OVA—接头—β2m融合基因的构建及体内特异性CTL的诱导

构建融合基因OVA 接头 β2m的表达载体 ,通过接头 (linker)序列使 β2微球蛋白 (β2m)与肽段共价结合 ,限制其在体内的扩散 ,以期获得更具潜力的免疫原结构。采用PCR技术 ,从人肝癌细胞株SMMC 772 1中克隆人 β2m基因 ,拼接上卵白蛋白 (OVA) (2 5 7— 2 6 4 )序列及接头后 ,克隆入 pET 4 2b( )高效表达载体进行诱导表达。对表达产物进行纯化与复性后 ,用其作为免疫原诱导特异性CTL ,并构建H 2Kb 四聚体检测特异性CTL。应用H 2Kb 四聚体对特异性CTL检测结果与经典的细胞毒试验一致 ,同时对胞外IFN γ进行了定量检测。结果表明 ,OVA 接头 β2m的表达产物可有效诱导体内特异性CTL反应 ,在体外构建MHC I类分子四聚体 ,为特异性T细胞的检测提供了有利的工具     

MHCI类分子四聚体技术的应用研究进展

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)I类分子四聚体(tetramer)技术可直接对抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)进行标记,以检测能够识别特定抗原肽-MHC I的CTL,用于临床检测、疾病诊断及相关科学研究。综述了MHC I四聚体技术应用的最新研究进展,为开展四聚体的相关研究提供新的参考。     

自身肽结合于HLA-A2分子上能够在体外诱导抗原肽特异性的同种T细胞

在同种反应性T细胞(同种T细胞)识别的配体中, 抗原肽的作用是免疫学长期争论的问题, 即同种T细胞识别是否具有抗原肽特异性. 为了证实通过长期混合淋巴细胞培养(LTMLC)方法能够诱生抗原肽/MHC复合物(pMHC)特异性的同种T细胞, 本研究利用仅表达HLA-A2, TAP缺陷的T2细胞, 将酪氨酸激酶来源的自身抗原肽(Tyr_369-377)和EB病毒来源的病毒抗原肽(LMP2A_426-434)分别加载到T2细胞上, 使T2细胞提呈单一的T细胞抗原识别表位, 并且选择4个HLA-A2阳性(HLA-A2+ve)与4个HLA-A2阴性(HLA-A2-ve)个体的PBL样本, 与加载上述抗原肽的T2细胞混合培养. 在此实验系统中, HLA-A2+ve PBL与加载病毒抗原肽的T2细胞(T2/LMP)混合培养代表T细胞对普通抗原的反应, 而HLA-A2-ve PBL与加载自身抗原肽的T2细胞(T2/Tyr)混合培养则为T细胞对同种抗原的反应. 利用特异性pMHC四聚体染色与特异性细胞毒试验检测LTMLC诱生CTL的特异性, 其中利用HIV抗原肽(Gag_77-85)作为对照. 结果显示: (ⅰ) T2/LMP与HLA-A2+ve个体的PBL混合培养产生CTL(CTL-T2/LMP), CTL-T2/LMP对T2/LMP的杀伤显著高于对照T2/HIV的杀伤(26.52%±3.72% vs 7.01%±0.87%, P<0.001); LMP四聚体对CTL-T2/LMP染色的阳性细胞数显著高于对照HIV四聚体 (0.98%±0.33% vs 0.05%±0.01%, P=0.0014); (ⅱ) 加载自身抗原肽的T2细胞(T2/Tyr)可诱导HLA-A2-ve个体的PBL产生CTL(CTL-T2/Tyr), CTL-T2/Tyr对T2/Tyr的杀伤显著高于对T2/HIV的杀伤(28.07%±2.58% vs 6.87±1.01%, P<0.001); Tyr四聚体对CTL-T2/Tyr染色的阳性细胞数显著高于HIV四聚体(0.88%±0.3% vs 0.06±0.03%, P=0.0018). 结果说明: 结合于自身MHC分子上的病毒抗原肽与结合于同种MHC分子上的自身抗原肽都能诱导产生抗原肽特异性的CTL; 在LTMLC诱生的同种CTL中, 有相当数量的CTL具有pMHC特异性, 这些同种CTL的识别机制与普通抗原反应性CTL一样, 识别的对象也是特异性的pMHC. 支持了同种抗原的pMHC种类繁多造成同种T细胞反应强度极高的假说. 利用LTMLC诱生抗原肽特异性同种T细胞方法对于T细胞过继治疗具有潜在的应用价值.     

口蹄疫重组鸡痘病毒诱导猪特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性检测

目的:评价口蹄疫重组鸡痘病毒vUTAL3CP1诱导猪产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性的能力。方法:用PCR方法亚克隆O型FMDVVP1基因C末端部分片段(第130～213AA)。将其插入真核表达载体pDisplay中,构建质粒pDisplay-mVP1。将pDisplay-mVP1转染PK15细胞,经3次G418加压筛选,并用RT-PCR和IFA鉴定,证明获得表达目的基因的PK15/pDisplay-mVP1细胞。最后,利用该细胞作为靶细胞,用LDH法检测口蹄疫重组鸡痘病毒vUTAL3CP1免疫猪的特异性CTL杀伤活性。结果:vUTAL3CP1免疫组在效靶比25∶1和50∶1时,CTL裂解活性分别达到42.84%±32.1%和61.94%±42.8%,显著高于灭活疫苗组与其它对照组(p<0.01)。结论:vUTAL3CP1可以诱导猪产生高水平的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性,为进一步的FMDV基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

加载HCMV抗原肽的HLA-A*0201单体及其四聚体制备和鉴定

细胞毒T淋巴细胞(CTL)在控制病原体感染以及抗肿瘤过程中发挥重要作用,因而特异性CTL的检测相当重要;而过去检测CTL的方法都是间接的,最近发展起来的四聚体技术则是直接检测抗原特异性CTL的有效而特异的方法,成为目前研究T细胞免疫应答的关键技术。报道一种简化的四聚体制备程序,利用该程序成功制备加载人巨细胞病毒(HCMV)抗原肽的HLA-A2四聚体,具有特异性结合CTL活性。HLA-A*0201重链基因是通过RT-PCR方法从HLA-A2⁺供者白细胞中克隆,进而以PCR方法构建在羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A*0201(A2)重链胞外区原核表达载体, A2重组蛋白在大肠杆菌中得到高表达,主要以包涵体形式存在。加载抗原肽的可溶性A2单体是A2胞外区在轻链β2微球蛋白和HLA-A2限制性HCMV pp65_495-503抗原肽(NLVPMVATV,NLV)存在时通过稀释法复性获得,以BirA对其进行生物素化,然后以阴离子交换树脂纯化,得到的纯化A2-NLV单体与Streptavidin_PE按4:08比例混合形成四聚体,结合程度在85％以上,流式细胞仪分析显示该四聚体具有与HLA-A2+供者的特异性CTL结合活性。总之,这种简化的四聚体制备程序,不仅有利于该技术的推广,为特异性T细胞免疫研究建立必要的技术平台,而且A2-NLV四聚体在临床监测CMV特异性CTL水平等方面也有应用价值。     

Epstein-Barr病毒特异性T细胞对重组痘苗病毒表达LMP和EBNA2的靶细胞的识别

本文用EB病毒转化自体淋巴细胞所建立的类淋巴母细胞系(LCL),以及用EB病毒潜伏感染膜蛋白(LMP)基因和核蛋白-2(EBNA2)基因与痘苗病毒重组的重组病毒(Vac-LMP和Vac-EBNA2)感染的自身纤维母细胞,同时作为刺激细胞和靶细胞,以~(51)Cr释放法检测5例血清中EB病毒VCA—IgA抗体阳性者及1例阴性健康者外周血单个核细胞(PBMC)的特异性T细胞杀伤效应。结果表明,用自身LCL激活的EB病毒特异性T细胞杀伤效应高峰出现在第14～28天;参与杀伤性细胞免疫反应的T细胞亚群主要是T3、T8阳性的细胞毒性T细胞,其对靶细胞的识别及杀伤受HLA-I的限制。用重组牛痘病毒感染的纤维母细胞作靶细胞或刺激细胞,有1例供者可接受LMP,另1例可接受EBNA2的刺激,并对相应的靶细胞产生特异性T细胞杀伤反应,表明EB病毒-LMP和EBNA2可能既是EB病毒特异性T细胞的刺激抗原,又是其识别的靶抗原。     

烟曲霉抗原Asp f16HLA-A*0201限制性的CD8+CTL抗原表位生物信息学预测与实验室鉴定

目的 预测与鉴定烟曲霉抗原Asp f16的HLA-A *0201限制性CD8+细胞毒性T细胞(CTL)抗原表位.方法 以国人常见的HLA-A*0201位点为靶点,依据生物信息学软件扫描烟曲霉特异性抗原Asp f16的全部427个氨基酸序列.使用HLA-A *0201转基因小鼠制备骨髓来源的树突状细胞(DC)和CTL.流式细胞仪技术检测DC表面MHC Ⅱ类抗原,CD80,CD86和CD11c的表达来验证其是否成熟.ELISPOT试验检测烟曲霉抗原多肽特异性CTL产生的细胞因子IFN-γ.四聚体(Tetramer)试验证实烟曲霉特异性CTL与抗原肽,HLA-A*0201分子复合体的亲和性.结果 根据与MHC I类分子结合的半衰期评分,选择了3个HLA-A*0201限制性抗原表位.流式细胞仪分析示成熟DC高表达HLA Ⅱ类抗原,CD80,CD86和CD11c.Tetramer试验证实烟曲霉特异性T细胞受体与抗原肽,HLA-A*0201分子复合体的高亲和性.ELISPOT实验结果 表明烟曲霉抗原肽体外可以活化CD8+CTL,被负载了抗原肽的DC刺激活化后可以产生IFN-γ.结论 本研究成功鉴定烟曲霉抗原Asp f16的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位,可作为疫苗设计的候选表位,为进一步研发新型抗烟曲霉疫苗提供参考.     

IL-2与猪细小病毒VP2基因双表达载体的构建及免疫原性的研究

将白细胞介素-2基因和猪细小病毒VP2基因主要抗原区克隆至pCI-neo真核表达载体中,构建了pCIneo-IL2-VP2重组质粒,用脂质体将其转染到PK-15细胞中,利用免疫荧光方法检测在体外表达情况。并以小鼠为动物模型,将pCIneo-IL2-VP2重组质粒、对照组pCI-neo和猪细小病毒活疫苗通过肌肉注射进行免疫,检测免疫小鼠的淋巴细胞转化功能,特异性CTL杀伤活性和血清抗体滴度。结果显示,pCIneo-IL2-VP2在体外能够诱导PK-15细胞表达VP2蛋白,小鼠注射pCIneo-IL2-VP2质粒1周后能够诱导机体产生抗体,4周时达到峰值,与活疫苗对照组产生的抗体滴度、诱导T淋巴细胞增殖和诱导强的细胞毒性基本一致。试验表明,构建的pCIneo-IL2-VP2能够有效诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。     

表达重组猪瘟病毒E290多肽的干酪乳杆菌口服免疫特性及诱导特异性CTL反应的研究

经PCR扩增获得约60bp编码猪瘟病毒T细胞表位E290多肽基因片段,克隆至表达载体pPG-VP2中VP2基因5′端上游,命名为pPG-VP2-E290,电转化干酪乳杆菌,构建了表达猪瘟病毒E290多肽的重组乳酸菌系统。口服免疫BALB/c鼠和新西兰兔,检测诱导小鼠和兔体内产生特异性抗猪瘟病毒E290多肽IgG水平,并对E290多肽的CTL活性进行检测,同时对免疫兔进行猪瘟病毒攻毒实验,检测E290多肽抗体对免疫兔的保护作用。构建的重组猪瘟病毒T细胞表位的干酪乳杆菌具有良好的免疫性,口服免疫后的小鼠和兔血清中均检测到了较高水平的抗E290多肽抗体IgG,且能诱导小鼠机体产生抗猪瘟病毒的特异性CTL反应,亦证实猪瘟病毒E290免疫兔能够抵抗猪瘟病毒的攻击。     

猪细小病毒核酸疫苗的构建及其对小鼠免疫原性的研究

将猪细小病毒VP2基因克隆至pCI-neo真核表达载体中,构建了pCIneo-VP2重组质粒,转染至PK-15细胞中,利用免疫荧光方法检测在体外表达情况;并以小鼠为动物模型,将pCIneo-VP2、pCI-neo重组质粒、猪细小病毒活疫苗和对照组通过肌肉注射进行免疫,检测免疫小鼠的淋巴细胞转化功能,特异性CTL杀伤活性和血清抗体滴度。结果显示,pCIneo-VP2在体外能够诱导PK-15细胞表达VP2蛋白,小鼠注射pCIneo-VP2质粒 1周后能够诱导机体产生抗体,4周时达到峰值,与活疫苗对照组产生的抗体滴度、诱导T淋巴细胞增殖和诱导强的细胞毒性基本一致。试验表明,构建的pCIneo-VP2能够有效诱导机体产生体液免疫和细胞免疫,为研制出高效、新型猪细小病毒疫苗提供了科学依据和试验依据。     

A Unique Protease Cleavage Site Predicted in the Spike Protein of the Novel Pneumonia Coronavirus (2019-nCoV) Potentially Related to Viral Transmissibility

正Dear Editor,In December 2019, a novel human coronavirus caused an epidemic of severe pneumonia(Coronavirus Disease 2019,COVID-19) in Wuhan, Hubei, China(Wu et al. 2020; Zhu et al. 2020). So far, this virus has spread to all areas of China and even to other countries. The epidemic has caused 67,102 confirmed infections with 1526 fatal cases     

Curcuminoids as inhibitors of thioredoxin reductase: A receptor based pharmacophore study with distance mapping of the active site

Curcumin is the yellow pigment of turmeric that interacts irreversibly forming an adduct with thioredoxin reductase (TrxR), an enzyme responsible for redox control of cell and defence against oxidative stress. Docking at both the active sites of TrxR was performed to compare the potency of three naturally occurring curcuminoids, namely curcumin, demethoxy curcumin and bis-demethoxy curcumin. Results show that active sites of TrxR occur at the junction of E and F chains. Volume and area of both cavities is predicted. It has been concluded by distance mapping of the most active conformations that Se atom of catalytic residue SeCYS498, is at a distance of 3.56 from C13 of demethoxy curcumin at the E chain active site, whereas C13 carbon atom forms adduct with Se atom of SeCys 498. We report that at least one methoxy group in curcuminoids is necessary for interation with catalytic residues of thioredoxin. Pharmacophore of both active sites of the TrxR receptor for curcumin and demethoxy curcumin molecules has been drawn and proposed for design and synthesis of most probable potent antiproliferative synthetic drugs.     

The structure, reproduction and taxonomy of Vidalia and Osmundaria (Rhodophyta, Rhodomelaceae)

Comprises species occurring mostly in subtidal habitats in tropical, subtropical and warm-temperate areas of the world. An analysis of the type species, V. spiralis (Sonder) Lamouroux ex J. Agardh, a species from Australia, establishes basic characters for distinguishing species in the genus. These characters are (1) branching patterns of thalli, (2) flat blades that may be spiralled on their axis, (3) width of the blade, (4) primary or secondary derivation of sterile and fertile branchlets and (5) position of sterile and fertile branchlets on the thalli. Application of the latter two characters provides an important basic method for separation of species into three major groups. Osmundaria , a genus known only in southern Australia, was studied in relation to Vidalia , and its separation from the Vidalia assemblage is not accepted. Species of Vidalia therefore are transferred to the older genus name, Osmundaria. Two new species, Osmundaria papenfussii and Osmundaria oliveae are described from Natal. Confusion in the usage of the epithet, Vidalia fimbriala Brown ex Turner has been clarified, and Vidalia gregaria Falkenberg, described as an epiphyte on Osmundaria pro/ifera Lamouroux, is revealed to be young branches of the host, Osmundaria prolifera.     

New or rare chromosome counts in Artemisia L. (Asteraceae, Anthemideae) and related genera from Kazakhstan

Fifteen chromosome counts of six Artemisia taxa and one species of each of the genera Brachanthemum, Hippolytia, Kaschgaria, Lepidolopsis and Turaniphytum are reported from Kazakhstan. Three of them are new reports, two are not consistent with previous counts and the remainder are confirmations of very scarce (one to four) earlier records. All the populations studied have the same basic chromosome number, x = 9, with ploidy levels ranging from 2x to 6x. Some correlations between ploidy level, morphological characters and distribution are noted.     

Comparative morphology of the carpel in the Liliaceae: Hewardieae, Petrosavieae, and Tricyrteae

The young pistils in the melanthioid tribes, Hewardieae, Petrosavieae and Tricyrteae, are uniformly tricarpellate and syncarpous. They lack raphide idioblasts. All are multiovulate, with bitegmic ovules. The Petrosavieae are marked by the presence of septal glands and incomplete syncarpy. Tepals and stamens adhere to the ovary in the Hewardieae and the Petrosavieae but not in the Tricyrteae. Two vascular bundles occur in the stamens of the Hewartlieae and Tricyrtis latifolia. Ventral bundles in the upper part of the ovary of the Hewardieae are continuous with compound septal bundles and placental bundles in the lower part. Putative ventral bundles occur in the alternate position in the Tricyrteae and putative placental bundles in the opposite. position in the Petrosavieae. The dichtomously branched stigma in each carpel of the Tricyrteae is supplied by a bifurcated dorsal bundle.     

肝癌中HBV和HCV基因和抗原的分布及意义

采用原位分子杂交方法检测HCV RNA及HBV X基因;采用免疫组织化学方法研究HCV核心抗原,非结构区C33c抗原及HBxAg在肝细胞肝癌中的定位及分布.结果表明(1)HCV RNA、HBV X基因在肝细胞肝癌组织检出率分别为40%(55/136)和82%(112/136).HCV RNA定位于癌细胞的胞浆内,阳性细胞呈散在、灶状及弥漫分布三种形式;HBV X基因在肝癌细胞中的分布呈胞浆型、核型及核浆型,阳性细胞也呈上述三种分布形式;(2)HCV C33c抗原、核心抗原在肝细胞肝癌中的阳性率为81%(133/164)及86%(141/164).C33c抗原定位于癌细胞及肝细胞的胞浆内;核心抗原既定位于癌细胞核中,又可定位于胞浆中.C33c抗原阳性细胞以灶状分布为主;而核心抗原阳性细