gfp基因标记的重组杆状病毒对棉铃虫幼虫的侵染历程

 用携带杆状病毒极晚期多角体蛋白基因启动子驱动gfp表达的重组病毒rHa FGP感染棉铃虫三龄幼虫 .在感染后不同时间取样 ,分离不同组织 ,制片 ,置于倒置荧光显微镜下观察基因的表达 .结果发现 ,随着感染时间的推移 ,荧光产生的部位出现更替 ,随后荧光强度也发生相应的变化 .从荧光出现的先后初步推断出杆状病毒对昆虫幼虫的侵染路线 :中肠上皮→血淋巴→气管系统→脂肪体 真皮 .在幼虫感染后 12h荧光即出现于中肠细胞中 ,表明此时已有极晚期蛋白表达 .说明利用杆状病毒极晚期基因启动子驱动苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因 (cry)表达 ,从而提高杆状病毒的杀虫毒力是可行的     

昆虫杆状病毒应用于哺乳动物基因治疗的研究进展

杆状病毒是一类宿主特异性的昆虫病毒。昆虫杆状病毒表达系统是一个高效的真核表达系统,被广泛用于在昆虫细胞或昆虫幼虫中生产外源蛋白质。杆状病毒不能感染哺乳动物,却可以进入不同物种和组织来源的多种哺乳动物细胞,并在合适的哺乳动物启动子控制下表达外源基因。杆状病毒在哺乳动物细胞中不能复制,对细胞没有毒性,加上杆状病毒本身具有基因组大、可操作性好等优点,作为哺乳动物基因治疗的载体,将治疗基因传递给哺乳动物细胞已受到了广泛关注。在此就杆状病毒作为基因治疗载体的最新研究进展进行了阐述并探讨其发展趋势。     

昆虫杆状病毒表达系统的研究进展与应用

昆虫杆状病毒表达载体系统具有安全性好、重组蛋白表达量高、能同时表达多个基因、重组蛋白翻译后加工完整等特点,因而得到了广泛的应用。随着重组杆状病毒构建技术的不断发展,昆虫杆状病毒表达载体系统的操作在逐渐简化,重组杆状病毒获得的效率也在不断提高。昆虫细胞培养技术的改进和转基因昆虫细胞系的发展,进一步推动了昆虫杆状病毒表达载体系统在商品化药物、治疗性抗体、生物农药研发和基因治疗中的应用。尽管仍存在着重组蛋白降解的问题,但随着分子生物学技术的发展,对杆状病毒载体的研究与改造也会更加深入,未来昆虫杆状病毒表达载体系统的应用将更为广泛。     

携带苏云金芽胞杆菌cry1Ac10基因重组杆状病毒的构建及其杀虫活性

用Bac-to-Bac系统,构建了包含极晚期基因ph启动子驱动的带有全长苏云金芽胞杆菌cryIAc10基因和完整多角体基因的重组质粒pFCP, 用该重组质粒感染昆虫Sf9细胞,得到了带有多角体和能够表达cry1Ac10基因的重组杆状病毒vFcph,并在昆虫细胞中表达了Cry1Ac10蛋白.同时构建了含cry1Ac10的穿梭载体pHTC,并分别转化大肠杆菌、枯草杆菌和苏云金杆菌晶体缺陷型菌株,结果表明此三种工程菌均表达了分子量为133.3kDa的原毒素蛋白,其中在苏云金芽胞杆菌中的表达量最高.生物测定表明重组杆状病毒vFcph的表达产物具有杀虫活性,能增加杆状病毒力,加快杆状病毒杀虫速度,说明利用杆状病毒极晚期基因启动子驱动苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白表达,从而改善杆状病毒的杀虫特性是可行的.     

农业上的应用

生物防治组织与原生质体培养932031启动子对杆状病弃介导的甚因在受纳和非受纳昆虫组饱系中农达的形响一英〕/Morris,T.D.一,J .Virol一1992,65(12)一7397~7405〔译自DBA,1995,12(i),93一00265〕 在宜组杆状病毒(首藉银纹夜蛾核多角体病毒)侵染7种昆虫细胸系期间,试验了代表早、晚和极晚期启动子的3种病毒启动子和昆虫启动子(果蝇hsp7。启动子(HP”表达的瞬时形式和相对强度。结果表明,极晚期启动子活性主要受受纳细胞限制。在非受纳细胞中,晚期启动子的表达不象受纳细胞那样高,但比病毒早期启动子的表达要高。来自病毒衍生HP的非受纳…     

杆状病毒介导外源基因在哺乳动物细胞中表达的研究进展

杆状病毒(Baculovirus)是一种以昆虫为唯一宿主的病毒, 可用做生物杀虫剂或作为表达载体在昆虫细胞中大量表达外源蛋白, 制备疫苗。研究发现, 在哺乳动物细胞中携带哺乳动物启动子的重组杆状病毒能启动下游外源基因的表达但病毒不能在哺乳动物细胞中增值, 对细胞毒性小, 转导成功的细胞可以稳定传代并有效表达外源基因, 哺乳动物细胞比昆虫细胞对蛋白质具有更好的翻译后修饰, 表达出的蛋白结构更接近天然蛋白。因此, 杆状病毒可作为一种新型的哺乳动物细胞基因转移载体, 用于表达外源基因及作为一种基因治疗载体, 具有巨大潜力, 日益受到人们的关注。本文对杆状病毒作为一种表达载体在哺乳动物细胞中表达的研究进展进行了综述。     

不同启动子在昆虫杆状病毒表达系统中的活性分析

为了比较不同启动子在杆状病毒/昆虫细胞中的活性, 利用对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus, WSSV)的ie1启动子及其截短的mie1启动子、杆状病毒ETL启动子及其加长的mETL启动子以及杆状病毒多角体启动子PPH, 构建了含有不同启动子控制下的EGFP报告基因的重组杆状病毒, 分别感染Sf9昆虫细胞, 利用流式细胞术检测报告基因的表达水平。结果表明, WSSV的ie1启动子和杆状病毒的mETL启动子在昆虫细胞Sf9细胞中都具有较强而早的启动子活性, 能够控制报告基因早期高效表达, 而PPH在感染后期才表现较强活性。并且研究中发现, 杆状病毒同源重复区(hr1)可以增强ETL启动子的活性。     

不同启动子在昆虫杆状病毒表达系统中的活性分析

为了比较不同启动子在杆状病毒/昆虫细胞中的活性, 利用对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus, WSSV)的ie1启动子及其截短的mie1启动子、杆状病毒ETL启动子及其加长的mETL启动子以及杆状病毒多角体启动子PPH, 构建了含有不同启动子控制下的EGFP报告基因的重组杆状病毒, 分别感染Sf9昆虫细胞, 利用流式细胞术检测报告基因的表达水平。结果表明, WSSV的ie1启动子和杆状病毒的mETL启动子在昆虫细胞Sf9细胞中都具有较强而早的启动子活性, 能够控制报告基因早期高效表达, 而PPH在感染后期才表现较强活性。并且研究中发现, 杆状病毒同源重复区(hr1)可以增强ETL启动子的活性。     

携带苏云金芽胞杆菌cry1Ac10基因重组杆状病毒的构建及其杀虫活性

用Bac-to-Bac系统,构建了包含极晚期基因ph启动子驱动的带有全长苏云金芽胞杆菌cry1Ac10基因和完整多角体基因的重组质粒pFCP,用该重组质粒感染昆虫Sf9细胞,得到了带有多角体和能够表达cry1Ac10基因的重组杆状病毒vFcph,并在昆虫细胞中表达了Cry1Ac10蛋白。同时构建了含cry1Ac10的穿梭载体．pHTC,并分别转化大肠杆菌、枯草杆菌和苏云金杆菌晶体缺陷型菌株,结果表明此三种工程菌均表达了分子量为133．3kDa的原毒素蛋白,其中在苏云金芽胞杆菌中的表达量最高。生物测定表明重组杆状病毒vFcph的表达产物具有杀虫活性,能增加杆状病毒力,加快杆状病毒杀虫速度,说明利用杆状病毒极晚期基因启动子驱动苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白表达,从而改善杆状病毒的杀虫特性是可行的。     

保幼激素促进昆虫杆状病毒增殖效果及机制的研究进展

保幼激素除了对昆虫生长发育具有重要的调节作用外,还能促进昆虫杆状病毒的增殖。本文重点综述了保幼激素对昆虫杆状病毒的具体增殖效果和可能的机制。目前认为保幼激素促进病毒增殖的主要机制是延长宿主幼虫历期、提高宿主幼虫取食量和食物转化率等。最后建议今后应从DNA甲基化的角度探讨保幼激素促进病毒增殖的可能表观遗传机制。     

生物防治

962195 开发用于防治昆虫的重组杆状病毒[英]/Bonning,B.C.…//Annu.Rev.Entomol.-1996.41.-191～210[译自DBA,1996,15(7),96-03938] 随着重组DNA技术的进步及快反应重组杆状病毒的开发,人们对这些病毒在田间防治昆虫的潜力的兴趣大大增加。本编综述提供了重组杆状病毒目前状况的总体情况,包括:(1)利用遗传工程开发     

杆状病毒对不同哺乳动物细胞基因转移及表达效率的研究

研究已证实杆状病毒可进入某些哺乳动物细胞,这提示了可将重组杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的新型基因转移载体。利用已构建的重组杆状病毒BacV-CMV-EGFPA,以含病毒的Sf9细胞培养上清同时孵育多种哺乳动物细胞,利用流式细胞术检测报告基因在不同细胞株中的转移效率及表达效率。共使用了20种哺乳动物细胞株,其中有12种人类组织细胞,7种小鼠组织细胞,1种猴组织细胞。实验结果显示携带CMV启动子的重组杆状病毒可有效进入多数哺乳动物细胞,其中对人、猴来源细胞的基因转移效率显著高于对鼠源细胞,对贴壁细胞的基因转移效率显著高于对悬浮细胞。同时,通过脂质体LipofectAMINE将携带有CMV启动子和EGFP基因的哺乳动物细胞表达质粒pCDNA3-1-EGFP分别转染部分特别是被认为杆状病毒进入能力较低的细胞株,结果显示CMV启动子在这些细胞中均可有效引导EGFP基因的表达,因此认为携带了CMV启动子的重组杆状病毒对不同哺乳动物细胞基因转移效率能基本反映出杆状病毒对不同种哺乳动物细胞的进入能力。通过综合比较携带CMV启动子的杆状病毒对不同种属及组织来源细胞的基因转移及表达效率,可看出杆状病毒对灵长类动物贴壁细胞的基因转移及表达效果是较好的,而对小鼠来源的细胞及悬浮培养细胞却并不十分理想,这表明将重组杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的基因转移工具,仍有其局限性,不一定对所有的细胞都合适,在应用时应予以充分考虑。     

重组杆状病毒：一种新型哺乳动物细胞基因转移载体

昆虫杆状病毒表达载体系统已广泛应用于表达重组蛋白。近年来研究显示,含有哺乳动物细胞启动子元件的重组杆状病毒可有效地转导多种哺乳动物原代和传代细胞。借助于杆状病毒载体,已成功实现了外源基因在哺乳动物细胞内的瞬时或稳定表达;而在体内,杆状病毒可被血清中的补体成份所灭活,从而抑制了转导效率,但是通过对杆状病毒进行修饰（如伪型杆状病毒）,可以抵抗补体的灭活作用。研究人员对杆状病毒转导机制进行了探索,但是至今尚未完全弄清。杆状病毒基因转移系统最大特点是,杆状病毒能在昆虫细胞内大量繁殖,而不能在哺乳动物细胞内复制,因而具有很高的生物安全性;同时,此系统还具有操作简便、插入外源基因容量大等优点,使得杆状病毒作为哺乳动物细胞的基因传递载体,具有广泛的应用前景。     

人乳头瘤病毒16型E6基因的T—A克隆及在真核细胞中的表达

由于ＨＰＶ１６Ｅ６蛋白能诱导机体保护性免疫反应,可作为基因治疗的靶抗原。用杆状病毒昆虫细胞表达系统制备了ＨＰＶ１６Ｅ６基因工程蛋白,拟用于宫颈癌细胞系小鼠模型抗癌的免疫治疗。用ＰＣＲ技术从ＨＰＶ１６基因组中扩增获得转化基因Ｅ６的完整ＯＲＦ,按ＴＡ策略将其克隆到自行制备的杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３Ｔ尾载体中,置于杆状病毒ＡｃＭＮＰＶＰｏｌｈ晚期启动子控制之下,用此重组转移质粒ｐＶＬ１３９３Ｅ６与杆状病毒ＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ９,经噬斑筛选获得带有编码Ｅ６蛋白基因的重组杆状病毒株,并在昆虫细胞Ｓｆ９中表达为非融合性Ｅ６蛋白。ＳＤＳＰＡＧＥ电泳分析其分子量约为１８ｋＤ,免疫印迹实验表明,此重组蛋白能被兔抗ＨＰＶ１６Ｅ６抗体所识别。     

共表达甲型流感病毒M1和HA抗原的重组杆状病毒的构建

为构建同时表达流感病毒M1和HA抗原的重组杆状病毒,采用PCR扩增流感病毒A/PR/8/34株的M1基因和去除信号肽的HA基因,将两基因克隆到杆状病毒转座载体pFastBac Dual的两个启动子下游的多克隆位点,筛选出阳性重组转座载体pFastBac Dual-M1-HA。将其转化含有杆状病毒穿梭载体(Bacmid)的DH10Bac感受态细胞,通过抗生素、蓝白斑筛选和PCR鉴定获得重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-M1-HA,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-M1-HA。提取重组病毒基因组,通过PCR鉴定外源基因插入成功。间接免疫荧光和Western-blot检测表明,该重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞中成功地表达了M1和HA。应用杆状病毒/昆虫细胞系统成功共表达流感病毒M1和HA抗原,为研究流感病毒VLP的形成机制和开发新型流感疫苗奠定了基础。     

生物防治

920202连续昆虫细胞生物反应器生产杆状病毒或盆组衍生物〔会,英〕/van Lier,F.L.J.一2 Ann.N .Y.Acad.Sci一2992,613一253~100〔译自DBA,1991,10(9),91一05063」 叙述了杆状病毒的分子生物学,以及如何生产用于昆虫生防的重组杆状病毒。此为连续操作系统,其中两个相连反应器的第一个用于培养昆虫细胞,在第二个反应器中,非封闭形首蓓银纹夜蛾(A“to夕ra夕无acal‘for。￡ca.)核多角体病毒 (AoNPV)侵染昆虫细胞。细胞裂解前完成侵染周期。在剪切力最小的饱罩塔中反应,此模型用于气提式生物反应器。4周后,在上述二步反应器中,草地夜蛾(…     

昆虫杆状病毒表达载体系统与疫苗研制的30年回顾

1983年12月,一篇关于用昆虫杆状病毒感染昆虫细胞表达重组人β干扰素文章的发表,标示了杆状病毒表达载体系统(Baculovirus expression vector system,BEVS)的诞生。迄今为止,已采用BEVS表达生产了数千种重组蛋白,其中7种已被成功用于商品化人用或兽用疫苗的抗原。仅对30年来基于BEVS的疫苗研制作一论述。     

HIV-1-gp120在重组杆状病毒系统中的表达

将中国株HIV 1B亚型 gp1 2 0全基因序列克隆到杆状病毒转座载体pFastBacI中多角体启动子下游 ,构建成重组转座载体 pFastBacI gp1 2 0 ,利用细菌 /杆状病毒 (BactoBac)表达系统筛选重组杆状病毒 ,在昆虫细胞Sf9中高效表达了HIV 1的外膜糖蛋白 gp1 2 0 ,SDS -PAGE和Westernblot分析结果一致 ,证明表达了 2种糖基化程度不同的 gp1 2 0。     

16型人乳头瘤病毒衣壳蛋白在真核细胞中的表达

为了构建HPV16型晚期蛋白重组杆状病毒,并使其在昆虫细胞中获得高效表达.首先构建2株重组杆状病毒转移质粒,分别携带人乳头瘤病毒晚期基因L1及L1和L2,再用线性化的杆状病毒DNA与该重组杆状病毒转移质粒共转染sf9昆虫细胞进行同源重组,获得2株重组杆状病毒.经鉴定该重组病毒中有目的基因存在且可表达所编码的L1或L2晚期蛋白.结果表明HPV16型晚期蛋白在昆虫细胞中获得成功表达,为HPV16型预防性基因工程亚单位疫苗的研制和诊断试剂的研究开发奠定了基础.