浙江乐清湾锯缘青蟹渔业生物学初步研究

锯缘青蟹(Scylla serrata)系为热带性种,在我国主要分布于南方诸省沿海,是构成潮间带滩栖游泳蟹类的优势种群之一。锯缘青蟹(以下简称青蟹)对环境适应性强,具有食性杂、生长快、易养殖、营养丰富、肉味鲜美、商品价值高等优点,近年来是颇受各国重视的优良养殖品种。由于对青蟹的生物学研究缺少,尚不能开展大规模的养殖。为此,作者于1979—1983年对具有亚热带海区特点的乐清湾青蟹生物学及其增殖作了深入的研究,现整理分述如下。     

WSSV对锯缘青蟹的致病性及血清酶指标影响

锯缘青蟹(Scylla serrata)俗称青蟹,是我国重要的海水养殖蟹类.近年来,浙江、福建、广东等青蟹主要养殖地区出现了严重的青蟹病害.对浙江省养殖青蟹的发病原因和流行病学调查发现,白斑综合征病毒(white spotsyndrome virus,WSSV)与青蟹发病存在较大相关性.为进一步研究WSSV对青蟹的致病性和发病机理,作者采用白斑综合征病毒的除菌过滤液,以1:10-1:10000稀释度注射感染青蟹,结果表明1:10、1:100感染组的青蟹死亡率达100%,1:1000感染组死亡率为66.7%,1:10000感染组死亡率为38.9%.根据攻毒悬液的病毒浓度计算出WSSV对青蟹的LD50为1.19×104拷贝/只(7.93×103拷贝/g组织);取WSSV感染青蟹血淋巴进行PCR检测,攻毒死亡青蟹的WSSV检出率为100%,表明WSSV对青蟹有很强的致病力.分析病毒感染濒死蟹的血清酚氧化酶(PO)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(ALP)、谷丙转氨酶(GPT)、符草转氨酶(GOT)等主要酶指标,发现病毒感染青蟹的PO、POD和SOD活力明显低于对照组,而ALP、GPT和GOT的活力则明显高于对照组;用WSSV单克隆抗体对感染蟹进行免疫组化分析,发现WSSV主要侵染青蟹的鳃、甲壳下表皮、心脏、肠、胃等组织的上皮细胞,尤其以鳃上皮细胞损害最为严重.     

锯缘青蟹精巢发育的组织学观察

组织学观察表明,锯缘青蟹（Scylla serrata)精巢发育周期可以分为精原细胞期,精母细胞期,精子细胞期,精子期和休止期5个时期。在划分精巢发育期的基础上,结合生精小管直径的成熟节段比例这2个指标,可以较准确地反映锯缘青解精巢的发育状况。而成熟节段比例可以作为锯缘青蟹精巢发育的表征指标。     

汕头牛田洋沿海围垦区锯缘青蟹病害爆发的环境因素

锯缘青蟹(Scylla serrata)是汕头市的传统特色和优势养殖品种,也是拥有3万多亩海水养殖池塘的牛田洋围垦区的主养品种。近年来,每年9-11月份,牛田洋的青蟹病害严重,经济损失较大。为探讨青蟹发病与养殖环境的关系,于2007年4月至12月份对牛田洋养殖区的水体理化因子和生物因子进行连续监测研究,结果发现:各因子呈现出明显的季节性变化。在发病前的7-8月份,青蟹处于较高水温(≥28℃)和较低盐度(≤6)环境中。在发病期(9-11月份),各种环境因子恶化,其中铵态氮(NH4+-N)和亚硝态氮(NO2--N)在9月份达到峰值,分别为235.63μg·L-1和27.75μg·L-1;硝态氮(NO3--N)(10.85μg·L-1)、无机磷(PO34—P)(39μg·L-1)及生物因子(水体异养菌157.93×105cfu·L-1、弧菌116.75×103cfu·L-1,干重底泥异养菌157.93×105cfu·g-1、弧菌141.65×103cfu·g-1)在10月份达到峰值。结果说明:水体理化因子的恶化和条件致病微生物的大量增生是青蟹病害爆发的重要原因。     

饲料碳水化合物水平对拟穴青蟹稚蟹生长、体成分和消化酶活性的影响

用碳水化合物水平分别为20.34%、25.59%、30.17%、35.30%和39.95%的5种等氮等脂饲料, 对初始体质量为(38.11±0.55) mg的拟穴青蟹(Scylla paramamosain)稚蟹进行3周的饲养试验, 探讨饲料不同碳水化合物水平对稚蟹生长、体成分和消化酶活性的影响, 以期确定拟穴青蟹稚蟹饲料碳水化合物的适宜需要量。结果表明, 不同碳水化合物水平饲料对拟穴青蟹稚蟹的成活率、生长均有显著影响(P<0.05), 均随碳水化合物水平的升高先显著增大(P<0.05)后显著减小(P<0.05), 均在碳水化合物水平为30.17%时达到最大值; 随着饲料碳水化合物水平的升高, 拟穴青蟹稚蟹的蛋白质和灰分含量也呈先显著升高(P<0.05)后显著降低(P<0.05)的趋势, 均在碳水化合物水平为35.30%时达到最大值, 而稚蟹的水分和脂肪含量没有显著变化(P>0.05); 不同碳水化合物水平饲料组拟穴青蟹稚蟹的蛋白酶和脂肪酶活性的变化不显著(P>0.05), 而淀粉酶活性有显著变化(P<0.05), 高碳水化合物水平饲料组(35.30%—39.95%)稚蟹的淀粉酶活性显著高于低碳水化合物水平饲料组(20.34%—25.59%,P<0.05)。在研究条件下, 饲料碳水化合物水平在25.59%—35.30%内, 拟穴青蟹稚蟹均表现出较好的生长率, 增重率和碳水化合物水平的回归分析表明, 稚蟹饲料碳水化合物的最适添加水平为29.93%。     

广东沿海地区拟穴青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒-1 的分子流行病学调查

运用双重巢式PCR 方法于2014 年10 月和11 月份对广东省阳江市、台山市、中山市、惠州市(大亚湾地区、惠东地区)、汕尾市(东涌地区、红海湾地区)等主要拟穴青蟹(Scylla paramamosain)养殖地区的青蟹呼肠孤病毒(mud crabreovirus, MCRV)和青蟹双顺反子病毒-1(mud crab discistrovirus-1, MCDV-1)流行情况进行检测调查和序列分析。结果表明在调查的地区中, 60%-100%的拟穴青蟹至少携带一种病毒。10 月份阳江地区、台山地区、中山地区、汕尾东涌和汕尾红海湾地区拟穴青蟹MCRV 携带率分别为71.42%、68.97%、70%、72.41%和64%, MCDV-1 携带率分别为61.29%、24.14%、63.33%、13.79%和12%; 各地区两种病毒双重感染率均在50%以下。11 月份阳江地区、台山地区、中山地区、惠州大亚湾地区和惠州惠东地区拟穴青蟹MCRV 携带率分别为50%、95.65%、100%、93.1%和82.76%, MCDV-1携带率分别为10%、100%、93.1%、37.93%和27.59%, 台山和中山地区地区两种病毒双重感染率均在90%以上, 惠州、汕尾地区以单独感染为主。五个地区获得的27 株MCRV 序列中, 各个地区内获得的核酸序列同源性均在99.2%-100%之间, MCRV 序列遗传进化基本无地域差异; 获得35 株MCDV-1 序列中, 各个地区内获得的核酸序列同源性均在91.4%-100%之间, MCDV-1 序列遗传进化出现一定的地域差异。     

拟穴青蟹线粒体COI基因序列克隆及SNPs位点分析

根据拟穴青蟹(Scylla paramamosain)线粒体全序列设计引物,采用PCR产物双向测序法,克隆了线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因部分序列(761 bp),并筛选、分析了拟穴青蟹的SNPs位点.共分析了采自福建省宁德市的16只拟穴青蟹,另外,从GenBank数据库中下载了31条前人提交的拟穴青蟹COI基因序列(长度在425-522 bp之间).利用MEGA 4.0软件对所有序列进行比对分析,结果表明碱基T、C、A和G的平均含量分别为37.6％、17.8％、28.9％和15.7％,G+C的含量平均为33.5％.分析结果表明,在所克隆的761bp的COI基因序列中共发现29个SNPs位点,其出现频率为3.8％.在这29个SNPs位点中,13个为C/T转换(占44.8％),12个为A/G转换(占41.4％),2个为A/T颠换(占6.90％),1个为G/C颠换(占3.45％),另有一个位点(201 bp处)发生了A/C颠换和C/T转换两种类型的碱基替换.氨基酸分析表明,在29个SNPs位点中,有9个位点属于非同义突变,引起了氨基酸的变化;其他20个位点属于同义突变,未引起氨基酸的变化.这将为拟穴青蟹遗传背景和群体遗传多样性研究提供新的分子标记.     

蟹视网膜电图的昼夜节律

本文报道昼夜节律对蟹视网膜电图(ERG)的敏感度、光谱敏感性和波形的影响。动物为锯缘青蟹(Scylla serrata),在自然日照条件下饲养于室内水池中。实验时动物不作麻醉,并保持在恒定的暗适应状态。记录和参考电极均为海水浸渍的棉芯线,经 Ag-AgCl 丝引出作直流记录。一架双光路刺激器提供白光或单色光,直接投射于复眼角膜表面。未作衰减时白光强度为3750μW/cm~2,文中光强均以衰减的对数单位表示。实验于1983年8月在福建厦门进行。     

拟穴青蟹OTUB的分子克隆及其在性腺发育过程中的表达

OTUB1是哺乳动物雌激素信号通路中的一个关键因子,它可以使雌激素受体α(ERα)去泛素化并抑制其转录活性.本研究从实验室拟穴青蟹(Scylla paramamosain)转录组测序数据库中筛选出OTUB基因片段,利用SMART RACE技术克隆得到Sp-OTUB的cDNA全长.该序列全长1 261 bp,包括5’非编码区(5’-UTR)40 bp,开放阅读框(ORF)804 bp和3’非编码区(3’-UTR)417 bp.其ORF编码267个氨基酸,预测其分子量为31 ku.该蛋白序列中包含一个OTU样的半胱氨酸蛋白酶催化结构域和一个由半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)和组氨酸(H)组成的催化三联体.实时定量PCR结果显示,Sp-OTUB在成熟拟穴青蟹各组织器官中均有表达,其中在血淋巴中的表达量最大,精巢中表达量最低.在卵巢发育过程中,Sp-OTUB的表达量在卵巢增值期为最大,与其他各时期具有显著差异;在精巢发育各阶段,Sp-OTUB表达量在精子细胞期达到最大,显著高于精母细胞期和成熟精子期.同源系统进化分析Sp-OTUB与大多数物种的OTUB1聚为一支,与肩突硬蜱(Ixodes scapularis)和紫海胆(Strongylocentrotuspurpuratus)亲缘关系最近.实验结果初步显示Sp-OTUB在拟穴青蟹生殖调控方面可能发挥重要作用.     

低温驯化锯缘青蟹鳃抗氧化防护、ATPase及膜脂肪酸组成变化

锯缘青蟹(Scylla serrata)低温环境下生理生化的变化对于理解其低温适应具有重要的意义。本研究中采用生物化学的方法对低温驯化下锯缘青蟹鳃中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX)的活性,脂质过氧化产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,4种ATPase(Na ,K -ATPase,Mg2 -ATPase,Ca2 -ATPase和Ca2 ,Mg2 -ATPase)活性及细胞膜脂肪酸组成进行测定。实验结果显示青蟹鳃中抗氧化酶(SOD、CAT和GPX)活性在3个驯化温度下,随驯化温度的降低而升高。SOD活性在5℃和10℃驯化下显著高于对照组(27℃组)(p<0.01);CAT活性在3个驯化温度下均显著高于对照组(p<0.01或p<0.05);GPX活性仅5℃驯化下显著高于对照组(p<0.01)。MDA含量低温驯化下升高,但仅5℃驯化下显著高于对照组(p<0.01)。鳃中4种ATPase活性均是随驯化温度的降低而升高,并且5℃和10℃驯化下均显著高于对照组(p<0.01或p<0.05)。低温驯化下C18:0、C18:1、C18:2、C18:3、C20:5和C22:6等脂肪酸与对照组相比均发生显著性变化(p<0.01或p<0.05),饱和指数∑SFA/∑UFA显著下降(p<0.01或p<0.05)。低温驯化下锯缘青蟹鳃中抗氧酶及ATPase活性升高,说明其具有明显的温度补偿效应,它是对低温适应的一种积极反应。鳃中MDA低温驯化下积累是活性氧自由基未能被及时清除而产生氧化应激的结果。低温下细胞膜脂肪酸饱和指数降低是维持细胞膜执行正常生理功能的需要。     

低温胁迫下两种不同形态群体拟穴青蟹转录组分析

为研究拟穴青蟹(Scylla paramamosain)不同形态群体对温度变化的适应差异,以Sp1群体(腕节外缘中部都不具有发达的刺)和Sp2群体(至少一只螯足腕节外缘中部具有发达的刺)为研究对象,选用低温胁迫组(8℃)和对照组(20℃)拟穴青蟹肝胰腺为实验材料,进行转录组测序。结果显示,测序共获得81853个Unigene,平均长度为420 bp, N₅₀为1460 bp,其中22.33%为已知基因。差异表达基因筛选发现Sp1群体在低温胁迫下共有15773个Unigene显著差异表达,其中15628个Unigene表达下调, 145个Unigene表达上调,这些Unigene显著富集于细胞质基质等生物学过程和RNA结合、核糖体结构组分等分子功能,并进一步富集在核糖体、剪接体和内质网蛋白质加工等信号通路。Sp2群体在低温胁迫下共有323个Unigene显著差异表达,其中上调114个,下调209个。这些Unigene显著富集于DNA整合等生物学过程和甾体羟化酶活性、碳酸氢盐跨膜转运体活性等分子功能,并进一步富集在赖氨酸降解、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢、精氨酸和脯氨...     

拟穴青蟹两种新C-型凝集素基因的克隆与表达分析

为研究拟穴青蟹(Scylla paramamosain)中C-型凝集素(C-lectin)的功能, 从其肝胰腺中克隆获得全长858 bp和598 bp的两个C-型凝集素分子, 分别命名为Sp-lectin3和Sp-lectin4, 其推导的氨基酸序列含有信号肽和一个CRD, 其中Sp-lectin4还具有糖类结合的特征性基序QPD。Sp-lectin3和Sp-lectin4的开放阅读框分别由5个和4个外显子编码。在正常养殖青蟹的肝胰腺中该两个基因表达量最高, 其次是射精管(Sp-lectin3)或肠(Sp-lectin4); 除脑和储精囊外的所检测组织/器官中, Sp-lectin4表达量均高于Sp-lectin3。随着胚胎的发育, 该两个基因表达量逐渐升高, 峰期为溞状幼体, 而大眼幼体期的表达量急剧下降, 仔蟹期再回升; 在胚胎发育阶段除囊胚期外, Sp-lectin4表达量极显著高于Sp-lectin3(P0.01), 相反, 在胚后发育阶段除大眼幼体II期外, Sp-lectin3表达量却极显著高于Sp-lectin4(P0.01)。副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus) 人工感染, 可诱导Sp-lectin3在储精囊和射精管中的表达, 分别在感染后12h和6h显著上调(P0.05); 同时, 可诱导Sp-lectin4在肝胰腺中的表达, 并在感染后12h和18h显著上调(P0.05)。结果表明, Sp-lectin3和Sp-lectin4可能参与拟穴青蟹的抗细菌感染免疫反应, Sp-lectin3侧重于生殖系统如射精管和储精囊中发挥作用, 而Sp-lectin4侧重于在肝胰腺。       

锯缘青蟹复眼的形态和超微结构

对锯缘青蟹(Scylla serrata)的复眼做了电镜观察。扫描电镜下,半球形复眼的背面有一拇指状的无小眼区。透射电镜下,小眼为十足目短尾类特有的长六边形;复眼内小眼的感光系统包括了11个小网膜细胞(RCs),4个RCs位于感光部分的远端,7个RCs构成了感光系统的近端主体;上下两群细胞连接处清晰显示“4 7”且有局部交错的结构。这与三疣梭子蟹和罗氏沼虾溞状幼体的文献记述相似,而与蜘蛛蟹和中华绒螯蟹的“1 7”结构不同,可能与它们对视觉依赖程度差异有关。     

A convenient immunochromatographic test strip for rapid detection of Scylla serrata reovirus

<正>Dear Editor,Scylla serrata reovirus(SsRV),first discovered in China in 2004,is now known to be widespread in the mud crab(Scylla serrata)farming pond of China.(Chen et al.,2008).Since there are no effective treatments currently available for this viral pathogen,early diagnosis is the     

低温驯化下锯缘青蟹肝胰腺蛋白质表达及脂肪酸组成的变化

锯缘青蟹(Scylla serrata)在不同低温下经3周驯化后,采用双向电泳(Two division electrophoresis,2D-E)和气相色 谱(Gas chromatography,GC)分别对肝胰腺中蛋白质表达和脂肪酸组成变化进行研究,结果发现5℃驯化组与27℃组 相比,肝胰腺中共有22种蛋白的变化,其中5℃驯化组有15种蛋白在27℃组没有检出,而27℃组有7种蛋白在5℃ 驯化组没有发现;10℃驯化组与27℃组相比,共有18种蛋白变化,10℃驯化组有14种蛋白在27℃组没有检出,27℃ 组有4种蛋白在10℃驯化组没有出现;锯缘青蟹15℃驯化组与27℃组相比,肝胰腺中有6种蛋白质有变化,其中驯 化组分离出5种在27℃组没有检出的蛋白质,27℃组分离出1种在驯化组没有出现的蛋白质。27℃组没有检出,仅 在驯化组中出现的蛋白质中,经Imagemaster2D Elite软件分析后发现5℃和10℃驯化组有14种蛋白质在图谱上是匹 配的(即是同样的),15℃驯化组表达的5种蛋白与5℃驯化组和10℃驯化组表达的蛋白不匹配。低温驯化3周后 锯缘青蟹肝胰腺中饱和脂肪酸∑SFA在5℃和10℃驯化组显著低于27℃组(P<0．05),而∑UFA在5℃和10℃驯化 组显著高于27℃组(P<0．05),相应地5℃和10℃驯化组饱和指数∑SFA/∑UFA也显著低于27℃组(P<0．05),其 主要是∑PUFA-ω6低温驯化下显著升高(P<0．01)所致。结论表明锯缘青蟹不同低温驯化下,肝胰腺细胞中蛋白 质表达是一种动态变化模式。驯化温度越低,差异蛋白变化越大。低温驯化下脂肪酸饱和指数降低,主要是维持 低温下肝胰腺正常的生理功能。     

锯缘青蟹(Scylla serrata)Hsp70基因cDNA的克隆及序列分析

采用RT-PCR及RACE技术克隆锯缘青蟹(Scylla serrata)的热休克蛋白Hsp70基因并进行序列分析。克隆测序后拼接得到一条长2482 bp的cDNA序列,该序列ORF(Open reading frame,开放阅读框)为1950 bp,编码649个氨基酸,分子量约为71.06 kD,理论等电点为5.24。3'UTR(untranslated region,非编码区)为158 bp,5'UTR为40 bp。通过antheprot分析发现2个Hsp70家族的签名序列:IFDLGGGTFDVSIL,IVLVGGSTRIPKIQK;Dnak特征基序DLGTT-S-V;非细胞器基序:RARFEEL;核定位信号标签:KKDPSESKRALRRL;胞质Hsp70特征基序EEVD。同源性分析表明,锯缘青蟹Hsp70编码区核苷酸序列与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)的相似性分别为84.02%、83.87%和79.60%;核苷酸序列所推导出的Hsp70氨基酸序列,与凡纳滨对虾、斑节对虾和罗氏沼虾的相似性分别为92.79%、92.17%和96.47%。本研究克隆了锯缘青蟹Hsp70基因,为进一步深入研究锯缘青蟹的抗逆机理及其遗传改良奠定了基础。     

拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因原核表达条件的优化

旨在优化拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因原核表达条件。克隆拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因成熟肽片段,与p ET-28a表达载体连接后,转入到大肠杆菌BL21(DE3)中,通过优化条件进行诱导表达。结果显示,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.2 mmol/L、37℃条件下培养4 h后表达量最大,分子大小与预期值相符。融合蛋白主要以包涵体形式高效表达,通过His Trap HP柱子使其得到进一步纯化。Western blot分析表明,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合。说明通过优化表达条件,获得拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因原核表达表达产物。     

北部湾6个拟穴青蟹群体遗传多样性的ISSR分析

应用ISSR标记技术分析来自北部湾的拟穴青蟹6个地理群体(清化、党江、钦州湾、流沙湾、珍珠湾、闸口)的遗传变异和遗传结构,8条ISSR引物扩增111个个体,分析其中的66个位点,56个位点表现出多态性,表明拟穴青蟹在物种水平上的多态位点百分率是84.85％.拟穴青蟹6个群体的多态位点百分率为51.52％ ～63.64％,平均为57.58％.群体的遗传多样性按自高至低顺序排列为清化群体＞党江群体＞钦州湾群体＞流沙湾群体＞珍珠湾群体＞闸口群体.拟穴青蟹在种水平或群体水平上的多态位点百分率和Shannon信息指数表明,拟穴青蟹遗传多样性在甲壳类动物中处于较高层次,但比甲壳类以外的几类经济海产动物遗传多样性低.总的遗传分化系数GST值为0.1841,表明,总遗传变异的绝大部分存在于群体内,群体间的遗传分化程度较大.但是,绝大部分两两群体间的遗传分化系数值在0.0689 ～0.1276,为中等程度的遗传分化.AMOVA分析表明,群体内遗传变异占87.97％,群体间遗传变异占12.03％,群体间遗传分化程度中等但分化显著.Mantel test结果表明,拟穴青蟹6个群体间的遗传距离与地理距离之间的相关性不显著.聚类分析表明,来自广西沿海的4个群体聚成一支.     

锯缘青蟹视网膜电图特性的昼夜节律变化

本文系统地分析了锯缘青蟹scylla serrata视网膜电图特性(敏感度、光谱敏感性和波形)的昼夜节律性变化。这种节律性可能主要是由于视网膜屏蔽色素位置的昼夜变化所致,但也可能存在另一种机制。     

褶皱臂尾轮虫的培养试验

本文是作者于1989年5—10月间,于广西防城县在锯缘青蟹人工育苗试验中进行的试验,试验用普通面粉及黄豆加工成发酵面粉与豆浆作轮虫的主饵料,用动物性饵料如小鱼汁、螺肉汁、蛤肉汁、发酵人尿等含有机质丰富的液体作辅助饵料,用7个25m~3的大池培养,共培养出了约900×10~(10)多个轮虫,供给锯缘青蟹幼体足够的活饵料,使当年培养出C_1期以上的幼蟹达22.269万只。本试验中,光照对轮虫的生长繁殖有较大影响。