葱蝇非滞育、 冬滞育和夏滞育蛹发育和形态特征比较

昆虫非滞育、 冬滞育和夏滞育蛹具有不同的生理和发育过程。本研究以葱蝇Delia antiqua作为模式种, 以黑腹果蝇Drosophila melanogaster蛹的发育形态特征和命名为参照, 用解剖、 拍照、 长度测量和图像处理等方法系统地比较研究了非滞育、 冬滞育和夏滞育蛹的发育历期和形态变化, 重点在头外翻和滞育相关发育和形态特征, 目的在于弄清非滞育、 冬滞育和夏滞育蛹发育和形态特征差异, 为滞育发育阶段的识别、 滞育分子机理研究奠定形态学基础。冬滞育蛹的滞育前期、 滞育期和滞育后期分别为4, 85和27 d, 夏滞育蛹的滞育前期、 滞育期和滞育后期分别为2, 8和22 d。从化蛹至头外翻完成为滞育前期, 头外翻完成约10 h内复眼中央游离脂肪体可见。头外翻的完成是滞育发生的前提, 非滞育、 夏滞育和冬滞育蛹头外翻发生在化蛹后的48, 36和83 h, 在头外翻过程中发育形态没有差异。头外翻的过程为： 首先, 头囊和胸部附肢从胸腔外翻, 头部形态出现; 然后, 腹部肌肉继续收缩, 将血淋巴和脂肪体推进头部及胸部附肢。葱蝇蛹在完成蛹期有效积温约15%时进入冬滞育或夏滞育。在滞育期, 蛹的形态一直停留在复眼中央游离脂肪体可见这一形态时期, 且冬滞育和夏滞育的蛹在形态上没有区别。在体长、 体宽和体重上, 冬滞育蛹最大, 夏滞育蛹次之, 非滞育蛹最小。在滞育后期, 在黄色体出现期间, 非滞育蛹的马氏管清楚可见, 呈绿色, 而滞育蛹的马氏管几乎不可见。本研究为认知昆虫滞育生理、 从发育历期和形态上推断滞育发育进程提供了依据。     

葱蝇夏滞育蛹体内DaFOXO1对超氧化物歧化酶基因表达及蛹发育历期的调控作用(英文)

【目的】本研究旨在调查葱蝇Delia antiqua夏滞育蛹体内DaFOXO1对超氧化物歧化酶(SOD)基因表达及蛹发育历期的调控作用。【方法】从葱蝇转录组数据中鉴定DaFOXO1下游铜锌超氧化物歧化酶基因DaCu/Zn SOD和锰超氧化物歧化酶基因DaMn SOD;利用生物信息学工具对DaCu/Zn SOD和DaMn SOD的氨基酸序列特征、亚细胞定位和系统发育关系进行分析。通过qRT-PCR方法分析DaFOXO1, DaCu/Zn SOD和DaMn SOD基因在葱蝇夏滞育蛹不同发育阶段的表达特点;进一步分析DaFOXO1基因被干扰后,葱蝇夏滞育蛹中DaCu/Zn SOD和DaMn SOD基因的表达特点、酶活性变化及对葱蝇夏滞育蛹发育历期的影响。【结果】鉴定到的葱蝇DaCu/Zn SOD(GenBank登录号: KR072551)的开放阅读框长459 bp,编码153个氨基酸,预测蛋白分子量为22.4 kD,等电点为6.44,属于细胞质型铜锌超氧化歧化酶;DaMn SOD(GenBank登录号: KR072549)的开放阅读框长648 bp,编码216个氨基酸,预测蛋白分子量为24.4 kD,等电点为8.85,属于线粒体型锰超氧化物歧化酶。氨基酸序列比对结果显示,DaCu/Zn SOD和DaMn SOD与其他10种双翅目昆虫的同源蛋白有75%~94%的氨基酸序列一致性,且具有典型的SOD家族序列特征;系统发育分析显示它们与铜绿蝇Lucilia cuprina同源蛋白形成高支持率的一支。qRT-PCR分析表明,DaFOXO1基因在滞育前期和滞育后期的表达量较高,而在滞育期的表达量低; DaCu/Zn SOD基因在滞育期和滞育后期呈高表达;但DaMn SOD基因在滞育前期和滞育期的表达量最高,在滞育后期次之。干扰DaFOXO1可显著抑制DaCu/Zn SOD和DaMn SOD的基因表达及相应酶活性,并能明显延长夏滞育蛹的滞育期。【结论】结果说明,DaCu/Zn SOD和DaMn SOD是FOXO1信号网络中的重要成员;DaFOXO1对葱蝇夏滞育蛹蛹期有重要调控作用。     

葱蝇热激蛋白DaHSP23基因的克隆及在冬滞育和夏滞育蛹中的表达分析

[目的]低分子量(12 ～43 kDa)热激蛋白(sHSPs)具有抗逆应答的功能,滞育是昆虫抵抗不良环境的特殊发育形式,但sHSPs在昆虫滞育发育过程中的作用仍不清楚.本研究克隆和特征化葱蝇Delia antiqua sHSP基因,并研究它在夏滞育和冬滞育发育过程中的表达模式,为阐明sHSPs在滞育发育上的功能奠定基础.[方法]通过RACE-PCR方法克隆了葱蝇HSP23基因,通过相似性比较分析了其特征、结构域及与双翅目代表性同源基因的系统发育关系;采用实时荧光定量PCR研究了该基因在葱蝇冬滞育蛹和夏滞育蛹发育过程中的表达情况,通过表达的差异比较揭示了该基因与滞育发育的关系.[结果]克隆出了葱蝇HSP23基因,命名为DaHSP23(GenBank登录号:HQ392521.1),其cDNA全长序列为904 bp,编码186个氨基酸,推测蛋白分子量为20.9 kDa,等电点为6.42.该基因的编码蛋白与其他双翅目昆虫的sHSPs有超过66％的氨基酸序列一致性,与已报道的其他双翅目昆虫的滞育相关HSP23基因同源.基因组测序显示该基因无内含子.DaHSP23基因在葱蝇非滞育蛹的发育过程中一直保持在较低的水平,各发育阶段间的表达量不存在显著差异.但在冬滞育和夏滞育蛹中,该基因从滞育起始期开始逐渐显著升高表达,到滞育维持期的中后期达到峰值,在滞育终止期逐渐降到较低的水平.[结论]DaHSP23基因在葱蝇冬滞育和夏滞育发育过程中明显上调表达,但存在差异,它在滞育期的调控可能是种专化的.DaHSP23可能在葱蝇两种类型的滞育上起重要作用.     

葱蝇热激蛋白DaHSP23基因的克隆及在冬滞育和夏滞育蛹中的表达分析（英文）

【目的】低分子量（12~43 kDa）热激蛋白(sHSPs)具有抗逆应答的功能,滞育是昆虫抵抗不良环境的特殊发育形式,但sHSPs在昆虫滞育发育过程中的作用仍不清楚。本研究克隆和特征化葱蝇Delia antiqua sHSP基因,并研究它在夏滞育和冬滞育发育过程中的表达模式,为阐明sHSPs在滞育发育上的功能奠定基础。【方法】通过RACE-PCR方法克隆了葱蝇HSP23基因,通过相似性比较分析了其特征、结构域及与双翅目代表性同源基因的系统发育关系;采用实时荧光定量PCR研究了该基因在葱蝇冬滞育蛹和夏滞育蛹发育过程中的表达情况,通过表达的差异比较揭示了该基因与滞育发育的关系。【结果】克隆出了葱蝇HSP23基因,命名为DaHSP23（GenBank登录号：HQ392521.1）,其cDNA全长序列为904 bp,编码186个氨基酸,推测蛋白分子量为20.9 kDa,等电点为6.42。该基因的编码蛋白与其他双翅目昆虫的sHSPs有超过66%的氨基酸序列一致性,与已报道的其他双翅目昆虫的滞育相关HSP23基因同源。基因组测序显示该基因无内含子。DaHSP23基因在葱蝇非滞育蛹的发育过程中一直保持在较低的水平,各发育阶段间的表达量不存在显著差异。但在冬滞育和夏滞育蛹中,该基因从滞育起始期开始逐渐显著升高表达,到滞育维持期的中后期达到峰值,在滞育终止期逐渐降到较低的水平。【结论】DaHSP23基因在葱蝇冬滞育和夏滞育发育过程中明显上调表达,但存在差异,它在滞育期的调控可能是种专化的。DaHSP23可能在葱蝇两种类型的滞育上起重要作用。     

基于转录组的葱蝇表皮蛋白基因家族的鉴定及在非滞育和冬滞育条件下的表达分析

【目的】昆虫表皮蛋白在昆虫的生长发育、抑制水分蒸发和抵御其他外界不良环境等方面起到重要的作用。通过转录组水平上葱蝇Delia antiqua表皮蛋白基因家族的鉴定及部分基因在非滞育和冬滞育条件下的表达规律分析,为进一步研究葱蝇表皮蛋白在滞育期的抗逆功能奠定基础。【方法】基于转录组数据,通过生物信息学方法对葱蝇表皮蛋白基因进行鉴定分析,系统进化和保守结构域分析并采用实时荧光定量PCR法比较分析了12个基因在葱蝇非滞育和冬滞育不同发育时期的表达变化。【结果】在葱蝇中鉴定出81个表皮蛋白基因,分别属于RR(71个基因)、CPAP(5个基因)和CPLC(5个基因)亚家族,其编码的蛋白质含有92~495个氨基酸,分子量约为8.692~52.2 k D,等电点为3.90~9.93。亚细胞定位预测结果显示67个全长表皮蛋白均为外分泌型。12个葱蝇表皮基因在非滞育和冬滞育过程中有明显不同的表达规律。【结论】葱蝇表皮蛋白基因RR-2型的保守基序中发生了基因突变,引起关键氨基酸的替换,这可能暗示它们在非滞育和滞育不同条件下,不同发育阶段中蛹皮结构重建和某些器官的发生方面发挥不同作用。该研究结果为进一步阐明葱蝇滞育蛹皮结构及抗逆功能的研究提供了重要理论基础。     

沙葱萤叶甲成虫不同夏滞育阶段的转录组分析(英文)

【目的】本研究旨在揭示内蒙古草原新害虫沙葱萤叶甲Galeruca daurica专性夏滞育相关的重要基因以及代谢通路。【方法】应用RNA-Seq技术,对沙葱萤叶甲成虫不同夏滞育阶段［滞育前期(PD)、滞育期(D)及滞育后期(TD)］进行转录组测序、分析及基因功能预测,基于RNA-Seq数据筛选夏滞育不同阶段差异表达基因;利用qPCR对基于RNA-Seq数据筛选的10个差异表达基因的表达水平进行验证。【结果】从9个文库中获得202 770 198 clean reads,将12 078 060条转录本组装获得82 292 条unigene,平均长度为783.59 bp,N50为1 545 bp。沙葱萤叶甲D vs PD和TD vs D 比较组分别有2 395(2 119上调和277下调)和62(59上调和3下调)个差异基因。KEGG分析表明,D vs PD和TD vs D比较组差异表达基因分别显著富集于糖孝解/糖异生通路和脂肪酸生物合成通路;此外,许多与钙离子信号转导相关的基因在滞育期间差异表达。10个差异表达基因的qPCR分析表明,RNA-Seq与qPCR结果高度一致。【结论】糖孝解/糖异生、脂肪酸生物合成及钙离子信号通路可能在沙葱萤叶甲滞育调节中起着重要的作用。本研究为进一步研究沙葱萤叶甲成虫专性夏滞育的分子机理奠定了基础。     

松毛虫赤眼蜂脂肪酸合酶基因的克隆、表达谱及其在滞育中的功能分析

【目的】本研究旨在克隆松毛虫赤眼蜂Trichogramma dendrolimi脂肪酸合酶(fattty acid synthase, Fas)基因(TdFas),并分析其在滞育中的调控功能,为松毛虫赤眼蜂滞育研究提供新依据。【方法】基于松毛虫赤眼蜂转录组数据,克隆TdFas的cDNA全长序列并进行生物信息学分析。利用RT-qPCR检测TdFas在松毛虫赤眼蜂滞育与非滞育预蛹、蛹和成虫及滞育诱导维持期预蛹和滞育解除期预蛹中的表达量。通过以1 000, 2 000和3 000 ng/μL dsTdFas溶液浸泡松毛虫赤眼蜂幼虫的RNAi方式干扰TdFas的表达,探究其对松毛虫赤眼蜂滞育率及甘油三酯相对含量的影响。【结果】克隆得到松毛虫赤眼蜂TdFas的cDNA序列全长为8 601 bp(GenBank登录号：OP146440),其开放阅读框长7 278 bp,推测编码一个2 426个氨基酸的蛋白,含有一个典型的脂肪酸合酶的β-酮酰还原酶结构域。系统发育分析结果表明,TdFas与膜翅目其他昆虫的FASs亲缘关系较近,其中与短管赤眼蜂Trichogramma pretiosum FAS亲缘关...     

转录后基因沉默(PTGS)及其在作物遗传改良中的应用

转录后基因沉默(PTGS)或RNA干扰(RNAi)技术的发展为创造植物遗传变异体提供了新途径。PTGS于1998年被明确为双链RNA(dsRNA)诱导的序列特异性基因沉默,短短几年内有关研究取得了突破性进展。结合利用PTGS技术进行的淀粉合成关键酶基因沉默研究,概述了PTGS的作用机理和特点、dsRNA表达载体设计、沉默效应的遗传稳定性及在作物改良应用方面的研究进展。研究表明,基因沉默效应可在子代间稳定遗传并可通过杂交进行重组,显示了其在农作物改良方面的应用潜力。     

基于转录组和基因表达谱的葱蝇分泌组挖掘及其在滞育发育中的可能作用分析（英文）

【目的】昆虫滞育是一种重要的季节性适应生存的环境生理现象,但是调控葱蝇Delia antiqua夏滞育和冬滞育的分子机理却知之甚少。本研究旨在鉴定与葱蝇蛹滞育相关的候选基因。【方法】利用RNA-seq和数字基因表达谱数据,通过生物信息学的方法预测分析葱蝇滞育相关的分泌蛋白,并进行了氨基酸序列相似性、基本理化性质分析;从表达谱中选取12个差异表达基因,利用qRT-PCR验证了它们在非滞育蛹以及夏滞育和冬滞育蛹的不同发育时期的表达特点。【结果】共鉴定出38个在葱蝇夏滞育蛹和冬滞育蛹之间差异表达的可能的分泌蛋白。同源基因注释表明,这些基因可能在气味分子结合、几丁质和脂类代谢、免疫及发育等方面发挥作用,其中脂类和几丁质代谢过程的调节似乎在滞育发育过程起到重要作用。qRT-PCR分析结果表明,12个被选择基因的表达谱与RNA-seq结果相吻合(R=0.862,P=0.001)。【结论】本研究为基于高通量测序的分泌组挖掘及滞育相关基因的鉴定提供了强有力地分析策略。     

葱蝇非滞育与夏滞育蛹蛋白的双向凝胶电泳比较分析

【目的】比较分析葱蝇Delia antiqua非滞育与夏滞育蛹的蛋白表达差异, 为进一步揭示昆虫滞育的分子调控机理和昆虫防治提供理论基础。【方法】以非滞育和夏滞育的蛹为材料, 提取总蛋白; 进行双向凝胶电泳和凝胶图像分析, 对并差异蛋白质进行MALDI-TOF MS质谱鉴定, 获得该点的质量指纹图谱; 利用MASCOT软件在NCBI和SWISS PORT蛋白质数据库中进行搜索鉴定。【结果】非滞育和夏滞育蛹的蛋白表达存在显著差异。通过质谱鉴定和生物信息学分析, 13个差异表达的蛋白质分别为胶原蛋白、 纺锤丝组装非正常蛋白6(SAS6)、 5,10-亚甲基四氢叶酸合成酶(MTHFS)、 Bnb蛋白(bangles and beads)及其他功能未知蛋白。【结论】葱蝇在夏滞育时期, 蛹体内的某些蛋白被上调或下调表达。本研究所鉴定的蛋白中, 部分可能是参与滞育相关的蛋白质网络中的成员, 它们可能在抗高温、 染色体分离、 叶酸代谢等生理过程中发挥重要作用。     

葱蝇海藻糖-6-磷酸合成酶基因的克隆、序列分析及滞育相关表达

海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase, TPS）是昆虫海藻糖合成途径中的关键酶之一。本研究通过对葱蝇Delia antiqua海藻糖-6-磷酸合成酶基因的克隆、 序列分析及滞育相关表达的分析, 旨在证明该基因在能源合成以及抵御高温和低温环境方面发挥重要作用, 为进一步弄清葱蝇滞育分子机制提供理论依据。根据葱蝇抑制消减杂交文库中的EST序列信息, 设计特异性引物, 并通过RACE技术克隆了葱蝇海藻糖-6-磷酸合成酶基因全长cDNA, 命名为DaTPS1 （GenBank登录号： JX681124）, 其全长为2 904 bp, 开放阅读框2 448 bp, 编码815个氨基酸, 推测其相对分子质量为91.2 kD, 等电点为5.96。生物信息学分析表明, 该基因编码的氨基酸序列具有两个保守结构域, 与其他物种TPS具有较高的同源性, 其中和黑腹果蝇Drosophila melanogaster亲缘关系最近, 氨基酸序列一致性为92.1%; 其蛋白质三维结构有15条大的α螺旋和11股反向平行的β链折叠。RT-PCR分析表明, DaTPS1在葱蝇非滞育、 夏滞育和冬滞育期蛹中都有表达, 但是非滞育期各时期表达量基本没有变化, 而在夏滞育和冬滞育蛹的滞育前期表达量较高, 滞育保持期表达量较低, 滞育期后期表达量又有所升高。推断在葱蝇蛹夏滞育和冬滞育期前期, TPS1开始催化合成较多的海藻糖以提高滞育期抵御不良环境的能力, 滞育保持期蛹的新陈代谢降低, 所需能量较少, 所以TPS1处于低水平表达状态, 而滞育期结束后, 蛹生长发育逐渐恢复, 所需能量有所增加, TPS1的表达量再次升高。本研究对揭示昆虫TPS在能量代谢通路中的作用及昆虫滞育的分子机理具有一定的科学意义。     

Characterization of a Nilaparvata lugens (Stål) brummer gene and analysis of its role in lipid metabolism

The brummer (bmm) genes encode the lipid storage droplet‐associated triacylglycerols (TAG) lipases, which belong to the Brummer/Nutrin subfamily. These enzymes hydrolyze the ester bonds in TAG in lipid metabolism and act in insect energy homeostasis. Exposure to some agricultural chemicals leads to increased fecundity, which necessarily involves lipid metabolism, in some planthopper species. However, the biological roles of bmm in planthopper lipid storage and mobilization have not been investigated. Here, the open reading frame (ORF) of bmm (Nlbmm) was cloned and sequenced from the brown planthopper (BPH; Nilaparvata lugens). The ORF is 1014 bp encoding 338 amino acid residues. Nlbmm contained patatin domains and shared considerable evolutionary conservation with other insect bmms. Nlbmm is highly expressed in the fat body, consistent with its roles in lipid metabolism. Injection with Nlbmm double‐stranded RNA (dsNlbmm) led to reduced Nlbmm mRNA accumulation, but did not influence expression of several genes related to lipid synthesis including acyl‐CoA‐binding protein (ACBP), acetyl‐CoA carboxylase (ACC), and a lipophorin receptor (LpR). Nlbmm knockdown led to increased TAG contents in whole bodies, accumulation of total fat body lipid, and decreased hemolymph lipid content. Nlbmm knockdown did not influence the synthesis and distribution of glycerol. We infer that Nlbmm acts in TAG breakdown and fat metabolism in N. lugens.     

Laboratory transmission and in vivo incubation of Entomophthora muscae (Entomophthorales: Entomophthoracae) in the onion fly,Delia antiqua (Diptera: Anthomyiidae)

A high-moisture infection chamber was used for the in vivo transmission of Entomophthora muscae within laboratory populations of the onion fly, Delia antiqua. This cadaver-to-fly transmission procedure provided an average experimental infection rate well above 95%. Laboratory infection and temperature-dependent incubation rates of E. muscae were further examined in adult populations of D. antiqua. The time from initial exposure until host death and pathogen sporulation was accurately predicted using a second-order function of the incubation temperature. A developmental base temperature of approximately 5°C was estimated, with 105 degree-days being the average number of heat units required between host infection and death. E. muscae transmission between D. antiqua and D. platura, two insect pests typically associated with Michigan onion production, was verified under laboratory conditions.