汉滩病毒西安分离株84FLi的L片段核苷酸序列测定以及分析

采用逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR) ,分节段扩增汉滩病毒 84FLi株的L基因片段cDNA ,纯化的PCR产物片段直接用于序列测定或克隆入 pND18 T载体中进行测序。结果表明 ,84FLi株的L片段cDNA由 6 5 33个核苷酸组成 ,四种核苷酸的比例分别为A33.39% ,C16 .4 3% ,G2 0 .74 % ,T2 9.4 4 %。GC含量为 37.17% ,AT含量为6 2 .83%。推导出的最大开放读码框架为从 38到 6 4 93,共编码 2 15 1个氨基酸。序列同源性分析表明 ,84FLi株核苷酸与HTN型国际标准毒株 76 118的同源性为 83.7% ,差异性为 18.8% ;而与中国株A9的同源性高达 97.6 % ,差异性仅为 2 .4 %。与SEO型代表Seoul80 39的同源性为 75 .2 % ,6 6 .1%～ 6 6 .5 %。L片段的氨基酸比较分析表明 ,L片段与HTN型间的同源性为 97.5 %～ 98.0 % ,而与SEO型的同源性为 83.5 %～ 85 .5 %。与PUC、TUL、SN和AND等其它型汉滩病毒的同源性仅为 6 8.6 %～ 6 9.6 %。结果表明 84FLi株属于HTN型 ,并与分离自国内的HTN型病毒高度同源     

汉滩病毒M片段的核苷酸序列变异和系统发生树分析

The total RNA was extracted from two clinical blood samples of HFRS patients and the RNA was amplified by RT-PCRThe amplified DNA fragment of sample 613 involved nucleotides 1,471-1,873,and the sample 226 involved 540-1,244 nucleotides of M fragment of Hantaan virusThen the amplified PCR products were sequenced directlyThe sequencing results demonstrated that there was 84% identity between sample 613 and HV114 virus strain,but was 99% between sample 613 and HTN76-118 strainHowever,in sample 226,there was 95% sequence identity with HV114,82% with HTN76-118The results of phylogenetic tree analysis showed that HV613 was located in the same linage with HTN76-118,the HV226 was in the same linage with HV114 and A9 strains     

汉坦病毒中国疫苗株Z37M片段的克隆及序列分析

汉坦病毒Z37株是从褐家鼠体内分离到的,用于生产双价肾综合征出血热疫苗的病毒毒株之一,血清分型为SEO型,利用RT－PCR方法扩增Z37株M基因片段cDNA,克隆入质粒载体,进行核苷酸序列测定及分析。Z37株M基因片段由3651个核苷酸组成,只有一个开放读码框架,共编码1133个氨基酸。与HTN型病毒（76－118、A9、HV－114）的核苷酸和氨基酸同源性分别为71.8%-72.1%、76.2%-76.7% ,与SEO型（R22、L99、80－39）的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.3%-96.1%、95.3%-98.9%。这一结果的获得进一步从分子水平确定了Z37株的型别,并为研制M基因片段重组疫苗打下基础。     

肾综合征出血热病毒Gou3株M片段的分子特性及序列的比较分析

为测定我国肾综合征出血热病毒Ｇｏｕ３株的Ｍ片段全基因序列,了解该株分子基础,并分析其瑟其他病毒株的差异,将提取的感染了病毒的Ｖｅｒｏ－Ｅ６细胞总ＲＮＡ进行逆转录ＰＣＲ扩增,产物直接或纯化后克隆Ｔ载体并测定序列,结果测得Ｇｏｕ３株Ｍ片段的全基因序列共３６５１个核苷 ,最大读码框架从４７到３４４８,共编码１１３４个氨基酸。     

汉滩病毒84FLi株L片段全长cDNA克隆的构建及鉴定

目的：克隆汉滩病毒84FLi株L片段的cDNA。方法：提取病毒总RNA,反转录为cDNA模板,用高保真的Toq酶扩增出含有L片段部分克隆的片段84L1（1-1875）、84L2（1725—3352）、84L3（2921-4961）和84L4（4727—6533）,将这4个片段分别与T载体pGEM-T-Easy连接,转化感受态大肠杆菌后获得4个克隆pGEM—L1、pGEM—L2、pGEM—L3和pGEM—L4。利用酶切连接方法获得pGEM—L12和pGEM-L34,2段产物覆盖全长的L片段,并且于2921—3352nt区域内相互重叠;再利用酶切连接的方法获得了含有L片段全序列的cDNA克隆。结果：获得6个含有L片段部分片段的克隆,进而酶切组装为含有L片段全序列的cDNA克隆。结论：应用分段克隆和逐次拼接法成功构建了84FLi株L片段全序列的cDNA克隆。     

汉滩病毒S片段基因编码区在Vero-E6细胞中的表达

The coding region of S genome segment of Hantaan virus (76/118 strain) was inserted into the eukarytic expression plasmidpVR1012. The recombinant expression plasmid pVRS22 was constructed. Vero-E6 cells were transiently transfected in vitro with pVRS22 plasmid. The transient expression of Hantaan virus nucleocapsid proteins in Vero-E6 cells was detected by indirect immunofluorescence assay (IFA) with monoclonal antibody 5H5 against Hantaan virus.     

汉坦病毒中国疫苗株Z37M片段的克隆及序列分析

汉坦病毒Z37株是从褐家鼠体内分离到的,用于生产双价肾综合征出血热疫苗的病毒毒株之一,血清分型为SEO型。利用RT-PCR方法扩增Z37株M基因片段cDNA,克隆入质粒载体,进行核苷酸序列测定及分析。Z37株M基因片段由3651个核苷酸组成,只有一个开放读码框架,共编码1133个氨基酸。与HTN型病毒(76-118、A9、HV-114)的核苷酸和氨基酸同源性分别为71.8%～72.1%、76.2%～76.7%,与SEO型(R22、L99、80-39)的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.3%～96.1%、95.3%～98.9%。这一结果的获得进一步从分子水平确定了Z37株的型别,并为研制M基因片段重组疫苗打下基础。     

口蹄疫病毒O/NY00株基因组L片段的克隆及其基因特征

采用RT—PCR方法对口蹄疫病毒O／NY00株基因组L片段进行了分子克隆和序列测定。结果表明：获得的O／NY00株基因组L片段长7805nt,其中包括715nt的5’非编码区和6999nt的多聚蛋白编码区。将O／NY00株与其它参考毒株进行序列比较,结果显示：O／NY00株与O／SKR／2000、O／1JKG／3／2001遗传关系最近,而与其它毒株遗传关系较远,属于0型口蹄疫ME-SA拓扑型Pan／ksia株的成员。与Cathay拓扑型的代表毒株O／TAW／97比较,两者在主要抗原位点1和位点3呈现出明显的以拓扑型为特征的氨基酸差别,提示两拓扑型毒株之间有较高的抗原差异。     

我国肾综合出血热疫苗生产株LR1株的基因组序列分析

为测定我国肾综合征出血热疫苗生产株LR1株的全基因组序列,了解该株分子基础,从提纯的细胞总RNA逆转录PCR扩增,产物纯化后克隆T载体纯化后测序,结果证明,LR1株全基因组序列由L6533、M3616、S片段的1692个核苷酸组成,依各自读码框架分别编码21511、1135、429个氨基酸。序列同源比较分析表明,LR1毒株与国外HTN型毒株高度同源,属同一亚型,尤其与HTN代表株75－1183个片段同源率高达99．3％－99．8％,而与国内的HTN型病毒差异较大,同源率仅为79．4％－84．6％。氨基酸比较也显示了同样的结果。     

汉滩病毒A9株强毒和弱毒克隆M基因片段G1糖蛋白编码区核苷酸序列的分析比较

采用逆转录－ＰＣＲ方法,用３对引物分３个片段扩增强毒克隆（Ａ９ｖ）及弱毒克隆（Ａ３％）的Ｍ基因片段ｃＤＮＡ,并克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体中。采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧法测定了Ａ３９ｓ、Ａ９ｖ病毒Ｇ１糖蛋白编码区的全序列,发现二者均由１９７８个核苷酸组成,比７６／１１８株少６个核苷酸,并发现Ａ３９ｓ在Ｇ１编码区有３３个碱基及８个氨基酸与Ａ９ｖ不同。进一步与７６／１１８、ＨＶ１１４的相关序列比较,发现Ｇ１编码区的第６０６、６１４位氨基酸的变异同Ａ３９ｓ病毒的减毒有一定相关。从Ａ３９ｓ、Ａ９ｖ、７６／１１８及ＨＶ１１４４株病毒Ｇ１糖蛋白编码区推导的氨基酸序列亲疏水性资料显示,在位于Ｇ１糖蛋白Ｃ末端的最大亲水区域的６００～６２０位氨基酸区域,弱毒株Ａ３９ｓ同强毒株Ａ９ｖ、７６／１１８、ＨＶ１１４的亲水性有明显不同,而这一差异又主要由第６１４位氨基酸的变异所引起。因此推测,Ｇ１糖蛋白Ｃ端亲水区域同汉滩病毒毒力相关,而第６１４位的精氨酸被谷氨酰胺取代,同Ａ３９ｓ病毒毒力的减弱可能有关。     

Complete Genome Sequence Analysis of a Newcastle Disease Virus Isolated from a Wild Egret

We report here the complete genomic sequence of a novel Newcastle disease virus (NDV) strain, egret/China/Guangxi/2011, isolated from an egret in Guangxi Province, southern China. A phylogenetic analysis based on a fusion gene comparison with different NDV strains revealed that egret/China/Guangxi/2011 was phylogenetically close to genotype VIIa NDV, and the deduced amino acid sequence was ¹¹²R-R-R-K-R-F¹¹⁷ at the fusion protein cleavage site. The whole nucleotide sequence had the highest homology (93.3%) with the sequence of strain chicken/Sukorejo/019/10 (GenBank accession number {"type":"entrez-nucleotide","attrs":{"text":"HQ697255","term_id":"359358674","term_text":"HQ697255"}}HQ697255). This study will help us to understand the epidemiology and molecular characteristics of Newcastle disease virus in a migratory egret.     

我国一株鹦鹉幼雏病病毒全序列测定与初步分析

采用鸡胚成纤维细胞(CEF)培养增殖首次从湖北省云梦县分离的鹦鹉幼雏病病毒(Budgerigar fledgling dis ease virus,BFDV)分离株(BFDV HBYM02),经 PCR分段扩增法获得全基因组并完成序列测定。HBYM02 株全序列测定结果与GenBank中仅有的六株BFDV全序列进行同源性与进化分析。经BLAST分析,HBYM02株与其他六株BFDV同源性为98%~99%,为同一个基因型。运用Phylip3.5软件构建进化树,分析显示,来源于不同宿主的BFDV与宿主关系紧密,与地理分布没有明显的相关性。     

我国一株鹦鹉幼雏病病毒全序列测定与初步分析

采用鸡胚成纤维细胞(CEF)培养增殖首次从湖北省云梦县分离的鹦鹉幼雏病病毒(Budgerigar fledgling disease virus,BFDV)分离株(BFDV-HBYM02),经PCR分段扩增法获得全基因组并完成序列测定.HBYM02株全序列测定结果与GenBank中仅有的六株BFDV全序列进行同源性与进化分析.经BLAST分析,HBYM02株与其他六株BFDV同源性为98%～99%,为同一个基因型.运用Phylip3.5软件构建进化树,分析显示,来源于不同宿主的BFDV与宿主关系紧密,与地理分布没有明显的相关性.     

菊花R病毒杭白菊分离株全基因组序列测定与分析

杭白菊作为著名的中药“浙八味”之一,种植规模和产区不断扩大,但其病毒病的发生也日益严重,对其产量和品质造成严重影响。本研究利用双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）和非序列依赖PCR扩增（sequence independent amplification,SIA）等方法,对感病杭白菊病原物进行鉴定,为杭白菊病毒病原的检测构建一套快速和简便的方法。结果表明,感病杭白菊被菊花R病毒（Chrysanthemum virus R,CVR）侵染,将其命名为CVR-TX。通过对其全基因组进行序列扩增与分析,获得其全长基因组为8 872 bp,编码6个ORF,具有Carlavirus属病毒的典型特征。基于全基因组核酸序列以及复制酶、外壳蛋白氨基酸的序列比对发现,CVR-TX与CVR-BJ同源性最高,分别为85.5%、96.0%和96.3%;与Carlavirus属其他病毒同源性分别在48.2%～54.4%、46.9%～55.3%和36.8%～59.5%,因此CVR被确定为一种新的Carlavirus属病毒。系统进化分析表明,基于全长基因组、复制酶（replicase）基因和外壳蛋白（coat protein,CP）基因与CVR-BJ聚为一簇,亲缘性最近。本研究获得了CVR-TX的全长基因组,丰富了CVR的基因组信息,通过生物信息学分析明确其种属关系和区域变化情况,从而为建立CVR可靠灵敏的分子检测手段和有效的防控措施提供理论基础。     

菊花R病毒杭白菊分离株全基因组序列测定与分析

杭白菊作为著名的中药“浙八味”之一,种植规模和产区不断扩大,但其病毒病的发生也日益严重,对其产量和品质造成严重影响。本研究利用双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）和非序列依赖PCR扩增（sequence independent amplification,SIA）等方法,对感病杭白菊病原物进行鉴定,为杭白菊病毒病原的检测构建一套快速和简便的方法。结果表明,感病杭白菊被菊花R病毒（Chrysanthemum virus R,CVR）侵染,将其命名为CVR-TX。通过对其全基因组进行序列扩增与分析,获得其全长基因组为8 872 bp,编码6个ORF,具有Carlavirus属病毒的典型特征。基于全基因组核酸序列以及复制酶、外壳蛋白氨基酸的序列比对发现,CVR-TX与CVR-BJ同源性最高,分别为85.5%、96.0%和96.3%;与Carlavirus属其他病毒同源性分别在48.2%～54.4%、46.9%～55.3%和36.8%～59.5%,因此CVR被确定为一种新的Carlavirus属病毒。系统进化分析表明,基于全长基因组、复制酶（replicase）基因和外壳蛋白（coat protein,CP）基因与CVR-BJ聚为一簇,亲缘性最近。本研究获得了CVR-TX的全长基因组,丰富了CVR的基因组信息,通过生物信息学分析明确其种属关系和区域变化情况,从而为建立CVR可靠灵敏的分子检测手段和有效的防控措施提供理论基础。     

Complete Genome Sequence of Duck Tembusu Virus,Isolated from Muscovy Ducks in Southern China

We report here the complete genomic sequence of the duck Tembusu virus (DTMUV) WJ-1 strain, isolated from Muscovy ducks. This is the first complete genome sequence of DTMUV reported in southern China. Compared with the other strains (TA, GH-2, YY5, and ZJ-407) that were previously found in eastern China, WJ-1 bears a few differences in the nucleotide and amino acid sequences. We found that there are 47 mutations of amino acids encoded by the whole open reading frame (ORF) among these five strains. The whole-genome sequence of DTMUV will help in understanding the epidemiology and molecular characteristics of duck Tembusu virus in southern China.     

Complete Genome Sequence of a J Subgroup Avian Leukosis Virus Isolated from Local Commercial Broilers

Subgroup J avian leukosis virus (ALV-J) isolate GDKP1202 was isolated from a 50-day-old local yellow commercial broiler in the Guangdong province of China in 2012. Here we report the complete genomic sequence of the GDKP1202 isolate, which caused high mortality, serious growth suppression, thymic atrophy, and liver enlargement in commercial broilers. A novel potential binding site (5′-GGCACCTCC-3′) for c-myb was identified in the GDKP1202 genome. These findings will provide additional insights into the molecular characteristics in the genomes and pathogenicity of ALV-J.     

山东一株鹦鹉幼雏病病毒全序列测定与分析

目的:对青岛即墨地区发病的濒死鹦鹉进行诊断,并对BFDV进行全基因测序,分析其遗传进化规律.方法:利用PCR对发病鹦鹉进行BFDV的检测,并设计引物进行BFDV全基因组的测序.结果:BFDV核酸扩增为阳性,经PCR分段扩增法获得全基因组并完成了序列测定.QDJM01株全序列测定结果与GenBank中仅有的七株BFDV全序列进行同源性比较与进化树分析.经BLAST和DNAStar软件分析,QDJM01与其他七株BFDV同源性为99.0%～99.6%,为同一个基因型.结论:此病例为鹦鹉幼雏病病毒感染,来源于不同宿主的BFDV与宿主关系紧密,与地理分布没有明显的相关性.