EB病毒融合蛋白Zta-P54在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

为获得能用于检测试剂盒的高纯度具有活性的EB病毒融合蛋白,以pGEX5T-BZLF1-BMRF1质粒为模板进行PCR扩增得到BZLF1-BMRF1融合基因,将其插入pET32a中,构建表达质粒pET32a/BZLF1-BMRF1。将该质粒转入大肠杆菌培养,经IPTG诱导获得Zta-P54融合蛋白。用DEAE-Sepharose CL-6B和Ni-NTA亲和层析纯化,并通过SDS-PAGE和Western blot对Zta-P54融合蛋白进行鉴定。双酶切鉴定和测序结果显示成功构建pET32a/BZLF1-BMRF1质粒,SDS-PAGE显示该蛋白相对分子量约为60kD,与预期结果一致。纯化后获得纯度为96.5%的Zta-P54融合蛋白。Western blot检测该蛋白有良好的生物活性和反应特异性。因此,成功构建pET32a/BZLF1-BMRF1质粒,在大肠杆菌中可溶性表达。最终获得纯度高、生物活性好的融合蛋白。     

合成人干细胞cDNA在大肠杆菌中的高效表达与纯化

以pBV220为载体,进行了合成可溶型人干细胞因子(SCF)cDNA在大肠杆菌中的温控型的高效表达。SDS-PAGE检测表明,在实验室摇瓶培养中,目的蛋白可占菌体可溶蛋白的40％左右。表达产物复性后,经过凝胶过滤、离子交换层析,得到了电泳纯的重组rhSCF,经测定,纯化的rhSCF相对分子质量为19000,氨基端15个氨基酸的序列与天然可溶形式的hSCF成熟分子的序列完全一致。     

人PPARαLBD在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定

过氧化物酶体增殖物活化受体α(peroxisome prolifterator-activated receptor α,PPARα)属于Ⅱ型核受体,通过其配体结合区（1igand binding domain,LBD）结合特定的激动剂对参与机体代谢的关键酶、受体等的表达起调节作用。本研究从人肝组织提取总RNA,RT-PCR扩增出PPARαLBD的cDNA,将其克隆入表达载体pMAL-p2X麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein,MBP）编码基因malE序列的下游,重组质粒转化E coli TB1,进行了高效的可溶性融合蛋白表达。产物经多糖亲和树脂（Amylose-resin）纯化后,获得了电泳纯的MBP-PPARαLBD。MBP-PPARαLBD用Xa因子酶切,经Amylose-resin亲和层析、DE-52阴离子交换层析纯化回收,获得了电泳纯的PPARαLBD。本研究为进一步比较MBP-PPARαLBD和PPARαLBD的功能,筛选PPARα配体奠定了基础。     

β-防御素130在大肠杆菌中的串联表达、纯化及生物活性分析

为了研究抗菌肽β-防御素130的生物学活性和实现大规模制备,通过改良其分子结构,构建表达载体pET28a-3×β-defensin130,利用大肠杆菌BL21 (DE3)作为宿主细胞诱导表达后为水溶性蛋白。对纯化后抗菌肽进行抑菌实验、稳定性实验、MTT实验和溶血性实验确定其生物活性。最终成功制备出25 kDa的重组蛋白,对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)(45μg/mL)和单增李斯特菌(ATCC221633)(80μg/mL)等革兰氏阴性和阳性菌都表现出极强的抗菌活性,且其抗菌活性不受温度、pH值和蛋白酶消化等影响,MTT细胞毒性实验显示其对HEK293细胞无毒性且对兔源红细胞具有极低的溶血性。这将为新型抗菌肽的开发提供理论基础并推动抗生素替代产业快速发展。     

重组人TNF-α在大肠杆菌表达、纯化及生物学活性鉴定

[目的]获得人TNF-α蛋白,并鉴定其生物学活性。[方法]通过对人源TNF-α序列进行密码子优化构建了p Cold-TNFα原核表达载体,完成了TNF-α重组蛋白的表达,建立了两步分离纯化方案,并利用Western Blot和细胞刺激实验检测了重组人TNF-α蛋白抗原性和生物学活性。[结果]利用大肠杆菌成功表达重组人TNF-α蛋白,经酶切纯化后的人TNF-α蛋白不含标签序列,纯度达95%,收率约70%,并具有良好的生物学活性。[结论]获得具有生物学活性的人TNF-α蛋白,为进一步的中和抗体研究奠定了基础。     

人心肌肌钙蛋白I-C融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

提取人心肌组织总RNA,RT-PCR扩增出人心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）和肌钙蛋白C（TnC）基因,利用人工合成的可编码19个中性氨基酸残基为主的DNA序列（Linker）,将cTnI和TnC基因连接,插入到质粒pET15b中,将鉴定正确的重组pET15b质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,用异丙基-β-D–硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白质表达.结果在大肠杆菌中成功实现了全长cTnI-C融合蛋白（cTnI-linker-TnC）的稳定可溶性高表达,在摇瓶中表达量可达21 mg/L.利用目的蛋白N端的组氨酸“标签”（His-tag）,经一步Ni²⁺-Sepharose柱亲和层析纯化,得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯蛋白质.经初步研究,cTnI-C具有较好的免疫原性和稳定性,有望成为cTnI测定系统可溯源的候选参考物质,推进cTnI检测的标准化进程.     

人α防御素5在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化研究

采用PCR扩增大肠杆菌偏好的人α防御素5成熟肽(mHD-5)密码子序列, 并将其克隆至pMAL-p2x质粒, 构建pMAL-p2x-mHD-5表达载体, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 诱导表达, SDS-PAGE分析目的蛋白表达量并优化表达条件。经亲和层析、酶切和离子交换层析等方法分离、纯化重组mHD-5(rmHD-5)多肽。采用浊度法测定rmHD-5对细菌的抑制活性。通过优化表达条件, 获得约30%的可溶性目的蛋白表达量, 并成功纯化rmHD-5。rmHD-5对大肠杆菌标准菌株(ATCC25922)具有较强的抑制活性, 在终浓度为62.5mg/mL时, 90%以上的细胞被抑制。结果表明采用可溶性融合表达策略, 在原核表达系统中诱导表达并纯化具有生物活性的防御素是可行的途径之一。     

人α防御素5在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化研究

采用PCR扩增大肠杆菌偏好的人α防御素5成熟肽(mHD-5)密码子序列, 并将其克隆至pMAL-p2x质粒, 构建pMAL-p2x-mHD-5表达载体, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 诱导表达, SDS-PAGE分析目的蛋白表达量并优化表达条件。经亲和层析、酶切和离子交换层析等方法分离、纯化重组mHD-5(rmHD-5)多肽。采用浊度法测定rmHD-5对细菌的抑制活性。通过优化表达条件, 获得约30%的可溶性目的蛋白表达量, 并成功纯化rmHD-5。rmHD-5对大肠杆菌标准菌株(ATCC25922)具有较强的抑制活性, 在终浓度为62.5mg/mL时, 90%以上的细胞被抑制。结果表明采用可溶性融合表达策略, 在原核表达系统中诱导表达并纯化具有生物活性的防御素是可行的途径之一。     

人神经生长因子基因在大肠杆菌中的克隆、表达及产物纯化

从人胎盘组织中提取总DNA, 经PCR扩增编码人β神经生长因子（β-NGF）成熟肽的基因,并克隆到大肠杆菌表达载体pET15b中。重组质粒pET15b-NGF经测序与报道的完全一致。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导表达得到16kD的目的蛋白带,与预期的大小一致,NGF表达量约占全菌总蛋白的25%.经过亲和层析柱（Ni2+-charged IDA his-bind column）纯化后得到了单一的NGF蛋白条带,蛋白纯度可达90%以上,从每升表达菌液中可以得到4.56mgNGF。表达产物的Western 印迹鉴定结果显示：重组人神经生长因子能与兔抗人β-NGF的多克隆抗体发生特异性结合反应,在16kD处出现单一的条带,表明诱导表达的重组NGF具有免疫学活性。鸡胚背根神经节感觉神经元鉴定试验表明,本实验表达的重组NGF具有良好的生物学活性。     

人造血相关PBX相互作用蛋白的原核表达及纯化鉴定

目的:构建带His标签的人造血相关PBX相互作用蛋白(HPIP)的原核表达载体,获得His-HPIP融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法:以本实验室保存的pcDNA3.0-HPIP质粒为模板,采用PCR技术扩增HPIP编码序列,将其插入载体p ET-28a(+)中,经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后转化大肠杆菌Rossate株进行小量诱导,挑选能诱导出His-HPIP的菌液进行融合蛋白的纯化,采用SDS-PAGE和Western印迹检测融合蛋白的纯化效果,采用GST pull-down技术对蛋白的生物学功能进行初步鉴定。结果:双酶切和测序结果表明His-HPIP原核表达质粒构建成功;His pull-down实验证实His-HPIP蛋白和雌激素受体α存在相互作用,说明生物学活性良好。结论:原核表达并纯化出His-HPIP融合蛋白,为进一步研究HPIP在肿瘤发生发展中的功能奠定了基础。     

人鼻咽癌相关基因NGX6在大肠杆菌中的诱导表达及纯化

NGX6是一个新克隆的鼻咽癌抑瘤基因候选者,为了进一步制备抗NGX6编码蛋白质的抗体和研究它的功能,本研究拟在原核表达系统中表达并纯化出NGX6蛋白．采用多聚酶链式反应(PCR)方法扩增出NGX6基因蛋白编码序列,构建该基因的融合表达质粒pGEX3X/NGX6,导入大肠杆菌中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳．Western hlot鉴定．用GST融合蛋白纯化试剂盒纯化融合蛋白．结果显示构建的融合表达质粒酶切和测序鉴定阅读框架正确,导入大肠杆菌中诱导后出现一条42kDa的新蛋白带,主要存在于细菌沉淀中,占总蛋白的26％,Western blot鉴定其为GST/NGX6融合蛋白,并进一步纯化出融合蛋白．研究表明NGX6基因编码蛋白质能够在原核细胞中表达,并能纯化出该种蛋白,为进一步深入研究该蛋白质的结构与功能打下了基础．     

鸡氨肽酶H在大肠杆菌中的表达、纯化与部分酶学性质分析

氨肽酶H(Aminopeptidase H, APH))是生物组织内一种常见的氨基内肽酶, 但因为天然材料中含量很低, 基本无法深入研究其催化机理、功能与结构的关系及其在生物体内的确切功能。从鸡肝组织克隆了APH的全基因序列, 并把该序列亚克隆到载体pET22b(+)上, 然后转化大肠杆菌Rosetta(DE3), 构建了APH的表达菌株。该菌株经IPTG诱导, 在SDS-PAGE上明显出现一条与天然APH理论分子量一致的新增蛋白带, 该条带的浓度随着表达时间的延长逐渐加深; 6 h基本达到平衡, 此时重组蛋白占总蛋白的16.7%, 表达水平高达94.7 mg/L。对表达产物进行了活性检测、纯化和酶学性质分析, 发现重组蛋白在亚基构成, 热稳定性, 最适pH等方面与天然APH基本相同, 据此可以确认表达产物确实是APH, 发酵液总活力达到1636 u/L。这些结果为APH的催化机理及其在生物体内的功能的阐明奠定了重要的物质基础。     

鸡氨肽酶H在大肠杆菌中的表达、纯化与部分酶学性质分析

氨肽酶H(Aminopeptidase H, APH))是生物组织内一种常见的氨基内肽酶, 但因为天然材料中含量很低, 基本无法深入研究其催化机理、功能与结构的关系及其在生物体内的确切功能。从鸡肝组织克隆了APH的全基因序列, 并把该序列亚克隆到载体pET22b(+)上, 然后转化大肠杆菌Rosetta(DE3), 构建了APH的表达菌株。该菌株经IPTG诱导, 在SDS-PAGE上明显出现一条与天然APH理论分子量一致的新增蛋白带, 该条带的浓度随着表达时间的延长逐渐加深; 6 h基本达到平衡, 此时重组蛋白占总蛋白的16.7%, 表达水平高达94.7 mg/L。对表达产物进行了活性检测、纯化和酶学性质分析, 发现重组蛋白在亚基构成, 热稳定性, 最适pH等方面与天然APH基本相同, 据此可以确认表达产物确实是APH, 发酵液总活力达到1636 u/L。这些结果为APH的催化机理及其在生物体内的功能的阐明奠定了重要的物质基础。     

人源CLP的表达、纯化及生化特性研究

目的：为进一步研究CLP（coactosin-likeprotein）与5’-脂氧合酶、肌动蛋白的相互作用机制及功能,开展CLP克隆表达、分离纯化研究,以得到高纯度的CLP,并对其生物化学特性进行分析测定。方法：从人的胎肝cDNA文库中经PCR扩增得到CLP基因,克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中并获得高效表达,经过Glutathione Sepharose 4B亲和层析和Su-perdex 75分子筛纯化,得到高纯度的CLP;在此基础上进行SDS-PAGE、动态光散射和分析型超速离心等实验,并进一步分析实验结果。结果：CLP在溶液中主要以单体形式呈现;CLP的摩擦率为1．909,证实该蛋白质具有线性化趋势存在的可能性,且线性化程度较高。结论：实验结果揭示了CLP作为线性化蛋白质的可能性,为进一步搭建CLP和丝状肌动蛋白的作用模型奠定了一定的数据基础。     

人胱硫醚β合成酶原核表达纯化及鉴定

目的：构建人胱硫醚β合成酶（human cystathionineβ-synthase,hCBS）基因原核表达载体,在E.coli BL21（DE3）中表达,并进行纯化和酶活性检测。方法：以胰腺细胞cDNA文库为模板,采用聚合酶链式反应（PCR）扩增hCBS基因蛋白编码区的全序列,克隆入原核表达载体pET32a（＋）,构建重组质粒pET32a（＋）-hCBS。经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因后与人CBS基因（基因bank号：BT007154.1）完全一致,转入E.coli BL21（DE3）中,由IPTG诱导表达融合蛋白。结果：经SDS-PAGE、Western blot分析,证明诱导表达的蛋白为重组人CBS（rhCBS）。再由Ni-NTA树脂亲和层析,并脱盐冷冻干燥后获得重组rhCBS（约19 mg/L培养物）,并测得其比活力约为57 kU/g。结论：成功地表达纯化出具有功能活性的重组蛋白rhCBS,为进一步研究该酶的相互作用蛋白以及其在生物学和临床科学的作用奠定了基础。     

Purification and characterization of the fusion protein trypsin-streptavidin expressed in Escherichia coli

Expression of fusion protein trypsin-streptavidin (TRYPSA)⁴ in Escherichia coli was evaluated and the protein purified. Protein expression was induced by 1 mM isopropylthio--D-galactoside (IPTG), and the enzyme activity was measured by the hydrolysis rate of p-toluenesulfonyl-l-arginine methyl ester (TAME). Expression of the fusion protein in the cell-free extract decreased with increased induction time; correspondingly, that in the inclusion bodies increased. The total expression in Luria–Bertani broth (LB) and Terrific Broth (TB) media reached the highest levels in 2 hr at 30°C. The optimum expression level was 35 and 48 U/L in LB and TB, respectively. Expression of the fusion protein was verified by Western Blot analysis using streptavidin antiserum, and the fusion protein was purified using a benzamidine Sepharose 6B affinity column at room temperature. The molecular size of the soluble purified fusion protein was determined by size-exclusion chromatography using Superose 12 FPLC. A molecular weight of 39–40 kDa was obtained, indicating that the soluble protein exists as a monomer; thus, the presence of the trypsin domain must prevent the streptavidin domain from tetramer formation.     

人甲状旁腺激素在大肠杆菌中的表达及鉴定

化学合成人甲状旁腺激素（hPTH）全长基因,克隆到大肠杆菌表达载体pBV220和pET22b中,获得了高表达。经破菌、阳离子交换层析、反相层析纯化获得了纯度大于95%的纯品。N端测序、质谱分析结果表明重组hPTH 结果完整,N端无Met或fMet。生物活性试验证明重组hPTH具有激活腺苷酸环化酶、增加骨质量和骨密度等作用。     

胸腺素α_1 基因的克隆表达及其生物活性

 胸腺素α1(thymosinalpha 1 ,Tα1)作为一种免疫增强剂 ,临床用途广泛 .为大量制备Tα1,按大肠杆菌惯用密码子合成Tα1基因 ,克隆于质粒pUC1 9的EcoRⅠ和PstⅠ位点 .经测序证明序列正确后 ,串联为 4串体 (Tα1④ ) ,经再次测序确认后克隆入pThioHisA的EcoRⅠ和PstⅠ位点 .转化大肠杆菌T0P1 0 ,酶切鉴定正确后 ,经 1mmol LIPTG诱导 4h ,获得硫氧还蛋白与Tα1④的融合表达 ,用离子交换层析纯化融合蛋白 .溴化氰裂解融合蛋白 ,释放出Tα1单体 ,经离子交换色谱纯化出Tα1.采用3 H TdR参入法进行生物活性测定 ,证实融合蛋白和Tα1均具有刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力 .     

TRAF6-GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:在大肠杆菌中表达肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)与GST的融合蛋白并进行纯化。方法:采用PCR方法从肝文库中扩增编码TRAF6的DNA片段,将其插入原核表达载体pGEX-4T-2,构建GST-TRAF6原核表达载体,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达;用谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化表达的GST-TRAF6融合蛋白。结果:酶切鉴定和测序分析显示,长为1569 bp的TRAF6 DNA片段在pGEX-4T-2-TRAF6中的碱基序列、插入位点及读框正确,且位于表达载体的GST序列下游;经IPTG最佳浓度0.5 mmol/L诱导表达、亲和纯化后,获得了相对分子质量约85×103的GST-TRAF6融合蛋白。结论:构建了重组GST-TRAF6原核表达载体,获得了GST-TRAF6的大肠杆菌BL21表达菌株及GST-TRAF6融合蛋白,利于深入研究TRAF6的功能。     

人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化简

目的：克隆、表达人vasorin（VASN）蛋白。方法：利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6xHis标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni^2＋金属螯合柱纯化。结果：内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61x10^3的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论：获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。