重组HIV-AEgp145和SIV-envT基因的rAAV8在小鼠体内的免疫原性研究

病毒性载体疫苗是一种有前途的艾滋病疫苗.为了构建以重组腺相关病毒8型(recombinant adeno associated virus type 8,rAAV8)为载体,表达HIV或SIV包膜蛋白的艾滋病疫苗.同时在小鼠体内对其免疫原性进行评价,为下一步研究奠定基础.本研究分别构建了表达HIVAE亚型和SIVmac239株包膜蛋白(不含胞内区)的rAAV8-AEgp145和rAAV8-SIVenvT两种重组病毒,并通过PCR和WesternBlot方法对重组病毒进行了体外鉴定.将两种重组病毒分别接种BALB/c小鼠,应用ELISA和ELISPOT方法检测小鼠的HIV/SIV特异性抗体滴度和细胞免疫应答强度.结果显示,rAAV8能够在293T细胞中高效表达HIV AEgp145和SIVenvT基因.小鼠接种两种重组病毒3-5W后,均能检测到gp120特异性抗体和env特异性细胞免疫应答,并且在16-20W后反应强度仍显著高于对照组.以上结果提示,携带HIVAEgp145和SIVenvT基因的rAAV8载体能够在小鼠体内诱导中等强度并且持续时间较长的特异性体液和细胞免疫应答.     

1型和2型外壳蛋白构建的AAV载体携带HIV-1 gag诱导免疫反应的比较研究

比较两种血清型的腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体携带HIV-1gag基因肌肉注射诱导小鼠免疫反应的特点。分别制备携带EGFP和HIV-1gag基因的重组AAV2/1(AAV1)和AAV2载体。小鼠肌肉注射rAAV1-EGFP和rAAV2-EGFP,观察注射局部EGFP的表达。将rAAV1-gag和rAAV2-gag分别以0、3周初免/加强方式肌肉注射免疫BALB/c小鼠以及新西兰白兔。ELISA法检测抗HIV-1 Gag P24蛋白的特异性抗体,细胞内细胞因子染色法检测Gag特异性的CTL反应。结果表明,rAAV1-EGFP在小鼠肌肉的表达强度显著高于rAAV2-EGFP;用Western blot法和间接免疫荧光法检测rAAV1-gag和rAAV2-gag体外转染的293细胞,均可检测到HIV-1 Gag蛋白的表达;在小鼠体内rAAV1-gag和rAAV2-gag组均可检测到特异性P24抗体,抗体滴度rAAV1-gag组显著高于rAAV2-gag组;而无论rAAV1-gag组还是rAAV2-gag组,特异性CTL反应均较低,与阴性对照组相比均无显著性差异;两种载体免疫兔子也都可检测到特异性P24抗体,同样地,rAAV1-gag组显著高于rAAV2-gag组。结论:携带HIV-1gag基因的rAAV1或rAAV2以肌肉注射方式免疫小鼠主要诱导特异Gag的体液免疫反应;且rAAV1可诱导很强的抗HIV-1 Gag特异性抗体,抗体水平显著高于rAAV2。     

高嗜肝性8型重组腺相关病毒体内转导法制备乙型肝炎病毒持续感染小鼠模型

用高嗜肝性的重组8型腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus type8,rAAV8)载体携带1.3拷贝乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)基因组(ayw亚型)体内转导法,建立持续表达HBV抗原的C57BL/6小鼠模型。首先,制备并纯化了携带1.3拷贝HBV基因组(ayw亚型)的重组8型腺相关病毒(rAAV8-1.3HBV);将rAAV8-1.3HBV以剂量2×10e11vg/只注射C57BL/6小鼠(Viralgenome,vg);在不同时间点实施尾静脉采血,采用ELISA方法监测血清中HBsAg和HBeAg的水平及动力学变化;10周后处死小鼠,取血液、肝组织样本,提取基因组DNA,荧光定量PCR检测HBVDNA拷贝数;利用鉴定HBVDNA环化形式的特异性引物进行PCR扩增以检测肝组织中环化的HBVDNA,并检测HBV抗原特异性的免疫组化和肝脏病理变化。结果显示,注射rAAV8-1.3HBV的3只C57BL/6小鼠第1周开始在血液中检测到HBsAg和HBeAg的表达,并持续至第10周均为阳性,其中HBsAg的表达水平经历了一个上升-下降-再上升的过程(注射后第4周时最低,第6周后维持较高水平),而HBeAg表达水平则持续阳性且比较稳定。荧光定量PCR结果显示,3只小鼠10周后血清中HBV DNA的拷贝数分别为4.2×103、3.6×103、2.5×103copies/mL,肝脏中则分别为8.0×106、5.7×106、2.6×106copies/g肝组织。在3只小鼠肝组织中均检测到环化HBV DNA,提示AAV8载体携带的线性HBV DNA成功回复成环化HB VDNA。免疫组化分析显示3只小鼠肝脏中均存在HBsAg和HBcAg表达;体内转染10周后肝脏组织切片的HE染色分析显示未见明显的炎性细胞浸润及组织结构异常。结果表明,本研究利用高嗜肝性重组8型腺相关病毒载体携带1.3拷贝乙型肝炎病毒基因组(ayw亚型)体内转导C57BL/6小鼠,成功地建立了HBV病毒在肝内稳定复制并持续表达HBV抗原的小鼠模型,为进一步研究HBV慢性持续感染的机制与应用于药物以及疫苗评价打下了基础。     

表达HCV包膜蛋白的两种重组腺相关病毒疫苗的制备及免疫原性分析

重组腺相关病毒载体(rAAV)可在动物体内高水平地持久表达外源基因,本研究采用两种rAAV载体(rAAV1与rAAV2)构建了表达丙型肝炎病毒中国分离株包膜糖蛋白(E1E2)的载体疫苗并以之免疫小鼠,分别采用免疫荧光证实其表达与总抗体,用HCV假病毒系统检测其中和抗体水平,用ELISpot分析其细胞免疫应答,结果表明:rAAV1-E1E2重组载体疫苗单针免疫激发的体液应答明显高于rAAV2-E1E2,rAAV1-E1E2单针注射后3个月可在肌肉组织中检出E2蛋白表达及特异性T细胞应答。上述结果提示HCV重组腺相关病毒载体疫苗单针免疫可引起明显持久的体液与细胞免疫应答。     

rhEPO-L-Fc融合蛋白的表达、生物活性和初步药动学分析

为了延长人促红细胞生成素(hEPO)体内半衰期以达到更好的药效,制备通过柔性接头相连接的重组人红细胞生成素-IgG1 Fc融合蛋白(rhEPO-L-Fc),并对其生物学活性和体内药动学进行初步研究.利用PCR技术构建rhEPO-L-Fc融合基因,克隆至表达载体pOptiVEC-TOPO ,在二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr-)表达.Protein A亲合层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE、质谱、Western blotting鉴定表达产物,细胞增殖实验检测融合蛋白的体外活性,动物实验检测融合蛋白的体内活性和半衰期.成功构建pOptiVEC-TOPO -rhEPO-L-Fc重组子,实现了在CHO细胞表达,纯化后的rhEPO-L-Fc融合蛋白经鉴定,其分子量和特异性均与理论值相符,能刺激体外培养的EPO依赖型细胞生长,ED50为2 ng/mL,且明显增加大鼠外周血网织红细胞数,体内消除半衰期达到27 h.rhEPO-L-Fc融合蛋白能延长hEPO体内半衰期,为其临床研究奠定了基础.     

一种高效的重组腺伴随病毒载体生产系统

重组腺伴随病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)载体是目前较理想的基因治疗载体之一,但难以大规模制备一直是影响其广泛应用的主要因素.曾组建了一种表达2型腺伴随病毒(adeno-associated virus type 2,AAV-2) Rep和Cap的重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/DUL2,现在此基础上,证实了该重组病毒支持rAAV的复制与包装,包装出的rAAV具有感染性;构建了携带新霉素抗性基因、适合多种外源基因插入的通用型rAAV载体质粒pSNAV-2及表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的rAAV载体质粒pSNAV-2-GFP,建立了稳定携带GFP基因表达盒的rAAV载体细胞株;确定了HSV1-rc/DUL2感染载体细胞株时的最佳感染复数(multiplicity of infection, MOI)为0.1;采用“一种病毒感染一个载体细胞株”的策略,用“感染”的方式代替传统的“转染”方式,使每个细胞产生的rAAV比传统方式提高了2个数量级以上,并实现了rAAV的规模化制备,为rAAV用于基因治疗的临床试验打下了基础.     

重组腺相关病毒小鼠骨骼肌中近红外荧光蛋白表达及活体成像

近红外荧光蛋白因激发光和发射光波长位于近红外区,在动物组织中光吸收和光散射最低,更适宜于动物活体组织的深层成像.构建了一种携带近红外荧光蛋白(near-infrared fluorescent protein,iRFP)713基因的重组表达质粒pAAV-iRFP713,将重组表达质粒与辅助质粒共转染AAV-293细胞,包装重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)rAAV-iRFP713.重组腺相关病毒表达载体感染体外培养的癌细胞,48h后,荧光显微镜检测显示近红外荧光蛋白在癌细胞中高效表达,荧光明亮.重组腺相关病毒表达载体注射小鼠骨骼肌,48h后,用近红外荧光活体成像系统检测证明近红外荧光蛋白在小鼠骨骼肌中表达较强, 活体组织成像清晰.实验结果表明近红外荧光蛋白在体内体外均能很好地表达并荧光成像,为动物活体组织标记和成像的研究提供新方法.     

重组HIV-1 gp120 AAV2/1在小鼠和恒河猴体内的免疫原性

本文旨在研究表达HIV-1中国流行株gp120基因的重组腺相关病毒疫苗在小鼠和恒河猴体内的免疫原性。用rAAV2/1-gp120免疫BALB/c小鼠和恒河猴,分别用ELISA和HIV-1假病毒中和试验检测免疫动物血清中HIV-1特异性IgG抗体水平和中和抗体水平,用ELISPOT方法和体内杀伤实验检测HIV-1特异性细胞免疫应答水平。结果显示在小鼠体内用rAAV2/1-gp120仅免疫一次就能诱导较高水平的IgG抗体,IgG抗体至少能持续21周,但没有检测到中和抗体。rAAV2/1-gp120在小鼠体内诱导微弱水平的HIV-1特异性细胞免疫应答。rAAV2/1-gp120在恒河猴体内诱导的HIV-1特异性细胞和抗体反应均很弱,且检测不到中和抗体。提示rAAV2/1载体在诱导抗体反应方面具有特殊优势,但若希望诱导HIV-1特异性中和抗体,则需要改造env基因以提高其免疫原性。     

2型重组腺相关病毒体外转导培养细胞的研究

为揭示2型重组腺相关病毒感染哺乳动物细胞的一些转导特征,构建并制备了一种携带萤火虫荧光素酶基因的重组2型腺相关病毒rAAV2-Luc,研究了该重组病毒体外转导哺乳动物细胞的量效关系;肝素对转导的拮抗作用;rAAV2的竞争抑制作用;丁酸钠对表达水平的增强作用.结果显示,在一定范围内,随着rAAV2-Luc感染细胞的感染复数(MOI即每个细胞感染的病毒基因组数)值增高,荧光素酶的表达水平也增高;但更高的MOI(＞107)反而使荧光素酶的表达水平下降.肝素可特异性阻断rAAV2介导的荧光素酶表达.携带不同基因的2种rAAV2病毒相互具有明显的竞争抑制作用.丁酸钠可显著增强rAAV2介导的荧光素酶表达水平.本研究对rAAV2载体介导的基因转移研究具有一定的指导意义.     

2型腺相关病毒载体介导正常人β珠蛋白基因在重型地贫流产胎儿造血细胞中的表达

目的:探讨2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus 2,rAAV2)载体介导人β-珠蛋白基因转染地贫患者造血细胞治疗β-地中海贫血的可行性.方法:分离β 41-42/β 654杂合子型重型β-地贫流产胎儿造血细胞,经rAAV2-β-globin病毒转染(MOI=50)后移植入经X射线照射的BALB/c裸小鼠体内,分别于移植后14d、21d处死受体小鼠,RT-PCR及等位基因特异性PCR法检测人珠蛋白基因在受体小鼠体内的表达.结果:RT-PCR方法于3只受体小鼠骨髓样本中成功检测到人β-actin和人β-珠蛋白基因的表达,而21d处死的转染与对照小鼠外周血样本中未检测到人β-珠蛋白基因表达;等位基因特异性PCR方法在所有受体鼠体内同时检测到β 41-42和β 654突变基因,以及正常β-珠蛋白基因的表达,但rAAV2-β-globin转染组小鼠体内正常人β-珠蛋白基因表达水平明显高于对照组.结论:rAAV2可有效转染β 41-42/β 654杂合子型重型地中海贫血患者造血细胞,并通过exvivo途径介导β-珠蛋白转基因的体内表达,提高红系细胞内正常β-珠蛋白基因的表达水平.     

The life and death of gene families

One of the unique insights provided by the growing number of fully sequenced genomes is the pervasiveness of gene duplication and gene loss. Indeed, several metrics now suggest that rates of gene birth and death per gene are only 10–40% lower than nucleotide substitutions per site, and that per nucleotide, the consequent lineage‐specific expansion and contraction of gene families may play at least as large a role in adaptation as changes in orthologous sequences. While gene family evolution is pervasive, it may be especially important in our own evolution since it appears that the “revolving door” of gene duplication and loss has undergone multiple accelerations in the lineage leading to humans. In this paper, we review current understanding of gene family evolution including: methods for inferring copy number change, evidence for adaptive expansion and adaptive contraction of gene families, the origins of new families and deaths of previously established ones, and finally we conclude with a perspective on challenges and promising directions for future research.     

利用套叠PCR技术进行基因突变和拼接

利用套叠PCR技术（又称重叠区扩增基因拼接法）对hGM-CSF基因内第28位氨基酸处的糖基化位点进行突变和进行人促性腺激素基因,腺苷酸激酶短肽与胰岛素样生长因子－基因三者之间的拼接,结果表明采用该技术能在体外实行有效的基因重组和定点突变,其成功率为100％,这一技术不需要内切酶消化和连接酶处理,技术操作员简单易行,在基因拼接,基因内部突变方面具有良好的应用价值。     

真核基因的快速克隆及表达

以细胞间隙连接蛋白基因Cx26作为目的基因,通过T-A载体介导,构建真核表达重组载体pcDNA3.1( ) /Cx26,重组表达载体转染人鼻咽癌细胞株HNE1,表达Cx26间隙连接蛋白。     

成簇基因的时空表达调控

成簇基因具有不同单个基因的特性,同一簇内基因大多有类似的结构,功能以及表达模式,基因之间时空表达模式及表达量高度协调,提示同一簇基因是作为统一整体进行调节的,具有共同的调节机制。基因成簇排列是实现基因时空协调表表达的基础,是遗传信息的一种高级组织形式,具有强大的进化优势,要揭示成簇基因表达调控的基本规律,应从顺式作用元件,反式作用因子,染色质等层次,进行整体的以及多基因相互作用的研究,这些机制的阐     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因,ｐｌ６基因为目的基因,将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游,构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６,并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

基因功能研究方法浅介

随着人类基因组计划的进展,数据库中积累了越来越多未知功能的基因序列,分析这些基因的功能将成为基因组计划的主要任务。本介绍了几种研究特定基因功能的方法及程序。     

运动能力相关基因的先天遗传与后天转移

对人体生理特性的研究结果显示,部分运动相关基因如α-肌动蛋白-3、血管紧张素I转换酶、Ⅱ型活化素受体B的基因多态性会明显影响运动员的运动天赋和体能。建立优秀运动员基因库,发现和鉴定可影响运动能力的基因变异体,使得在儿童中开展DNA测试,挑选适合某种特殊体育项目的运动天才和优化训练方法具有一定现实操作意义。另一方面,随着滥用基因技术以提高运动能力的可能性不断提高,部分基因有可能作为基因兴奋剂,通过基因转移的方法导入人体,其所涉及的伦理问题、对人类健康及社会的潜在危害等,已经引起了来自自然科学和社会科学不同领域的广泛关注。     

性别决定基因SRY的研究进展

SRY基因是哺乳动物性别决定过程中的主宰基因,其表达产物SRY蛋白是一种DNA结合蛋白,该蛋白含有一个HMG盒,能够以序列特异性结合到DNA双螺旋链的一侧,起到转录因子的作用。调节或协同下游基因如SOX9、AMH等基因的表达,使胚胎发育向雄性方向发展。     

硫霉素环化酶基因在变铅青链霉菌TK24中的表达及基因定位

将含有硫霉素环化酶基因的重组质粒p6BCl2转化变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)TK24,含有p6BCl2的转化子细胞抽提液分别与琉霉素生物合成阻断变株Y,发酵液以及纯化的Y。中间产物经过体外共培养可产生活性物质．化学分析表明与Y,发酵液混合后产生的是硫霉素,与纯化的Y。中间产物混合产生的是一种不稳定的活性物质。说明硫霉素环化酶基因在S.lividans TK24中得到了表达,其产物以Y。中间产物为底物并弥补了Y,中的缺陷。对p6Bcl2中4．5kb外源片段进行了限制酶酶切分析,建立了酶切图谱．利用含硫霉素环化酶基因的S．Lividans TK24转化子体外转化Y,的应用体系,将硫霉素环化酶基因定位在0．9kb Hinc I—Pst I片段上,并证明了硫霉紊环化酶的活性与IPNS同源片段无关。以上实验为进一步研究琉霉素环化酶基因的结构打下了基础。