合成苏氨酸的研究（Ⅴ）—DL—别苏氨酸的光学拆分

研究了用优先结晶法对ＤＬ－别苏氨酸进行光学活性拆分的问题，在相图基础上选取适当的过饱和度，即配制成原始拆分母液。作为品种，既可用光活性别苏氨酸，也可用光活性苏氨酸。可用对映的一对光活性晶种，还介绍用单一晶种的拆分方法，提出了Ｌ－别苏氨酸 Ｌ－苏氨酸，Ｄ－别苏氨酸与Ｄ－苏氨酸为“胶着对”Ｌ－别苏氨酸与Ｄ－苏氨酸，Ｌ－别苏氨酸与Ｄ－苏氨酸为“离散对”的观点。     

合成苏氨酸的研究（V）─DL－别苏氨酸的光学拆分

研究了用优先结晶法对ＤＬ－别苏氨酸进行光学活性拆分的问题,在相图基础上选取适当的过饱和度,即配制成原始拆分母液。作为晶种,既可用光活性别苏氨酸,也可用光活性苏氨酸,可用对映的一对光活性晶种,还介绍用单一晶种的拆分方法,提出了Ｌ－别苏氨酸与Ｌ－苏氨酸、Ｄ－别苏氨酸与Ｄ－苏氨酸为“胶着对”,Ｌ－别苏氨酸与Ｄ－苏氨酸,Ｌ－别苏氨酸与Ｄ－苏氨酸为“离散对”的观点。     

溶氧对L-苏氨酸发酵的影响

探索溶氧对L-苏氨酸发酵过程的影响及其控制方法。通过摇瓶装液量试验、不同溶氧控制方式考察发酵过程中溶氧对L-苏氨酸合成的影响。采用补料分批发酵工艺发酵L-苏氨酸,利用氨基酸分析仪测定发酵液中L-苏氨酸的产量,通过10L罐补料分批发酵36h,产酸可达118.9g/L,糖酸转化率为47.6%。可以得出溶氧对L-苏氨酸生物合成有重要影响,并建立了最佳溶氧控制条件。     

乳糖发酵短杆菌L－氨酸产生菌的选育

从谷氨酸产生菌Brevibacterium lactofermentum XQ5121出发选育L-苏氨酸产生菌。以硫酸二乙酯(Des)和甲基磺酸乙酯(Ems)诱变处理,用α-氨基-β-羟基戊酸(Ahv)和s－(2－氨基乙基)－L－半胱氨酸(Aec)药物平板及琥珀酸培养基(Sam)平板定向筛选,最后获得一株L－苏氨酸高产菌Zt－1株(AHV^г AEC^г SAM^g),可在适宜的培养条件下积累16mg／m1 L－苏氨酸。试验结果表明,在以琥珀酸为唯一碳源的平板培养基(sAM)上生长迅速即sAM 变异可导致L－苏氨酸积累大幅度提高。 文中对B.lactofermentum L-苏氨酸产生菌的选育机理作了讨论。     

苏氨酸溶解度等实况性质的观察

本文主要针对正常生产中苏氨酸在水中和发酵液中的溶解度进行了实测,以期对苏氨酸产品在一定条件下简单溶解特性进行了解,对该产品的浓缩结晶提取产生指导意义。     

天冬氨酸家族主要氨基酸高产菌株的选育策略

L-苏氨酸与L-赖氨酸是L-天冬氨酸家族氨基酸(AFAAs)中的重要成员,近年来由于其在食品、化妆品、动物饲料添加剂等方面的广泛应用而备受关注,市场需求逐年上升。运用代谢工程手段构建高产菌,可有效地提高L-苏氨酸和L-赖氨酸的生产水平。本文详述了L-苏氨酸与L-赖氨酸的合成途径、调控机制以及两种氨基酸高产菌株的构建策略。     

大肠杆菌TdcC、SstT和LIV-1系统缺失对胞外L-苏氨酸积累的影响

【目的】比较分析苏氨酸吸收系统TdcC、SstT和LIV-1缺失对大肠杆菌吸收和积累胞外苏氨酸的影响。【方法】从菌株E.coli W3110出发,敲除tdcC、sst T和liv J基因,构建Tdc C、SstT和LIV-1系统单缺失和多缺失菌株,将过量表达苏氨酸操纵子基因的重组质粒pKKthr AC1034TBC分别转入原始菌和重组菌,考察各菌株吸收和积累胞外苏氨酸的能力。【结果】敲除tdc C和sst T基因的重组菌T04的苏氨酸吸收能力比原始菌W3110降低了43.28%,T04(pKKthr AC1034TBC)胞外苏氨酸积累量最高达到1.09 g/L,比对照菌W3110(pKKthr AC1034TBC)高出172.5%。敲除tdcC、sstT和livJ基因的重组菌T07的苏氨酸吸收能力比T04降低了12.97%,然而T07(pKKthr AC1034TBC)胞外苏氨酸积累量最大为0.63 g/L,与T04(pKKthr AC1034TBC)相比降低了42.2%。【结论】阻断Tdc C和Sst T系统,能有效降低大肠杆菌吸收苏氨酸的能力,提高苏氨酸的胞外积累量。阻断LIV-1系统,虽然能减少大肠杆菌对苏氨酸的吸收,却不利于菌株积累胞外苏氨酸。     

紫外线诱变原生质体选育苏氨酸高产菌株

以黄色短杆菌T6-13的苏氨酸产生菌GSR8-25为出发菌株,利用溶菌酶制备其原生质体后进行紫外线(UV)诱变处理,从再生株中筛选出苏氨酸高产菌株。经多次连续诱变处理得到一苏氨酸高产菌株25-20,在含10%葡萄糖的培养基中摇瓶发酵60小时可积累苏氨酸19.5mg/ml。分离纯化后得菌株25-202,其苏氨酸产量可达21.5mg/ml,比出发菌株提高43.3%。     

受体丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶

近几年证实有几种受体具有丝氨酸／苏氨酸激酶活性,它们都为单一的跨膜蛋白,胞外部位较小,胞内含有公认的丝氨酸／苏氨酸激酶的共同序列,为一类新发现的受体型激酶,TGF－β受体I,II型为典型的受体丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,它们在传递胞外信息时可能要比受体酷氨酸激酶复杂,需要几种受体共同作用才能完成。     

一种简单准确的L-苏氨酸测定方法

通过研究建立了发酵液中L-苏氨酸定性和定量测定的"纸层析-Rf值法"和"纸层析-色斑洗脱比色法",并对该方法的应用条件进行了研究。研究结果表明,该法对测定L-苏氨酸含量具有较高的准确度和精密度。而且该法操作简单、易于掌握,非常适合在L-苏氨酸产生菌筛选中应用。     

含苏氨酸操纵子重组质粒的构建及其对大肠杆菌L-苏氨酸积累的影响

摘要：【目的】通过分子生物学手段构建重组质粒,将其转入野生型大肠杆菌W3110,分析含苏氨酸操纵子基因的质粒及质粒定点突变解除反馈抑制时,对L-苏氨酸积累的影响。【方法】以W3110染色体DNA为模板,PCR扩增苏氨酸操纵子基因,即启动子THrLp、编码前导肽基因thrL以及thrA、thrB、thrC基因,通过重叠延伸PCR的方法对thrA基因定点突变,解除苏氨酸对它的反馈抑制,构建出重组表达质粒WYE112和WYE134,5 L发酵实验测定L-苏氨酸的产量。【结果】经5 L发酵罐发酵产酸实验,W3110的L-苏氨酸产量为0.036 ± 0.004 g/L,携带含苏氨酸操纵子质粒的W3110菌株L-苏氨酸产量为2.590 ± 0.115 g/L,质粒上thrA解除反馈抑制后,L-苏氨酸的产量增加到9.223 ± 1.279 g/L。【结论】过表达苏氨酸操纵子基因可以使L-苏氨酸积累,进一步解除thrA基因的反馈抑制,可以增强L-苏氨酸积累的效果,为L-苏氨酸工程菌改造的进一步研究奠定了基础。     

低能离子辐照苏氨酸的初步研究

本文报告了３０Ｋｅｖ低能氮离子辐照苏氨酸不同剂量下氨基残余率的变化,提出了定量解释离子注入苏氨酸的剂量效应关系的数学表达式。提出用辐射质量沉积产额定量描述低能离子辐照质量沉积的生物效应。将此概念应用到低能离子辐照苏氨酸的剂量效应关系的研究,结果表明辐射质量沉积效应不是低能离子辐照“马鞍型＂剂量效应关系曲线的主要原因     

合成苏氨酸的研究（Ⅳ）DL—苏氨酸的光学拆分

本文研究了用优先结晶法拆分ＤＬ－苏氨酸的有关问题,诸如（Ｌ－Ｔｈｒ＋Ｄ－Ｔｈｒ＋Ｈ２Ｏ）三元体系溶解度数据、”平液“及”贫液“拆分问题,拆分速度对晶种的依存、过饱和度的选择、连续拆分设想及间歇拆分示例等,为工业化过程提供了重要的实验依据。     

氮源对L-苏氨酸发酵的影响

以L-苏氨酸生产菌TRFC为供试菌株,研究了氮源对L-苏氨酸发酵的产量和糖酸转化率的影响。首先通过摇瓶实验确定发酵的最佳无机氮源和有机氮源分别为硫酸铵和酵母粉,进一步利用10L罐补料分批发酵确定硫酸铵和酵母粉的最佳用量,继续优化培养条件,采用发酵中后期流加硫酸铵和糖氨混合补料等措施,L-苏氨酸产量得到进一步的提高。在最优发酵条件下,通过10L罐补料分批发酵36h,产酸可达118.9g/L,糖酸转化率为47.6%。     

产L-苏氨酸重组大肠杆菌的构建和发酵性能

【背景】大肠杆菌由于生长性能优良、遗传背景清晰,常被用作苏氨酸生产菌。【目的】敲除大肠杆菌Escherichia coli THR苏氨酸合成途径的非必需基因,并异源表达苏氨酸合成必需的关键酶,构建一株苏氨酸高产菌株。【方法】利用FLP/FRT重组酶系统,敲除E. coli THR中lysC、pfkB和sstT,同时进行谷氨酸棒杆菌中lysC~(fbr)、thrE和丙酮丁醇梭菌中gapC的重组质粒构建并转化到宿主菌中。【结果】以E. coli THR为出发菌株,敲除其苏氨酸合成途径中表达天冬氨酸激酶Ⅲ (AKⅢ)的基因lysC、磷酸果糖激酶Ⅱ基因pfkB及苏氨酸吸收蛋白表达基因sstT,使菌株积累苏氨酸的产量达到75.64±0.35g/L,比出发菌株增加9.9%。随后异源表达谷氨酸棒杆菌中解除了反馈抑制的天冬氨酸激酶(lysC~(fbr))、苏氨酸分泌转运蛋白(thrE)及丙酮丁醇梭菌中由gapC编码的NADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶,获得重组菌株E. coli THR6菌株。该菌株积累苏氨酸的产量提高到105.3±0.5 g/L,糖酸转化率提高了43.20%,单位产酸能力提高到5.76 g/g DCW,最大生物量为18.26 g DCW/L。【结论】单独敲除某个基因或改造某个途径不能使苏氨酸大量合成和积累,对多个代谢途径共同改造是构建苏氨酸工程菌的最有效方法。     

苏氨酸醛缩酶的催化机理、分子改造及合成应用

苏氨酸醛缩酶催化醛和甘氨酸羟醛缩合,一步反应即可构建产物β-羟基-α-氨基酸的两个手性中心,从原子经济性和环境影响角度,是非常具有潜力的绿色合成光学纯β-羟基-α-氨基酸的方式之一。多个不同生物来源的苏氨酸醛缩酶得到分离和表征,较低的β-碳立体选择性以及反应过程中动力学和热力学控制难题,使其在合成应用中面临很大挑战。文中综述了近年来苏氨酸醛缩酶在基因挖掘、催化机理、高通量筛选与分子改造、合成应用等方面的研究进展,旨在为进一步研究提供参考。     

利用Red同源重组技术构建产L-苏氨酸的基因工程菌

利用Red重组技术构建不同基因突变的L-苏氨酸工程菌大肠杆菌ITHR,研究单敲除metA、ilvA和双敲除metA、ilvA基因后对L-苏氨酸积累的影响。应用质粒pKD46介导的Red同源重组系统,通过第一次同源重组将拟敲除基因替换为氯霉素抗性基因,再通过重组酶在FRT位点发生第二次同源重组,消除抗性基因,成功敲除了菌株ITHR体内苏氨酸合成的代谢旁路途径中的metA和ilvA基因,构建了三株不同的基因突变株。将携带苏氨酸操纵子的工程质粒pWYE065电转化入敲除不同基因的突变株中,构建基因工程菌。经5 L发酵罐发酵产酸实验,未敲除任何基因的菌株ITHR/pWYE065 L-苏氨酸的产量为5.55±0.51 g/L,metA基因单敲除菌株ITHR△metA/pWYE065 L-苏氨酸产量为9.77±1.83 g/L,ilvA基因单敲除菌株ITHR△ilvA/pWYE065 L-苏氨酸产量为8.65±1.42 g/L,同时敲除ilvA和metA基因的菌株ITHR△metA△ilvA/pWYE065 L-苏氨酸的产量增加到13.6±1.14 g/L。通过敲除L-苏氨酸的旁路代谢途径中的关键酶的基因,可以增强L 苏氨酸积累的效果,为L-苏氨酸工程菌的进一步改造奠定了基础。     

应用指示剂提高生长谱法测定发酵液中L—苏氨酸含量的准确性

在应用生长谱法测定发酵液中L—苏氨酸含量时,增强培养基上指示菌生长圈的清淅度,提高检测的准确性,是苏氨酸发酵上的一个重要方面。我们在测定培养基中添加一定量的溴甲酚紫,结晶紫或两者的混合物,生长圈清淅可见。在L—苏氨酸一定浓度范周内,生长圈的大小与L—苏氨酸的含量成线性关系。与传统纸层析测定法相比有更高的准确性。本文就添加指示剂的浓度、培养条件、指示菌浓度等因素进行了叙述。     

L-苏氨酸工业生产发酵条件优化研究

发酵法生产L-苏氨酸是目前广泛采用的方法,因此研究工业生产发酵条件优化具有重要意义。试验以高产L-苏氨酸菌作为出发菌株,结合本公司的实际工业生产条件对发酵各条件进行了一系列优化研究,结果表明：添加0.2%的工业级生长促进剂,以复合糖代替葡萄糖为初糖,并控制初糖浓度在60g/L,除生长高峰期外,发酵过程中溶解氧（DO）控制在10%~20%之间;最终发酵放罐湿菌体在45g/L左右,L-苏氨酸含量可达110g/L左右。     

大肠杆菌苏氨酸合成途径动力学模型的构建与分析

动力学模型分析有利于理解生物系统的调控机制,从而为高效细胞工厂的理性设计提供指导。基于以往发表的相关途径动力学模型和测量的酶动力学数据,开发了大肠杆菌苏氨酸合成途径的动力学模型。模型包含从天冬氨酸至苏氨酸的合成途径及葡萄糖开始的为合成途径提供前体以及能量的代谢途径。与以往模型不同的是新模型中考虑了能量和还原力的平衡,从而使模型模拟的系统自身成为一个不需要从外界提供能量和还原力的自洽系统。模型稳态分析的结果表明PTS、G6PDH和HDH等反应对苏氨酸合成反应的通量控制系数较大,通过过表达这些反应的酶可以有效增加苏氨酸合成反应的通量。