agromyzidae) have spread into South East Asia and Oceania, and they are likely to reach Australia in the near future. Two translaminar pesticides, cyromazine and abamectin, currently provide effective chemical control of these pests, but because parasitoids can play an important role in controlling and preventing leafminer outbreaks, understanding the impact of pesticides on leafminer parasitoids is vital. Here, we tested larval and pupal mortality and sublethal effects of abamectin, cyromazine, and the widely used fungicide mancozeb on two common Australian leafminer parasitoids, Hemiptarsenus varicornis (Girault) and Diglyphus isaea (Walker). Abamectin caused significant mortality to larvae and pupae of both parasitoid species but cyromazine and mancozeb did not. Progeny production and longevity of H. varicornis were not affected by adult exposure to cyromazine and mancozeb, nor did direct pupal exposure decrease number of progeny produced by either parasitoid. Mortality of H. varicornis females emerging from leaves treated with abamectin was high for up to 72 h after eclosion but those surviving beyond 72 h did not differ from control females in the number of progeny produced. Mancozeb did not influence leaf residence time or parasitism by H. varicornis females. Cyromazine and the fungicide mancozeb were concluded to be compatible with the parasitoids tested and suitable for integrated pest management of leafminers should outbreaks of pest species occur in Australia. Abamectin should be used with caution because it caused significant mortality in both parasitoids tested here.     

福州郊区美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇寄主植物初步名录

本记录了福州郊区美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇寄主植物的初步名录。发现该地区美洲斑潜蝇可取食20科85种植物,南美斑潜蝇可取食20科73种。最后讨论了这两种斑潜蝇的主要寄主作物和杂草,并提出套种和清除田间杂草的农防措施;斑潜蝇的适应性很强,寄主范围正逐步扩大,应密切关注其动态。     

两种外来斑潜蝇实验种群生物学特征比较

美洲斑潜蝇LiriomyzasativaeBlanchard和南美斑潜蝇Liriomyzahuidobrensis(Blanchard)是我国的2种重要入侵性害虫。本实验室在标准化流程下饲养了48(L.huidobrensis)-160(L.sativae)个世代的稳定实验种群。美洲斑潜蝇的实验种群需要较大的繁殖规模(>100对)才能保持群体的稳定性。2种斑潜蝇4个发育阶段的形态特征和幼虫为害特征差别明显。南美斑潜蝇的发育历期比美洲斑潜蝇长,总产卵量低于美洲斑潜蝇,但产卵历期明显长于美洲斑潜蝇。这可能是南美斑潜蝇较之容易繁殖的重要原因。该实验种群的建立为物种驯化、寄主选择性、抗性筛选及其它生理学、生态学等诸多研究打下基础。