应用酵母双杂交系统筛选BRD7相互作用的蛋白质

BRD7基因是鼻咽癌组织表达下调/缺失的基因, 有强烈的鼻咽癌细胞系HNE1生长抑制作用. 利用酵母双杂交系统筛选与BRD7蛋白相互作用的蛋白, 首先将BRD7基因的完整阅读框架部分亚克隆至pAS2载体(BRD7-BD), 然后以BRD7-BD为靶蛋白, 筛选人胎脑cDNA文库, 在4.8×10⁶个转化子中筛选到11个阳性克隆, 序列测定表明, 分离到溴区包含蛋白3, 溴区包含蛋白2, β-IκB激酶, KIAA1375蛋白, 白介素7和接头相关蛋白复合物3 δ-1亚单位等与BRD7相互作用蛋白, 说明BRD7可能与BRD3或BRD2蛋白形成异源二聚体或三聚体发挥核内转录调节功能.     

酵母PAP1与PHO85激酶复合物对YLR190w的磷酸化

酵母基因Pho85编码一个依赖于细胞周期蛋白 (cyclin)的蛋白激酶 (CDK) ,参与多种调控途径。PHO85功能的多效性归于其相关的细胞周期因子 ,现已经鉴定了 10个与PHO85相关的细胞周期因子 (PCL)。为了筛选PAP1 PHO85激酶复合物的特异底物 ,以PAP1为靶分子 ,利用酵母双杂交 (two hybrid)系统从酵母cDNA文库中克隆到一个与PAP1相互作用的蛋白质因子的基因 ,Ylr190w。Ylr190w编码 491个氨基酸的多肽链。体外翻译的YLR190w与纯化的融合蛋白GST PAP1可以被谷胱甘肽亲和柱共同吸附 ,这表明PAP1与YLR190w在体外也可以结合。用免疫沉淀获得的PAP1 PHO85复合物可以磷酸化在大肠杆菌中表达GST YLR190w ;并受到无机磷浓度影响 :高磷条件时磷酸化程度高 ,低磷条件时磷酸化程度低。它能与酵母细胞内YAF9结合 ,YAF9是人具有转录调控活性蛋白质因子AF9的酵母同源物。YLR190w与YAF9的相互作用受到磷条件影响 ,突变YLR190w蛋白S/TP位点的S和T后 ,它们的相互作用明显减弱 ,且不再受到磷条件影响     

酵母双杂交技术及其在蛋白质组研究中的应用

蛋白质组学是后基因组时代出现的一个新兴的研究领域,它的主要任务是识别鉴定细胞,组织或机体的全部蛋白质,并分析蛋白质的功能及其模式。因此,揭示蛋白质组中蛋白质间的相互作用关系也是蛋白质组学的重要内容之一。酵母双杂交技术是用来检测蛋白质间是否相互作用的一个非常有效的手段,该技术在酵母蛋白质组研究中的初步成功应用,表明它有望在人类蛋白质且研究中发挥重要作用。     

酵母PH02蛋白的磷酸化研究

本文报道ＰＨＯ２蛋白能被一种未知的蛋白激酶磷酸化ＰＨＯ２蛋白的第２３０－２３３位氨基酸残基组成一个可能被ｐ３４相关的蛋白激酶识别的一致序列（ＳＰＩＫ）,用点突变的方法将Ｓｅｒ－２３０变成Ａｌａ可导致ＰＨＯ２蛋白激活ＰＨＯ５表达能力的完全丧失。进一步的研究显示,将Ｐｒｏ－２３１突变成Ｓｅｒ同样可导致ＰＨＯ２的矢活,而Ｓｅｒ－２３０突变成Ａｓｐ则不影响ＰＨＯ２的活力。由于ＰＨＯ２（Ａｓｐ－２３０）突变体通过在第２３０位残基引入了一个负电荷,可以看成Ｓｅｒ－２３０被磷酸化的状态,由此推测ＰＨＯ２蛋白可能需要在Ｓｅｒ－２３０被磷酸化后才会具有激活ＰＨＯ５基因转录的能力。体外磷酸化分析的结果表明,大肠杆菌表达的ＧＳＴＩ－ＰＨＯ２（野生型）融合蛋白能够被酵母ＹＰＨ４９９总蛋白抽提物磷酸化,如果以ＳＰＩＫ（２３０－２３３）一致序列被破坏的ＧＳＴ－ＰＨＯ２（Ｐｒｏ－２３１→Ｓｅｒ）突变体作为底物,则观察不到该融合蛋白被酸磷化标记。结果表明ＰＨＯ２在细胞内是一种磷骏化蛋白,第２３０位Ｓｅｒ的磷酸化是该转录因子较制ＰＨＯ５基因表达的活性所必需。     

应用酵母双杂交筛选与CUEDC2相互作用的蛋白质

目的：应用酵母双杂交技术,筛选与包含CUE结构域的人CUEDC2发生相互作用的蛋白质。方法：应用酵母双杂交系统,以CUEDC2为诱饵筛选人乳腺cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白质,并运用营养缺陷型培养和X-alpha-Gal等实验提供的信息,筛除假阳性克隆。结果：以CUEDC2为诱饵最终筛出了2个阳性克隆,经测序及生物信息学分析,这2个克隆同为GADD34。结论：CUEDC2可以和GADD34发生相互作用,它们的相互作用有可能与CUEDC2的功能调控相关。     

酵母PHO2蛋白的磷酸化研究

本文报道了ＰＨＯ２蛋白能被一种未知的蛋白激酶磷酸化。ＰＨＯ２蛋白的第２３０－２３３位氨基酸残基因组成一个可能ｐ３４＾ｃｄｃ３／ＣＤＣ２８相关的蛋白激酶识别的一致序列,用点突变的方法将Ｓｅｒ－２３０变成Ａｌａ可导致ＰＨＯ２蛋白激活ＰＨＯ５表达能力的完全丧失。     

酵母双杂交及其衍生系统

蛋白质是基因的表达产物,由于蛋白质间的相互作用可以表现出基因的关联性,随着基因组序列的破译,研究蛋白质间的相互作用关系显得日益重要。详细介绍了目前在研究蛋白质间相互作用中十分重要的酵母双杂交系统及其多种衍生系统的原理及其理论与实践意义。     

酵母双杂交系统筛选与RapGAP相互作用的蛋白质

目的筛选与Rap GAP相互作用的蛋白质,为进一步研究人源Rap1GAP介导的信号转导通路、揭示其与肿瘤的关系提供实验依据。方法选用与Rap1GAP同源的来自美丽线虫的Rap GAP作为饵蛋白,以来源于美丽线虫的c DNA文库作为靶蛋白,应用p PC97、p PC86组成的酵母双杂交系统筛选c DNA文库中与Rap GAP相互作用的蛋白质。结果通过营养缺陷平板(-LTH)筛选出63个拟似阳性菌落。经过Lac Z鉴定,19个菌落为阳性,其中7个为强阳性。提取来自19个酵母菌落中的重组DNA,经PCR扩增,12个菌落出现阳性结果。将该19个重组DNA分别电转化入DH5α细菌,涂板培养后,每板挑取4~10个克隆,通过Sal I和Not I双酶切鉴定进行阳性克隆筛选。将阳性克隆的重组DNA进行序列测定。测序结果与Gen Bank比较,其中4个克隆的DNA片段为Y39b6a基因片段、2个为Rap GAP、1个为苯丙氨酸-4-羟化酶、1个为细胞色素C氧化酶,还有1个DNA片段编码美丽线虫特有的小分子蛋白的基因片段,其余11个DNA片段不编码已知蛋白质。结论初步筛选出与Rap GAP相互作用的蛋白质,特别是其中有2个克隆为Rap GAP,提示Rap GAP可能以二聚体的方式存在。     

大规模酵母双杂交技术研究蛋白质相互作用的应用

简介了酵母双杂交技术原理, 总结了酵母双杂交技术大规模筛选蛋白质相互作用的基础、应用及存在的问题。因为大规模酵母双杂交技术结果有大量假阳性及假阴性问题, 因此, 有条件情况下有必要同时开展其他方法的大规模蛋白相互作用研究, 以构建规模更大可信度更高的蛋白质相互作用网络图。     

酵母双杂交及其衍生系统

酵母双杂交系统是一种研究蛋白质相互作用的分子生物学方法,过去20多年里,大量衍生系统的出现使得这套双杂交技术体系更加完善和高效,成为研究蛋白质-配体相互作用的重要技术手段,广泛应用于功能基因组学、蛋白质组学、病理学等研究领域。对酵母双杂交及其衍生系统的基本原理和应用进展进行综述。     

酵母双杂交系统在膜蛋白相互作用研究中的应用

膜相关蛋白约占细胞总蛋白质中的1/3,它们大都参与了细胞的诸多生理、病理过程和药物反应机理。研究膜蛋白的相互作用对于揭示细胞的生命活动规律及寻找药物作用靶标都有重要的意义。由于膜蛋白本身的特性及其难以进入核内等原因,经典的酵母双杂交技术并不适用于检测膜蛋白间的相互作用。针对在活细胞中研究膜蛋白相互作用的需要,近年来国际上先后发展了一系列用于膜蛋白相互作用研究的酵母双杂交新系统,并取得了许多重要发现。     

人血小板生成素受体c—MPL膜内部分的聚合作用

血小板生成素（ＴＰＯ）是调节血小板生成最主要的细胞因子,其生物学效应由其受体ｃ－ＭＰＬ介导。利用酵母双杂合系统研究ｃ－ＭＰＬ膜内部分在ＴＰＯ信号转导途径中的功能。首先用反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）方法从人红白血病ＨＥＬ细胞系总ＲＮＡ中扩增并克隆Ｐ型ｃ－ＭＰＬ（ＭＰＬＰ）膜内部分ｃＤＮＡ,经测序验证后克隆至双杂合载体ｐＡＳ２和ｐＧＡＤ４２４中,重组质粒命名为ｐＡＳＭＭ和ｐＧＡＤＭＭ。将ｐＡＳＭＭ与ｐ     

蛋白磷酸化与两组分信号系统

可逆的蛋白磷酸化是生物体内存在的一种最为普遍的调节方式,几乎涉及所有的生理及病理过程,在细胞的信号传递中起着极其重要的作用。根据底物蛋白质被磷酸化的氨基酸种类可将各种蛋白激酶分为3类:第一类为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(ｓｅｒｉｎｅｔｈｒｅｏｎｉｎｅｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ,ＳＰＫ),目前发现的蛋白激酶多属此类;第二类为酪氨酸蛋白激酶(ｔｙｒｏｓｉｎｅｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ,ＴＰＫ),这类激...     

用酵母双杂交技术研究IGF-1与其结合蛋白3的相互作用

 为了探讨胰岛素样生长因子结合蛋白 3(IGFBP- 3)分子上的胰岛素样生长因子 1 (IGF- 1 )结合位点并找出其关键氨基酸残基组成 ,首先建立了研究 IGF- 1与 IGFBP- 3相互作用的酵母双杂交模型 ,可以定性和定量地分析两个蛋白质之间的相互作用大小 ;同时利用基因体外定点突变的方法 ,对推断出的 IGF- 1结合位点中的氨基酸突变 ,经 DNA序列分析 ,构建了 5种 IGFBP- 3突变体 .然后在酵母双杂交模型中通过对报告基因活性的定量分析 ,检测 IGF- 1与各种 IGFBP- 3突变体之间相互作用的大小 .结果表明 ,IGFBP- 3分子上的 Lys2 2 2 ,Gln2 2 3突变后 ,与 IGF- 1的结合力大大下降 ,而 Arg2 2 5,Pro2 2 6,Ser2 2 7突变后也导致与 IGF- 1结合力的部分下降 .从而初步确定了IGFBP- 3分子中第 2 2 2～ 2 2 7位的氨基酸区域为 IGF- 1的结合位点 ,并且 IGFBP- 3分子上 Lys2 2 2 ,Gln2 2 3在与 IGF- 1结合中起着重要作用 .     

用酵母双杂交系统筛选与人甲硫氨酸氨基肽酶2相互作用的蛋白质

甲硫氨酸氨基肽酶 2 (type 2methionineaminopeptidase ,MetAP2 )是有效抑制血管生成的烟曲霉素类小分子化合物的蛋白质靶体。利用酵母双杂交系统筛选与MetAP2相互作用的蛋白质因子。首先将人MetAP2全长基因克隆至pGBKT7双杂合载体中 ,然后以构建的 pGBKT7MetAP2为靶蛋白质粒 ,筛选了人脑cDNA文库。在 2×10 6个转化子中得到 5个阳性克隆。序列测定表明 ,其中 3个阳性克隆编码人穴样内陷浮舰蛋白 (flotillin)片段 ,从而暗示MetAP2可能在flotillin参与的生物学过程中发挥作用     

Jak3下游分子p160.2的筛出及研究

与白细胞介素－２（ＩＬ－２）受体γ（ＩＬ－２Ｒγ）结合的非受体型酪氨酸激酶Ｊａｋ３在ＩＬ－２发挥生理作用过程中起着重要作用。为了寻找它的下游分子,利用酵母双杂合系统以Ｊａｋ３的Ｎ端ＪＨ３－ＪＨ７区域筛选ｃＤＮＡ库。     

抗增殖蛋白在酵母双杂交系统中转录激活作用的检测

目的:检测抗增殖蛋白在酵母双杂交系统中是否具有转录自激活作用。方法:采用PCR方法扩增抗增殖蛋白基因全长序列,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7-PHB,制备酵母菌AH109感受态细胞,将pGBKT7-PHB转化感受态酵母菌AH109后培养于含缺失培养基的平板上,检测β-半乳糖苷酶活性,判定其是否具有转录自激活作用。结果:扩增出抗增殖蛋白基因全长序列,构建了诱饵载体pGBKT7-PHB,转化酵母菌AH109后在双缺和三缺培养基上未能使β-半乳糖苷酶活性滤纸片变蓝,说明报告基因未被激活。结论:抗增殖蛋白没有转录自激活作用,可用于酵母双杂交系统。     

棉花锌指蛋白GhZFP1相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

GhZFP1蛋白是从盐胁迫棉花幼苗cDNA文库中分离的一种CCCH型锌指蛋白.初步的生物学功能研究表明,过量表达该基因的转基因烟草耐盐性和抗病性显著提高.为深入研究GhZFP1蛋白的作用机制,构建pGBKT7-m1诱饵表达载体,利用酵母双杂交系统从盐胁迫诱导棉花cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白.通过阳性克隆的表型确定、PCR和限制性内切酶检测以及测序和生物信息学分析,获得9个与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白.双分子荧光互补实验证明,GhZFP1与GZIRD19A确实存在互作关系.通过分析这些靶蛋白的已知功能,为研究GhZFP1锌指蛋白的未知生物学功能提供重要信息.     

Tec家族蛋白酪氨酸激酶Itk PH结构域与OS-9蛋白的相互作用

用酵母双杂交技术筛选与ItkPH结构域相互作用的蛋白分子 ,以了解Itk的功能及其在T细胞信号转导中的位置与作用 .Itk的PH结构域扩增后克隆入酵母双杂交系统的pLexA载体 ,转化酵母细胞EGY4 8(p8op lacZ) ,经检测PH结构域无自激活作用 ,且对酵母细胞无毒性作用 .用PH结构域作为“钓饵”蛋白 ,在酵母双杂交系统中筛选构建于AD载体的T细胞cDNA文库 .将PH结构域及筛库所得基因片段分别进行融合表达 ,用于体外结合实验 ,进一步证实二者的相互作用 .经营养缺陷选择、诱导筛选和鉴定确证 ,筛库所得的插段约 15 0 0bp的文库质粒为一真阳性克隆 .经blast比较分析为骨肉瘤、横纹肌肉瘤等肿瘤组织中高表达的os 9基因 .体外结合实验也表明 ,ItkPH结构域可与该基因表达产物结合 .Itk的PH结构域可与OS 9蛋白相互作用 .二者结合的意义有待进一步研究     

5T4 Interacts with TIP-2/GIPC, a PDZ Protein, with Implications for Metastasis

Overexpression of the 5T4 transmembrane glycoprotein can have marked effects on both the actin cytoskeleton and cell migration. Using a yeast two-hybrid approach, we describe a novel interaction between 5T4 and TIP-2/GIPC, a cytoplasmic interacting protein containing a PDZ domain. The cytoplasmic tail of 5T4 contains a class I PDZ-binding motif (Ser-Asp-Val) and we demonstrate that this region, in particular the terminal valine, is required for 5T4 interaction with TIP-2/GIPC. HeLa cells expressing hemagglutinin-tagged TIP-2/GIPC (HA-TIP-2/GIPC) have an altered distribution of endogenous 5T4, which colocalizes with HA-TIP-2/GIPC, thus supporting an interaction. Furthermore, TIP-2/GIPC can be coimmunoprecipitated with 5T4 from HeLa cell lysates. Identification of the 5T4 and TIP-2/GIPC interaction provides the first link between 5T4 and the actin cytoskeleton. Since other proteins, like 5T4, associate with TIP-2/GIPC and are linked with cancer, we explore the possibility that TIP-2/GIPC may be a common factor involved in the cancer process.