NIH3T3细胞恶变早期相关新基因的鉴定与功能分析

利用已建立的蛋白质酪氨酸磷酸酶α(PTPα)诱导表达模型寻找与PTPα高表达导致NIH3T3细胞恶变早期相关的新基因 ,探索肿瘤早期形成的机理 .诱导PTPα表达 2 4h ,用差异显示逆转录PCR获得 65条差异片段 ,利用生物信息学方法分析这些差异片段 .发现其中含有 2 9种已知基因 ,12种已知ESTs ,6种未知ESTs .对EST片段 ,利用芯片拼接 (insilicocloning)的方法获得 2条新的带有完整开放阅读框 (ORF)的全长cDNA .利用生物信息学方法分析其同源性、二级结构、功能模体(motif)、保守区、结构域和家族分布情况 ,并且对这 2条新全长cDNA进行部分克隆测序鉴定 ,用半定量RT PCR实验证实其差异表达的真实性 .结果表明 ,这 2条全长cDNA为新基因 (GenBankAY0 35 2 12 ,AY0 35 2 13) ,它们在PTPα诱导表达前后确实存在差异表达 ,并与细胞能量代谢及酶功能相关 ,为进一步探讨肿瘤早期形成机理打下基础     

NIH3T3细胞中PTPα基因高表达激活Src的早期细胞表型变化

利用蛋白质酪氨酸磷酸酶α(PTPα)基因转染NIH3T3细胞 ,研究PTPα诱导前后细胞生物学行为的变化 ,为肿瘤形成早期机制的研究提供细胞模型。用携带PTPα基因的四环素调控体系转染NIH3T3细胞并诱导 2 4h后 ,用RT PCR和蛋白质印迹法证实PTPα在诱导细胞中的表达高于未诱导细胞 ,用RT PCR及蛋白质印迹法发现内源性Src的表达水平在诱导与未诱导细胞中没有变化 ,而Src激酶的活性在诱导细胞中增高 ,并且在诱导细胞中Src的酪氨酸磷酸化水平降低。再用透射式电子显微镜和流式细胞技术观察到诱导细胞的表型已发生变化 ,实验结果表明PTPα诱导 2 4h使细胞的表型开始发生转化 ,这种变化很可能与PTPα表达水平升高使SrcC末端的pTyr52 7去磷酸化而激活Src相关     

过表达PTPα促进K562细胞体外增殖能力和体内致瘤性

探讨蛋白质酪氨酸磷酸酶α（PTPα）在血液肿瘤细胞中的特异性表达,研究过量表达PTPα对人红白血病细胞K562生物学行为的影响及在裸鼠体内致瘤能力的改变.首先应用RT-PCR和Western 印迹检测3种不同类型造血系肿瘤细胞（K562、NB4、Jurkat T）中PTPα的表达水平.根据检测结果,选择K562细胞作为研究对象,利用脂质体将 PTPα 真核表达载体转染K562细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,RT-PCR和Western 印迹验证过表达情况;经MTT法检测细胞增值能力的改变;用流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞分化状态;并将阳性克隆细胞皮下接种裸鼠,观察 PTPα 基因转染前后细胞系在裸鼠体内的致瘤能力及瘤体的组织化学变化.上述实验结果表明,通过G418压力筛选获得了 PTPα 高表达多克隆细胞系K562-PTPα;经体外增殖实验分析,实验组K562-PTPα细胞与未转染组细胞K562和转染空载体组细胞K562-splice相比,细胞生长速度增快,G₂/M期细胞比例增加( P <0.05),而细胞分化状态无明显变化;裸鼠体内致瘤实验显示,K562组、K562-splice组和K562 PTPα组平均瘤重分别为(1.1±0.3)g、(1.3±0.2)g和(2.5±0.5)g;病理切片显示,K562-PTPα组瘤体组织分化程度较对照组低、恶性程度高,细胞的致瘤能力增强( P <0.01).综上所述,过表达PTPα使K562细胞具有更强的体外增殖能力和体内致瘤性,表明PTPα可能在造血系统恶性肿瘤的发生发展中发挥促进作用.     

Mo MLV gag-pol基因在NIH3T3细胞中的表达和鉴定

目的 构建含MoMLV gag-pol基因的重组表达载体,实现其在NIH3T3细胞中稳定表达。方法 应用RT-PCR方法反转录并扩增gag-pol基因,克隆入真核表达载体pcDNA4/HisMaxA上,构建重组表达载体pcDNA4/HisMaxA-gag-pol,用脂质体法转染NIH3T3细胞,Zeocin筛选稳定表达细胞株,通过SDS-PAGE分析检测表明, gag-pol基因在NIH3T3细胞实现了表达,产物相对分子质量(kD)为194.78×103。然后,将逆转录病毒载体导入此细胞系,包装逆转录病毒。用PCR与标记基因补救分析法检测野生型辅助病毒。结果 酶切鉴定的片段大小分别为5.2-kb,与预期大小一致,经Zeocin筛选后获得稳定表达细胞株,SDS-PAGE实验表明产物融合蛋白相对分子质量(kD)为194.78×103,与预期相符。脂质体转染包装细胞,嘌呤霉素加压筛选出高病毒滴度(4.0×106CFU/ml)的细胞克隆,且未检测到辅助病毒。结论 本工作构建的融合表达载体pcDNA4/HisMaxA-gag-pol及其在NIH3T3细胞中的表达,构建成功具有靶向性的逆转录病毒包装细胞系,该细胞系能够包装出高滴度的逆转录病毒,为肝细胞的基因治疗提供了一种新的基因转移系统。     

PSP94-TNFαD11a融合基因在NIH3T3细胞中的表达及其产物活性分析

 为了分析 PSP94- TNFαD1 1 a融合基因的表达和表达产物的生物学活性 ,将含该融合基因的质粒 pc DNA- PSP94- TNFα D1 1 a转染 NIH3T3细胞 ,72 h后收集细胞培养上清 ,并提取细胞总RNA,经 RT- PCR,得到与目的基因长度相符合的 c DNA片段 ;以 PSP94c DNA为探针 ,对 RT-PCR产物进行 Southern印迹分析 .结果表明 :转染 PSP94- TNFαD1 1 a融合基因的 NIH3T3细胞 ,其 RT- PCR产物杂交信号为阳性 .细胞培养上清用 TNF抗体行 Western印迹和 ELISA分析 ,检测结果为阳性 .生物学活性分析表明 ,细胞培养上清不仅具有 PSP94抑制人前列腺癌细胞 PC- 3生长的活性 ,而且显示出 TNFα对 L92 9细胞的细胞毒作用 .以上结果表明 ,pc DNA- PSP94- TNFαD1 1 a质粒能够正确表达目的基因 PSP94- TNFα D1 1 a,且表达的 PSP94- TNFαD1 1 a融合蛋白具有预期的双重生物学活性 .     

人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达

以He1a细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3．1（-）重组质粒亚克隆,将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系,G418筛选稳定转染细胞株．经核苷酸序列测序和酶切鉴定,成功构建了pcDNA3．1（-）-sTNFR1真核表达质粒,脂质体法建立了高效表达sTNFRI的稳定转染细胞系,并经RT—PCR和Western Blotting鉴定．人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达,为今后的研究打下了基础．     

Rhox5基因真核表达质粒的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的:构建同源异性框基因Rhox5的真核表达质粒,转染NIH3T3细胞,建立稳定过表达Rhox5的细胞系。方法:PCR方法扩增Rhox5的全长cDNA序列,PCR产物双酶切后和人工合成的HA抗原表位标签共同克隆至pcDNA3.1(-)哺乳动物细胞表达载体中,构建pcDNA-Rhox5-HA融合表达质粒。脂质体法将经过测序成功的pcDNA-Rhox5-HA融合质粒和pcDNA3.1空载体分别转染NIH3T3细胞,潮霉素B筛选后建立阴性对照pcDNA3.1 in NIH3T3和稳定过表达Rhox5的Rhox5-HA in NIH3T3细胞系。RT-PCR和western blotting方法检测Rhox5-HA在稳定转染细胞系中的表达情况。结果:成功构建了pcDNA-Rhox5-Myc重组质粒,获得稳定过表达Rhox5的NIH3T3细胞系。RT-PCR和Western blotting结果表明,构建的稳定细胞系中成功表达Rhox5-HA融合蛋白。结论:Rhox5基因真核表达质粒的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达为进一步体外研究Rhox5蛋白单独的功能及其与其他分子间功能性相互作用奠定了实验基础。     

重组人α降钙素基因相关肽的克隆与表达

通过PCR方法从人类基因组中扩增出编码hαCGRP的片段,将该片段定向克隆到pET-32a( )载体上,构建DET-hαCGRP重组质粒．转化E．coli JM109菌株,利用酶切和测序方法筛选后,经IPTG诱导再转化E.coli BL21trxB(DE3)pLysS菌株.SDS-PAGE和Western Blot分析表达产物,最后通过扩张蟾蜍肠系膜微循环血管实验来检测重组hαCGRP扩张血管的活性,结果表明,重组质粒含hαCGRP成熟肽编码基因序列(111bp),符合预想结果;表达出21kD的融合蛋白,且主要以可溶性形式存在,其粗提物具有扩张血管能力,重组hαCGRP的成功表达为下一步纯化及研制基因工程药物奠定了重要基础。     

胸腺素α_1 基因的克隆表达及其生物活性

 胸腺素α1(thymosinalpha 1 ,Tα1)作为一种免疫增强剂 ,临床用途广泛 .为大量制备Tα1,按大肠杆菌惯用密码子合成Tα1基因 ,克隆于质粒pUC1 9的EcoRⅠ和PstⅠ位点 .经测序证明序列正确后 ,串联为 4串体 (Tα1④ ) ,经再次测序确认后克隆入pThioHisA的EcoRⅠ和PstⅠ位点 .转化大肠杆菌T0P1 0 ,酶切鉴定正确后 ,经 1mmol LIPTG诱导 4h ,获得硫氧还蛋白与Tα1④的融合表达 ,用离子交换层析纯化融合蛋白 .溴化氰裂解融合蛋白 ,释放出Tα1单体 ,经离子交换色谱纯化出Tα1.采用3 H TdR参入法进行生物活性测定 ,证实融合蛋白和Tα1均具有刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力 .     

胸腺素α_1 基因的克隆表达及其生物活性

胸腺素α1(thymosinalpha 1 ,Tα1)作为一种免疫增强剂 ,临床用途广泛 .为大量制备Tα1,按大肠杆菌惯用密码子合成Tα1基因 ,克隆于质粒pUC1 9的EcoRⅠ和PstⅠ位点 .经测序证明序列正确后 ,串联为 4串体 (Tα1④ ) ,经再次测序确认后克隆入pThioHisA的EcoRⅠ和PstⅠ位点 .转化大肠杆菌T0P1 0 ,酶切鉴定正确后 ,经 1mmol LIPTG诱导 4h ,获得硫氧还蛋白与Tα1④的融合表达 ,用离子交换层析纯化融合蛋白 .溴化氰裂解融合蛋白 ,释放出Tα1单体 ,经离子交换色谱纯化出Tα1.采用3 H TdR参入法进行生物活性测定 ,证实融合蛋白和Tα1均具有刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力 .     

重组人蛋白激酶CK 2α亚基的原核表达、纯化与鉴定

将构建成功的人蛋白激酶 CK2 α亚基 c DNA的重组质粒 ,转化大肠杆菌 BL2 1 ( DE3) ,IPTG诱导后获特异高效表达 ,表达蛋白占菌体总蛋白的 30 % ,但大多数重组蛋白以不溶形式存在 .表达产物依次进行 DE- 5 2、P1 1磷酸纤维素和肝素 - Sepharose柱层析分离 ,最后从 30 9mg可溶性蛋白质中得到 6.1 mg纯化蛋白 . SDS- PAGE显示纯化的蛋白质为一分子量 4 2 k D的单一蛋白带 .Western- blot的结果证明 :纯化的表达产物与抗人 CK2α抗体可发生特异性免疫反应 . CK2α和β亚基等摩尔分子混合可组成有完全活性的全酶 .重组的 CK2全酶的性质和功能与该酶的已知特性一致 .这些结果证明重组蛋白是人蛋白激酶 CK2 α亚基     

血小板生成素基因在NIH/3T3细胞中的表达与调控

应用 Tet- On基因表达系统 ,调控血小板生成素 (TPO)基因在 NIH/3T3细胞中的表达时间与水平 .籍脂质体介导的基因转移方法 ,p Tet- On质粒转染 NIH/3T3细胞株 ,得到稳定细胞株NIH/3T3- Tet- On.p TRE/TPO与 p TK- Hyg质粒共转染 NIH/3T3- Tet- On细胞株 ,得到双稳定细胞株 NIH/3T3- Tet- On- TPO.在培养基中加入或不加强力霉素 ,RT- PCR、Western印迹及 ELISA法检测培养上清 TPO表达 .结果表明 ,当培养基中不加强力霉素时 ,TPO无明显表达 (0 .1 μg/L) ;当培养基中加入 2 mg/L强力霉素时 ,TPO表达明显增高 (1 0 .8μg/L) .TPO表达水平与强力霉素浓度有关 ,随强力霉素浓度增高 ,TPO表达增加 .TPO表达水平还与强力霉素作用时间有关 ,加入强力霉素 6 h后 ,TPO表达明显增加 (1 .2μg/L) ,随培养时间延长 ,TPO表达增加 ,2 4 h达到峰值(1 0 .8μg/L) ,而且这种诱导作用是可逆的 .为进一步进行 TPO基因表达调控的体内研究奠定基础 ,有望为 TPO基因治疗提供一条可控的安全途径     

鸡α干扰素基因的克隆与表达

通过对鸡α干扰素基因的克隆,获取一定纯度的干扰素蛋白.从NCBI上搜索出鸡α干扰素基因的序列,根据其成熟蛋白编码序列设计引物,通过PCR从家鸡肝脏基因组中扩增出成熟鸡α干扰素的编码基因,利用基因重组技术构建出pUcm-T/IFN-α,再亚克隆至载体质粒pET-43.1a( ),构建出pET-43.1a( )/IFN-α重组质粒,经酶切鉴定、DNA测序,证明重组质粒构建正确.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行发酵,IPTG诱导表达后进行纯化及SDS-PAGE分析.工程菌诱导表达后的电泳图谱在相对分子量约19kDa的位置出现明显目的条带,约占菌体总蛋白的30%,表达产物主要以包涵体形式存在,经过NI2 -NTA亲和层析纯化,SDS-PAGE电泳后经凝胶扫描纯度达95%以上.获得了纯度较高的目的蛋白,为下一步对鸡α干扰素进行复性及活性研究奠定了基础.     

人工合成的植物化猪α乳清蛋白基因在转基因拟兰芥的表达

将一个398bp的植物化的猪α乳清蛋白基因(Lactalbumin,LA)编码区克隆到带有花椰菜花叶病毒的35S启动子的质粒中。对它们进行PCR检测和序列分析,证实这些阳性克隆是实验预期的重组质粒。随即将35S启动子-α-乳清蛋白基因-终止子这一表达单元克隆到双元载体pCG-CB中,用该重组质粒双元载体pCG-CB-Lact转化农杆菌V3101后,以农杆菌法进行拟兰芥植物转化,用除草剂Finale对转化植物进行抗除草剂基因筛选,得到一些抗除草剂的转化植株。对这些抗除草剂植株进行猪α乳清蛋白基因PCR分析,成功筛选到带有猪α乳清蛋白基因并且可以在后代稳定遗传的转基因植物。Western blot蛋白质表达分析,表明猪α乳清蛋白在拟兰芥中成功表达,并且猪仅乳清蛋白被正确加工成天然蛋白。     

人α降钙素基因相关肽与肿瘤坏死因子的融合表达

用半酶和半化学合成的方法合成和克隆了人ａ降钙素基因相关肽基因,将该基因融合在肿瘤坏死因子之后插入表达载体ｐＳＢ－９２中,使融合基因的５＇端直接置于大肠杆菌ＰＬ启动下游,采用３０℃培养,４２℃诱导,使ＴＮＦ与ＣＧＲＰ融合蛋白在大肠杆菌中获得了表达,表达的融合蛋白既有ＣＧＲＰ的结合活性（酶标检测为阳性）又有ＴＮＦ的生理功能（对Ｌ－９２９细胞的细胞毒活性）。表达菌裂解液走ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳,显示     

T7启动子作用下抗人TNF-α单链抗体的表达

基因工程技术构建的抗人TNF-α单链抗体克隆入表达载体pET15b-Etag中,在T7启动子的作用下,经0.1 mmol/L IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,其表达量占菌体总蛋白的38%.表达产物大部分以包涵体形式存在,而一小部分以有活性的可溶性形式出现于细菌的外周质中.这部分可溶性的表达产物占菌体总蛋白的6%,经双抗体夹心法和斑点印迹分析表明它具有抗原结合活性.     

3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建和表达

目的 实现3α-羟类固醇脱氢酶基因在大肠埃希菌中的高可溶性表达.方法 从土壤中分离睾丸酮丛毛单胞菌,提取其基因组DNA,PCR扩增3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)基因,将它克隆到原核表达载体上进行诱导表达.提取细菌总蛋白进行SDS-PAGE分析并测定酶活性.结果 经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了重组质粒,IPTG诱导表达后,获得融合蛋白,SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子量约为29kDa,与预期理论值一致;酶活性测定结果表明菌体可溶性总蛋白HSD酶比活性为142.81 U/mg,是对照BL21的12.97倍.结论 该研究成功地构建了3α-羟类固醇脱氢酶基因高效原核表达系统,为利用基因工程手段大量制备3α-HSD的工作奠定了基础.     

高表达人cyclin G2基因的SGC-7901细胞克隆筛选和鉴定

应用脂质体基因转染技术建立稳定表达cyclin G2基因的胃癌克隆细胞,为深入研究cyclin G2在胃癌细胞周期调控的作用和机制提供理想的生物学模型.构建以新霉素基因作为筛选标志基因的包含人cyclin G2基因真核重组表达载体pIRES-G2,大量扩增纯化后经限制性内切酶BamH I/BstXI双酶切鉴定;利用阳离子脂质体介导的基因转染法将其和对照空载体pIRESneo转染人胃癌细胞SGC-7901,经G418选择性培养基筛选后有限稀释法连续克隆化,免疫细胞化学染色检测cyclin G2蛋白表达情况.酶切结果表明cyclin G2cDNA已成功插入pIRESneo的多克隆位点内;经G418筛选后在转染pIRES-G2和转染pIRESneo组均见多个细胞克隆出现,细胞化学染色证实pIRES-G2转染组cyclin G2蛋白的表达水平明显高于pIRESneo转染组;经过多次有限稀释获得稳定高表达cyclin G2的细胞克隆.应用脂质体转基因技术成功建立高表达cyclin G2基因的人胃癌细胞克隆.     

真鲷肿瘤坏死因子α（（TNFα）cDNA的克隆与表达

采用同源克隆和末端快速扩增 (RACE)的方法 ,从真鲷中克隆到 12 6 4bp的TNFα全cDNA编码序列 (Gen Bank登录号为AY314 0 10 )。该序列包括 6 6 6bp可读框 (ORF) ,85bp的 5′末端非编码区 (UTR)以及 5 14bp的 3′末端非编码区。序列的 3′UTR含 5个mRNA不稳定模体 (motif)和 3个内毒素应答序列 ,但是未发现基因的PolyA加尾信号。由该序列推导的多肽含有明确的跨膜域 ,TNF家族的标签序列 (signature) ,TNF2家族分布 (profile)文件 ,粘多糖结合位点和细胞粘附位点。进化分析显示 ,真鲷TNF与哺乳类TNFα和TNFβ具有较高的相似性 ,源于共同的祖先。但结构及表达分析表明 ,它是TNFα而不是TNFβ。表达研究显示 ,真鲷TNFα存在组成型和诱导型两种表达形式 ,表现在刺激与非刺激的真鲷中 ,TNFα均可在部分组织中表达 ,但是在受刺激鱼体中基因表达的组织分布显著增多。     

大黄鱼HIF-1α基因的克隆鉴定与表达分析

为研究低氧诱导因子1α(Hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)在鱼类免疫应答中的作用,研究克隆得到了大黄鱼(Larimichthys crocea)HIF-1α基因(LcHIF-1α)的cDNA序列,其开放阅读框全长2256个核苷酸,编码一个751个氨基酸的蛋白。通过氨基酸序列比对发现, LcHIF-1α蛋白具有5个典型的功能结构域,包括1个helix-loophelix(HLH)结构域, 2个PAS结构域, 1个DNA结合结构域(HIF-1)和1个羧基端反式激活结构域(HIF-1a_CTAD)。系统进化分析显示, LcHIF-1α和其他硬骨鱼类HIF-1α聚成一支,与两栖类、鸟类和哺乳类HIF-1α的亲缘关系相对较远。序列分析结果表明, LcHIF-1α具有保守的特征结构域,预示着其功能可能与哺乳动物HIF-1α类似。荧光定量PCR结果显示, LcHIF-1α在所检测的健康大黄鱼各个组织中都有表达,在溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染后,大黄鱼脾脏和头肾组织中的LcHIF-1α表达水平显著上调,达到峰值时分别...