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相似文献
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1.
为研究人白细胞介素 18(hIL 18)结构与功能的关系 ,用PCR定点突变技术分别构建了N末端、C末端缺失突变体(ΔNC)和IL 1特征样序列突变体S154A/Y156F/E157P/C163 T (S)。将突变体cDNA与原核表达载体 pJW 2重组并转化大肠杆菌DH5α ,经热诱导表达蛋白质 ,SDS PAGE证实表达的目的蛋白质以包涵体形式存在。菌体经超声破碎后 ,包涵体以 2mol/L尿素洗涤 ,8mol/L尿素溶解 ,并经SephadexG 75柱纯化 ,纯度可达 95 %以上。突变体蛋白质经逐步稀释复性后 ,以诱导人外周血单个核细胞 (PBMC)产生干扰素 γ(IFN γ)及对核因子 κB(NF κB)的激活能力为指标 ,检测突变体的生物学活性。结果显示ΔNC、S这 2个突变体对IFN γ的诱生能力显著低于野生型hIL 18,分别为野生型hIL 18的 13%和 4 8%。同时 ,ΔNC、S对NF κB的激活能力也低于野生型hIL 18,分别为野生型hIL 18的 6 9.7%和 89.8%。这些结果表明缺失的片段或突变的位点对hIL 18的功能有重要的作用。  相似文献   

2.
人白细胞介素18的基因克隆与表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
人白细胞介素是新近发现的细胞因子之一。研究表明它参与T1辅助细胞介导的细胞免疫,利用RT-PCR技术从人外周血细胞扩增得到了IL-18的cDNA并测定其核酸序列。利用基因生组技术构建IL-18的表达载体,并在大肠杆菌中进行了表达。  相似文献   

3.
为探讨人白细胞介素-29(h IL-29)变异体的抗肿瘤活性,根据h IL-29成熟肽的生物信息学分析数据,采用大引物PCR方法对其肽链第33位赖氨酸、35位精氨酸的编码基因进行定点突变,获得的h IL-29变异体基因构建重组真核表达质粒转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115进行发酵表达,经纯化得到重组人白细胞介素-29变异体蛋白(rh IL-29mut33,35)。经CCK-8法检测抗肿瘤细胞增殖的数据显示,rh IL-29mut33,35对肝癌细胞BEL7402、结肠癌细胞HCT8和胃癌细胞SGC7901的增殖均具有抑制作用,高剂量组对这3种肿瘤细胞的增殖抑制率分别为(30.99±1.58)%、(22.47±1.37)%和(32.05±2.02)%,而且抗增殖作用比野生型rh IL-29的更强(P0.01),表明变异体rh IL-29mut33,35具有潜在的医药开发价值。  相似文献   

4.
人白细胞介素18(IL-18)是新近发现的细胞因子之一.研究表明它参与T1辅助细胞介导的细胞免疫.利用RT-PCR技术从人外周血细胞扩增得到了IL-18的cDNA并测定其核酸序列.利用基因重组技术构建IL-18的表达载体,并在大肠杆菌中进行了表达.这为以后进一步研究IL-18的功能奠定了基础.  相似文献   

5.
用寡核苷酸诱导的基因定位突变法,将人白细胞介素-2C末端两亲性a螺旋中125位和127位基分别或同时突变为Pro,并测定其生物活性和空间结构。结果发现所得突变体的生物学活性均急下降,同时a螺旋含量以及C端螺旋中残基的空间位置也发生了不同程度的变化。结果提示,C端a螺旋尤其是其疏水面的完整性对维持白介素-2的生物活性有重要作用。  相似文献   

6.
白细胞介素 18(IL - 18)是新近发现的细胞因子 ,具有诱导 IFN-γ的产生 ,促进 T细胞的增殖 ,促进 Th1细胞的发育和增殖 ,增强 NK细胞及 Th1细胞的细胞毒性 ,增强粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子 (GM- CSF)的产生 ,抗肿瘤效应 ,抑制 Ig E的生成以及破骨细胞的形成等多种生物学活性和作用  相似文献   

7.
8.
白细胞介素18   总被引:6,自引:1,他引:6  
白细胞介素-18(IL-18)是新发现的细胞因子,具有多种生物学功能.IL-18能促进外周血单个核细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)、IL-2、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等细胞因子,增强天然杀伤细胞(NK细胞)的细胞毒作用.IL-18结构上与IL-1相似,而功能更接近IL-12,IL-18与IL-12均能诱导Th1细胞产生IFN-γ,存在协同效应,但它们的作用途径不同.IL-18在抗感染抗肿瘤等方面有着潜在的应用前景,并与自身免疫性疾病的发病密切相关.  相似文献   

9.
用基因定点突变法研究了白细胞介素-2(IL-2)中某些氨基酸对生物活性的影响。将IL-2中39Met和43Lys分别改为Pro,企图破坏此处α螺旋,突变体的CD图谱和生物活性均,不变,说明此处可能原来就不存在α螺旋.而将52Glu.53Leu,54Lys分别改为Pro后,CD谱发生了变化,生物活性也显著下降。表明这些氨基酸处在α螺旋中,将它们改为Pro后,影响了IL-2的结构,并导致活性下降  相似文献   

10.
为研究人白细胞介素18(hIL-18)中一些氨基酸残基对IL-18功能的影响,用重叠延伸PCR定点诱变技术构建hIL-18突变体hIL-18D^126N、hIL-18D^130K、hIL-18D^134K。将突变体cDNA与原核表达载体pJW2重组并转化大肠杆菌DH5α。经热诱导表达,3个突变体占菌体总蛋白质的15%-31%以上。SDS-PAGE证实,表达的蛋白质以包含体形式存在。包含体经超声破坏,2mol/L尿素洗涤,8mol/L尿素溶解,Sephadex G-75柱纯化后,纯度均可达95%以上。Western印迹表明3个突变体与野生型hIL-8具有相同的免疫原性。纯化的突变体蛋白质经复性后,以诱导人外周血单个核细胞(PBMC)产生于干扰素(IFN-γ)的能力为指标检测其活性,结果显示3个突变体的生物学活性分别为野生型IL-18的32%、8%、10%,表明hIL-18中126、130、134位的天冬氨酸(Asp)对其功能是必需的。  相似文献   

11.
为了发展基因突变技术,介绍一种新型的基因定点突变方法.该方法巧妙利用了基因序列中广泛存在的不完整的平端酶切位点.与传统方法相比,可以迅速地在全基因的任何部位替换核苷酸,并可以在突变实验过程中直接将目的基因克隆到T载体上,便于测序及进一步克隆.利用该方法成功地获得了DdsA(decaprenyl diphosphate synthase,十聚异戊二烯焦磷酸合成酶)在4个氨基酸位点上的19个变体酶.这些位点分布在基因的不同区域内.证明这种新方法的高效性.  相似文献   

12.
不同免疫缺陷病毒(HIV-1,HIV-2和SIV)的Tat均有3个高度保守的结构域:Cys富集域、核心域和碱性氨基酸富集域,用PCR定点突变法在HIV-1Tat蛋白的这些区域引入单氨基酸或多氨基酸突变;构建了以HIV-1LTR-158到+8O区域为启动子,含有不同突变点的突变Tat基因表达质粒;以荧光酶基因为报告基因,瞬时共转染Jurkat细胞:分析不同氨基酸突变对Tat的反式激活作用的影响。结果发现,突变后的Tat蛋白的活性均极大地降低或丧失,表明这些序列内的氨基酸的确定性对Tat的活性至关重要。  相似文献   

13.
NisinZ的定点突变及突变体性质的研究   总被引:4,自引:0,他引:4  
以本实验室构建的含nisZ基因的质粒pHJ2 0 1为模板 ,采用定点突变技术将乳链菌肽Z分子中B环第 8位Thr突变为Ser(T8S)、将第 2位Dhb突变为Dha和第 31位His突变为Lys(T2S H31K)以及将第 2 7位Asn突变为Lys和第 31位His突变为Lys(N2 7K H31K) ,以pMG36e为载体 ,电击转化乳酸乳球菌 (L .lactis)NZ980 0进行表达。对表达产物性质的研究结果表明 ,3个突变体的抑菌谱和溶解度未发生变化 ,其抑菌活性略有下降 ,但它们的稳定性表现各不相同 :N2 7K H31K的稳定性与NisinZ几乎一致 ,而T8S和T2S H31K的稳定性有明显提高 ,在pH9条件下10 0℃加热 5min仍不丧失抑菌活性。  相似文献   

14.
模拟分析发现血红蛋白两条α珠蛋白链上 99位的 Lys突变为 Cys后 ,它们之间可以形成二硫键 ,两条β珠蛋白链上 82位的 Lys突变为 Cys后可以增加血红蛋白四聚体间氢键的作用 ,分别起到稳定四聚体的作用 .利用寡核苷酸介导的定点突变技术将α99、β82 位的 Lys突变为 Cys.将突变后的血红蛋白插入 p BV2 2 0载体 ,在大肠杆菌中获得了高效表达 ,其表达产物达细菌总蛋白的2 0 %左右 ,并经 Western印迹证实  相似文献   

15.
在对Anabaena sp.PCC7120藻胆体核亚基ApcD结合色素PCB的体内重组中,发现色素蛋白在提纯前后最大吸收峰和荧光峰发生了红移,从提纯前的605nm及633nm变为提纯后的650nm及665nm.为了研究该现象的原因,构建了ApcD的8个突变体,重组结果显示:突变体ApcD(Y88I)色素蛋白在提纯后的吸收光谱和荧光光谱较提纯前均多出一个峰,分别为668nm,690nm;ApcD(W59Q)、ApcD(Y73A)、ApcD(W87E)色素蛋白在提纯前后的吸收光谱和荧光光谱一致;ApcD(M126S)、ApcD(Y116S)、ApcD(M160T)色素蛋白在提纯前后的吸收光谱一致,而提纯后的荧光峰位置较提纯前分别红移了5nm、7nm和10nm;ApcD(M115I)色素蛋白在提纯前后的吸收光谱和荧光光谱均发生了红移,从提纯前的605nm和633nm变为提纯后的638nm和655nm.这些色素蛋白在酸性尿素溶液变性条件下的最大吸收峰始终在662nm,表明辅基色素仍然是藻蓝胆素;在对PCB-ApcD、PCB-ApcD(Y116S)及PCB-ApcD(M160T)的圆二色谱分析发现,该两个氨基酸的突变均...  相似文献   

16.
近年来利用定点突变技术研究苏云金杆菌(Bacillus thuringiesis,Bt)杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins,ICP)作用机制已取得良好进展.杀虫晶体蛋白不同结构域上氨基酸残基的突变将影响其稳定性,与受体的结合,不可逆的昆虫中肠膜插入及离子通道活性的强弱等.突变研究表明,结构域Ⅰ参与不可逆结合及插入昆虫中肠膜过程;结构域Ⅱ参与受体结合,包括初始结合与不可逆结合;结构域Ⅲ在杀虫特异性和维持三维结构的稳定性方面起重要作用,同时,可能参与离子通道的形成,受体结合和插入昆虫中肠膜过程.利用各种定点突变技术对各位点进行突变可以研究单一位点的功能,到目前为止,已有很多关于这方面的研究,并且筛选到了毒力提高的工程菌株.  相似文献   

17.
RGD为存在于许多糖蛋白配体中的氨基酸序列,对整合素具有识别作用.此序列也发现于许多蛇毒去整合素分子中.采用基因克隆技术从大连产白眉蝮蛇的毒腺中克隆出的去整合素adinbitor是含73个氨基酸残基的去整合素,分子中含有12个半胱氨酸和RGD模体.实验证明,adinbitor作为去整合素的新成员,具有典型的抗ADP诱导的人血小板聚集作用和抗肿瘤血管新生作用.为了将adinbitor的这2种功能分开,采用PCR基因定点突变的方法,将其cDNA序列中RGD模体改变成KGD.重组adinbitor(KGD)在E.coli BL21得到表达,并通过His•Bind亲和层析予以纯化.实验发现,adinbitor对ADP诱导的人血小板聚集具有明显抑制作用,其IC50=85 nmol/L,明显优于adinbitor(RGD) (IC50=150 nmol/L).然而,与adinbitor(KGD)相比,adinbitor(KGD)则丧失了对血管生成的抑制作用.结果说明,adinbitor(KGD)可作为专一的抗人血小板聚集药具有潜在的开发前景.  相似文献   

18.
目的:改进重叠延伸PCR法,实现一种引入DNA定点突变的准确简便方法。方法:通过应用不同的扩增酶和反应体系,以重叠延伸PCR的方法产生引入突变位点的DNA片断,然后再亚克隆到载体中。该文以人cyclin D1启动子的NF-κB位点(-39/-30)为例。结果:通过DNA测序证明定点突变成功引入。一次引入4个突变碱基。突变引入率为100%。  相似文献   

19.
基因突变对生命的进化具有重要意义,针对质粒的DNA定点诱变技术也是基因工程、蛋白质工程研究中的重要手段之一。为了提高质粒定点诱变的效率,本研究利用引物部分重叠的设计方案,使用Tm值相对固定的引物设计模式,将同一引物分为重叠区(Tm=50±2℃)和非重叠区(Tm=60±2℃),并在严格控制模板用量(2 pg/kb)的基础上,通过20个PCR循环对目标质粒进行定点诱变扩增,随后取0.5 μL产物直接用于转化。在FastPfu Fly酶系中,利用此法构建了6个含碱基替换、缺失和插入的质粒,均获得成功,突变效率可达96%以上,阳性克隆获得数达70个以上。此外,利用4种不同PCR酶系对该法的适用性进行了评价,结果表明突变效率均可达93%以上,阳性克隆获得数均在10个以上。通过适当增加PCR模板用量(10 pg/kb)并使用纯化后的PCR产物进行转化,该法可适用于转化效率大于106(cfu/μg)的任意感受态细胞,对应的突变效率可大于91%,阳性克隆获得数大于20。根据本法的作用原理,该方案适合质粒中10~20 bp(因重叠区GC含量及碱基序列的不同而改变)以内的任意碱基替换和插入,以及任意长度的DNA片段缺失。且具有通用性强、耗时少、诱变成功率高、成本低、对感受态及转化效率无特殊要求等优点,适合各实验室的日常研究使用。  相似文献   

20.
吴毓  赵宝昌  王继红  赵鹏  吴妍宁  崔秀云 《遗传》2005,27(2):249-254
人胎盘核糖核酸酶抑制因子(HRI)是一种存在于细胞浆中的50 kDa的酸性蛋白质,富含亮氨酸和半胱氨酸。作为胞浆蛋白可保护细胞不受外来的胰RNase的侵袭。HRI有32个半胱氨酸残基,且多数半胱氨酸残基是成对的并在序列上相连。文章用丙氨酸同时取代cys328/cys329,并将此双突变的HRI的cDNA片段构建于质粒pPIC9K,电击转化入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,进行分泌型表达。对表达产物进行亲和层析纯化及抗氧化活性检测。实验结果表明,双点突变后的HRI对RNase A的亲和力几乎没有影响,但其抗氧化能力却增加7~9倍。此种抗氧化能力的提高可能是因为在cys328-cys329之间不能形成二硫键而稳定了HRI的三维结构所致。  相似文献   

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