重组牛痘病毒介导的微小基因表达产物OVA257—264在真核细胞中的抗原呈递效率

应用含重组OVA微小基因及全长基因的牛痘病毒感染能够稳定表达Kb 分子的多种真核细胞 ,通过构象特异的单克隆抗体 2 5 .D 1.16 (anti OVA2 57～ 2 64/Kb)检测细胞表面复合物的形成情况 ,并借助四聚体技术检测了它们对抗原特异性T细胞的诱导能力。结果表明四聚体的构建是成功的 ,进一步用已被重组牛痘病毒感染的L92 9 Kb 细胞作为抗原呈递细胞以诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)的产生 ,并对活化后特异性CTL进行检测 ,从胞外IFN γ的分泌情况看 ,诱导后的整个群体细胞发生了活化与增殖 ,H 2Kb OVA四聚体对特异性T细胞进行的结合分析与经典的细胞毒效应相一致。可见 ,重组牛痘病毒介导的微小基因产物OVA2 57～ 2 64不仅能为MHC I类分子的合成提供更有效的肽来源 ,且能更有效诱导特异性CTL的产生。     

加载HCMV抗原肽的HLA-A*0201单体及其四聚体制备和鉴定

细胞毒T淋巴细胞(CTL)在控制病原体感染以及抗肿瘤过程中发挥重要作用,因而特异性CTL的检测相当重要;而过去检测CTL的方法都是间接的,最近发展起来的四聚体技术则是直接检测抗原特异性CTL的有效而特异的方法,成为目前研究T细胞免疫应答的关键技术。报道一种简化的四聚体制备程序,利用该程序成功制备加载人巨细胞病毒(HCMV)抗原肽的HLA-A2四聚体,具有特异性结合CTL活性。HLA-A*0201重链基因是通过RT-PCR方法从HLA-A2⁺供者白细胞中克隆,进而以PCR方法构建在羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A*0201(A2)重链胞外区原核表达载体, A2重组蛋白在大肠杆菌中得到高表达,主要以包涵体形式存在。加载抗原肽的可溶性A2单体是A2胞外区在轻链β2微球蛋白和HLA-A2限制性HCMV pp65_495-503抗原肽(NLVPMVATV,NLV)存在时通过稀释法复性获得,以BirA对其进行生物素化,然后以阴离子交换树脂纯化,得到的纯化A2-NLV单体与Streptavidin_PE按4:08比例混合形成四聚体,结合程度在85％以上,流式细胞仪分析显示该四聚体具有与HLA-A2+供者的特异性CTL结合活性。总之,这种简化的四聚体制备程序,不仅有利于该技术的推广,为特异性T细胞免疫研究建立必要的技术平台,而且A2-NLV四聚体在临床监测CMV特异性CTL水平等方面也有应用价值。     

HLA-A*2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定

HLA-A*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒(HCMV)特异性细胞毒T细胞(CTL)免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A*2402重链胞外域融合蛋白(HLA-A*2402-BSP)的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(E.coli)中有效表达HLA-A*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端(N端)区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A*2402-BSP表达载体,融合蛋白在E.coli中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A*2402限制性HCMVpp65341-349抗原肽(QYDPVAALF,QYD)的可溶性HLA-A*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24 供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8 T细胞的0·09%～0·37%。这些结果为进一步研究HLA-A*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。     

IL—18DNA免疫对HIV—1核酸疫苗诱导的免疫应答的影响

为了研究白细胞介素-18(IL-18)基因对人免疫缺陷病毒(HIV-1)核酸疫苗诱导免疫应答的影响,将人IL-18基因插入到真核表达载体pVAX1中,构建了真核表达载体pVAX1-IL-18;将pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18或者pCI-neoGAG单独免疫Balb/c小鼠,检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN-γ,同时观察免疫小鼠脾淋巴细胞增殖和小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。酶切及测序结果表明成功地构建了人IL-18基因真核表达载体;与pCI-neoGAG免疫组比较,pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18免疫组小鼠血清的抗HIV-1p24抗体滴度降低(P<0.01);而与pCI-neoGAG免疫组比较,pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18免疫组小鼠血清的IFN-γ升高(P<0.01);pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖实验刺激指数(SI)以及特异性CTL活性均高于pCI-neoGAG免疫组(P<0.01)。IL-18基因联合HIV-1核酸疫苗免疫小鼠,可能增强特异性Th1细胞和CTL反应,白细胞介素-18基因对体液免疫有抑制作用。     

日本脑炎病毒E基因与流感病毒HA基因的串联表达及应用

根据GenBank公布的日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus, JEV) SA14 14 2株的核酸序列和人流感病毒的血凝素基因(ha)序列, 设计一对特异性引物, 用 PCR方法扩增编码 JEV囊膜蛋白主要抗原域基因, 其中含ha基因主要核苷酸序列。将PCR产物定向克隆入原核表达载体 pET 32a( ), 构建原核表达载体 pET EHA。阳性质粒转化BL21(DE3)宿主菌, 经 IPTG诱导获得表达, 重组蛋白以包涵体的形式存在。Western blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。利用纯化的表达产物与流感病毒血凝素单抗及乳胶建立了诊断日本脑炎病毒抗体水平的乳胶凝集试验。结果表明乳胶凝集方法具有简便快速、敏感性高、特异性强、价格低廉、可现场检测等优点, 是一种适合基层兽医单位用于日本脑炎病毒抗体水平检测的新方法。     

日本脑炎病毒E基因与流感病毒HA基因的串联表达及应用

根据GenBank公布的日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)SA14-14-2株的核酸序列和人流感病毒的血凝素基因(ha)序列,设计一对特异性引物,用PCR方法扩增编码JEV囊膜蛋白主要抗原域基因,其中含ha基因主要核苷酸序列.将PCR产物定向克隆入原核表达载体pET-32a(+),构建原核表达载体pET-EHA.阳性质粒转化BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导获得表达,重组蛋白以包涵体的形式存在.Western-blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性.利用纯化的表达产物与流感病毒血凝素单抗及乳胶建立了诊断日本脑炎病毒抗体水平的乳胶凝集试验.结果表明乳胶凝集方法具有简便快速、敏感性高、特异性强、价格低廉、可现场检测等优点,是一种适合基层兽医单位用于日本脑炎病毒抗体水平检测的新方法.     

HIV-1 B亚型gag基因密码子优化及其免疫原性的研究

从河南HIV-1流行区感染者中克隆HIV-1 B亚型gag基因,通过序列比对获得其一致性共有序列,对该共有序列按照哺乳动物优势密码子的使用原则进行优化,以Western blot方法比较优化前后gag基因体外表达量.发现对gag基因进行密码子优化可显著提高其表达水平.将优化后的mod.gag基因插入重组腺病毒载体,构建了重组病毒rAdV-mod.gag.在BALB/c小鼠体内分别以108PFIJ及108PFU rAdV-mod.gag疫苗单独免疫两次均可产生较高水平的gag特异性细胞免疫反应.由此得出结论,对gag基因的密码子优化是成功的;表达优化后gag基因的重组腺病毒疫苗,可以在小鼠体内诱导较强的gag基因特异性CTL应答.     

FXR1真核表达载体的构建与表达及其对神经节苷脂浓度的影响

目的:构建脆性X相关基因1(FXR1)的真核表达载体并检测其对神经节苷脂(GM1)浓度的影响。方法:以pYESTrp3-FXR1为模板,利用PCR扩增FXR1基因,PCR产物经EcoR I和Xho I双酶切后插入真核表达载体pcDNA3.1(-)中,获得的阳性克隆进一步酶切及测序鉴定;将构建成功的pcDNA3.1(-)-FXR1转染SH-SY5Y细胞后,采用Western blot检测FXR1的表达情况,同时采用ELISA试剂盒检测细胞内GM1的浓度。结果:PCR扩增产物为1.9 Kb的片段,与FXR1基因大小相符,阳性克隆经双酶切后获得两条分别为5.4 Kb和1.9 Kb的片段,测序结果与GeneBank中序列相同。构建成功的重组质粒pcDNA3.1(-)-FXR1转染SH-SY5Y细胞后,细胞中FXR1的表达增加,同时有效提高了细胞内GM1的浓度(P0.05)。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-FXR1,FXR1的表达增加可以提高SH-SY5Y细胞中的GM1浓度,这些为后续深入研究FXR1基因在神经组织发育中的调控功能及其在脆性X综合征(FXS)中的作用机制奠定了基础。     

1型和2型外壳蛋白构建的AAV载体携带HIV-1 gag诱导免疫反应的比较研究

比较两种血清型的腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体携带HIV-1gag基因肌肉注射诱导小鼠免疫反应的特点。分别制备携带EGFP和HIV-1gag基因的重组AAV2/1(AAV1)和AAV2载体。小鼠肌肉注射rAAV1-EGFP和rAAV2-EGFP,观察注射局部EGFP的表达。将rAAV1-gag和rAAV2-gag分别以0、3周初免/加强方式肌肉注射免疫BALB/c小鼠以及新西兰白兔。ELISA法检测抗HIV-1 Gag P24蛋白的特异性抗体,细胞内细胞因子染色法检测Gag特异性的CTL反应。结果表明,rAAV1-EGFP在小鼠肌肉的表达强度显著高于rAAV2-EGFP;用Western blot法和间接免疫荧光法检测rAAV1-gag和rAAV2-gag体外转染的293细胞,均可检测到HIV-1 Gag蛋白的表达;在小鼠体内rAAV1-gag和rAAV2-gag组均可检测到特异性P24抗体,抗体滴度rAAV1-gag组显著高于rAAV2-gag组;而无论rAAV1-gag组还是rAAV2-gag组,特异性CTL反应均较低,与阴性对照组相比均无显著性差异;两种载体免疫兔子也都可检测到特异性P24抗体,同样地,rAAV1-gag组显著高于rAAV2-gag组。结论:携带HIV-1gag基因的rAAV1或rAAV2以肌肉注射方式免疫小鼠主要诱导特异Gag的体液免疫反应;且rAAV1可诱导很强的抗HIV-1 Gag特异性抗体,抗体水平显著高于rAAV2。     

丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：建立稳定表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的原核表达系统,获得高产量的纯化核心蛋白。方法：应用多聚酶链反应(PCR),以HCV—H株全长cDNA序列为模板,扩增获得核心区基因片段,克隆入原核表达载体pBVIL1,构建原核表达载体pBVIL1-C,转化HB101宿主菌,通过温度诱导表达核心蛋白。结果：扩增得到目的基因长度为573bp,构建pBVIL1-C表达载体,在HB101宿主菌中通过温度诱导获得稳定表达,表达蛋白占菌体总蛋白含量的21％,Western—Blot检测证实表达产物可与HCV患者阳性血清发生特异性结合反应。结论：HCV核心蛋白可在大肠杆菌中获得高表达并具有良好的反应原性。     

Tetramer技术检测人乳头瘤病毒抗原特异性T细胞条件的优化

人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是宫颈癌发生的首要因素。针对病毒早期蛋白E6的特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL)在清除HPV感染细胞和病毒转化形成的肿瘤细胞过程中发挥重要作用,因此检测体内抗原特异性CTL的频数和功能有助于了解病毒感染者或宫颈癌患者体内的特异性细胞免疫反应。利用加载HPV16 E6表位抗原肽(E6 133-142;HNIRGRWTGR)的HLA-A6801四聚体(Tetramer),即HPV16 E6 133-142/HLA-A6801-PE四聚体,通过检测混有HPV特异性CTL的PBMC标本,优化Tetramer染色的实验条件,探讨染色的最佳温度及Tetramer浓度。结果显示,染色温度(4℃、室温及37℃)对Tetramer与CTL的结合无明显影响。Tetramer稀释度为1∶1 600时,HPV特异性CTL荧光强度保持高水平,且非特异性染色少,为最佳染色浓度。研究结果为进一步检测HPV感染者或宫颈癌患者体内抗原特异性的CTL打下基础。     

H9N2亚型AIVHA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank公开发表的禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus,AIV)H9N2亚型血凝素基因(HA)序列设计引物,用PCR方法从重组质粒pUCHA中扩增H9N2亚型禽流感病毒去除信号肽的血凝素基因,将该片段定向插入到原核表达载体pET32a(+)中,构建原核表达载体pETHA。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导,HA基因获得表达,经定位分析,目的蛋白以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变IPTG的浓度和诱导时间,确定了表达HA基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.7mmol/L,诱导时间为3h。Westernblot分析表明,重组蛋白能与H9N2亚型AIV阳性血清发生特异性反应。以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测H9亚型AIV抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被浓度为25μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:OD待检血清>0.5且OD标准阳性血清>1.0;OD标准阴性血清<0.1。     

SelS高表达保护人脐静脉内皮细胞免于H2O2诱导的细胞损伤

采用以下方法探讨SelS在内皮细胞中的表达和作用:将SelS基因克隆到真核表达载体pLNCX2,RT-PCR、XhoⅠ/ClaⅠ双酶切以及DNA序列分析验证目的基因;利用脂质体转染技术将pLNCX2-SelS或pLNCX2转染至人脐静脉内皮细胞(ECV304细胞),RT-PCR检测重组基因SelS的表达;MTT方法检测转染后过氧化氢(H2O2)对内皮细胞增殖能力的影响;硫代巴比妥酸法测定暴露于H2O2中不同转染组细胞脂质过氧化产物丙二醛含量.结果表明:成功构建真核表达载体pLNCX2-SelS;转染后重组SelS mRNA表达水平是内源性水平的1.76倍;H2O2对ECV304细胞损伤后,高表达SelS组细胞活性增强、H2O2诱导产生的丙二醛减少.上述结果表明,高表达SelS可保护内皮细胞免于H2O2诱导的细胞损伤,其作用机制与抗氧化有关.     

中国旱獭β2m基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

目的克隆、原核表达中国旱獭β2m基因,并制备多克隆抗体。方法利用RT—PCR技术从中国旱獭脾细胞中扩增β2m基因,克隆至pET28a（＋）质粒,构建原核表达载体pET-28a（＋）-CWβ2m,再转化宿主菌Rosetta（DE3）pLacI诱导其表达。使用切胶回收纯化目的蛋白,将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附实验检测抗体的灵敏度和特异性。结果克隆出的中国旱獭β2m基因,与GenBank已公布的土拨鼠的碱基序列一致;Western印迹结果显示克隆的β2m基因能在大肠埃希菌中高效表达,免疫家兔获得了高效价的多克隆抗体。结论成功克隆了中国旱獭β2m基因,在原核宿主中进行了高效表达,获得的多克隆抗体具有较高的效价。为人工制备MHC-Ⅰ类分子复合物,深入研究嗜肝病毒感染过程中特异性CTL应答和效应机制奠定了基础。     

Hepcidin的基因克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

根据已知hepcidin氨基酸序列,参照毕赤氏巴斯德酵母(Pichia pastoris)密码子偏好性,设计合成了hepcidin目的基因。所合成的hepcidin基因全长96bp,其5′端引入KEX2基因产物(Kex2)的特异性识别位点序列,以保证表达产物具有天然N端。通过基因重组的方法将hepcidin基因克隆到pPicZαA载体中,构建了分泌型重组酵母表达载体pPICZαA-Hepc,经电转至毕赤酵母GS115中表达。使用浓度高达1500μg/mL的Zeocin筛选得到高拷贝插入GS115菌株,经摇瓶发酵和甲醇诱导,上清液有明显的hepcidin表达,表达量达到100mg/L。初步抗菌特性研究表明,该表达产物对枯草芽孢杆菌有明显的抑菌作用,而对大肠杆菌抑菌效果不明显。     

乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达

以α-aga基因为食品级选择标记构建了乳酸乳球菌食品级高效诱导细胞内和细胞壁锚定表达系统,并用这一表达系统表达了铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因OprF/H。首先以pRAF800和pNZ8048构建了含有α-aga、PnisA-MCS-TpepN和θ复制子的乳酸乳球菌食品级细胞内诱导表达载体pRNA48,再以pRNA48和pVE5524为出发载体构建了含有α-aga、PnisA-SPUsp45-nucA-CWAM6-t1t2和θ复制子的乳酸乳球菌细胞壁锚定诱导表达载体pRNV48。然后以食品级载体pRNA48和pRNV48为基础,构建了不含抗生素抗性选择标记的铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因的表达质粒pRNA48-OprF/H和pRNV48-OprF/H。利用nisin进行重组乳酸乳球菌菌株的诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,检测到表达蛋白分别占细胞内可溶蛋白的9.6%和细胞壁锚定蛋白的9.8%,表达产物具有免疫原性,可与含OprF/H的乳球菌以及铜绿假单胞菌发生特异性的凝集反应。     

表达重组猪瘟病毒E290多肽的干酪乳杆菌口服免疫特性及诱导特异性CTL反应的研究

经PCR扩增获得约60bp编码猪瘟病毒T细胞表位E290多肽基因片段,克隆至表达载体pPG-VP2中VP2基因5′端上游,命名为pPG-VP2-E290,电转化干酪乳杆菌,构建了表达猪瘟病毒E290多肽的重组乳酸菌系统。口服免疫BALB/c鼠和新西兰兔,检测诱导小鼠和兔体内产生特异性抗猪瘟病毒E290多肽IgG水平,并对E290多肽的CTL活性进行检测,同时对免疫兔进行猪瘟病毒攻毒实验,检测E290多肽抗体对免疫兔的保护作用。构建的重组猪瘟病毒T细胞表位的干酪乳杆菌具有良好的免疫性,口服免疫后的小鼠和兔血清中均检测到了较高水平的抗E290多肽抗体IgG,且能诱导小鼠机体产生抗猪瘟病毒的特异性CTL反应,亦证实猪瘟病毒E290免疫兔能够抵抗猪瘟病毒的攻击。     

人源抗TNF—α抗体Fab基因的单链化及其表达和纯化

构建人源抗TNF－α单链抗体基因,并尝试其在E.coli中的表达和纯化,采用人工接头,按VH－linkerVL的结构将人源抗TNF－a的VH,VL基因拼接成单链抗体（ScFv)基因,并将构建好的ScFv基因插入表达载体pQE30,转染E.coli M15,以IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂纯化表达产物,构建的ScFv基因长723bp, 列分析表明,该序列拼接正确,SDS－PAGE显示,用重组的pQE30转化的M15菌经诱导后,有相对分子质量（M）约为52000的外源蛋白表达,Ni-NTA树脂纯化的表达产物纯度大于90％,因此,成功地构建了人源抗TNFa的ScFv基因,并在E.coli DH5a中表达和纯化的该基因的产物。     

IL-18 DNA免疫对HIV-1核酸疫苗诱导的免疫应答的影响

为了研究白细胞介素-18(IL-18)基因对人免疫缺陷病毒(HIV-1)核酸疫苗诱导免疫应答的影响,将人IL-18基因插入到真核表达载体pVAX1中,构建了真核表达载体pVAX1-IL-18;将pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18或者pCI-neoGAG单独免疫Balb/c小鼠,检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN-γ,同时观察免疫小鼠脾淋巴细胞增殖和小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应.酶切及测序结果表明成功地构建了人IL-18基因真核表达载体;与pCI-neoGAG免疫组比较,pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18免疫组小鼠血清的抗HIV-1p24抗体滴度降低(P<0.01);而与pCI-neoGAG免疫组比较,pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18免疫组小鼠血清的IFN-γ升高(P<0.01);pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖实验刺激指数(SI)以及特异性CTL活性均高于pCI-neoGAG免疫组(P<0.01).IL-18基因联合HIV-1核酸疫苗免疫小鼠,可能增强特异性Th1细胞和CTL反应,白细胞介素-18基因对体液免疫有抑制作用.     

重组原核表达载体pQE30-HPV58L1的构建及鉴定

目的：构建重组原核表达载体以获得HPV58L1活性蛋白,为进一步研制HPV58基因工程疫苗打下基础。方法：用聚合酶链反应（PCR）扩增HPV58L1完整编码区基因,将PCR扩增产物克隆至pUC19质粒中并测序。利用pQE30质粒载体构建重组原核表达载体pQE30-HPV58L1,并通过酶切电泳验证重组结果的正确性。结果：PCR扩增出1.6Kb特异性片段,经克隆至pUC19后测序表明序列同源性与Gen-Bank报道一致。重组质粒pQE30-HPV58L1酶切后显示其大小约5.1Kb,酶切图谱与预期相同。结论：成功构建了重组原核表达载体pQE30-HPV58L1。