基因诱变、重组、克隆

、舀巧‘,‘...Jf护.口.曰口,今.二‘J舀函~....阅.侧尸‘J月..‘.924315用寡核普酸杂交检测非邻接短序列〔英〕/Borghesi一N ieoletti,C.…了BioTeehniques一1092-12(4)一凌74一475〔译自DBA,1992,11(11),92一06022〕 模型系统采用的寡核普酸互补于免疫球蛋白可变区基因3产侧翼保守性七聚体和九聚体序列的各区。单独的短核普酸(7 bp或gbP)不能作为杂交探针,但含有由电桥相连的两个保守序列的构建物能够杂交。通过降解碱基和保留七聚体与九聚体间的起始间隔物形成桥。这种桥连寡核普酸探针可用于Southern印迹和细菌基因文库筛选的杂交…     

动物遗传工程

923441利用PCR快速而生物学安全性地诊断非洲猪疽病毒〔英〕/Steiger,Y.…了J.Clin。Mierobiol。-1992,30(1)一i~s[译自DBA,1992,11 (5),92一02463〕 部分定序了非洲猪瘟病毒(ASFV)基因组保守区的740bp片段,设计并合成了4个PCR引物和1个寡核节酸DNA探针。利用寡核昔酸1和6为DNA引物、并利用来白下述样品的模板扩增了专性64obp PCR产物:受ASFV侵染的猪的器官和血浆;ASFV侵染的细胞培养物,含与原74obp克隆相同保守区的克隆的DNtA片段。对照无特殊反应产物。通过用巢状引物二次扩增或与专性生物素化寡核昔酸探针杂交确定PCR产…     

显微切割与显微克隆

显微切割与显微克隆邓汉湘（湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室）湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室,运用人工合成的寡核苦酸引物结合染色体的显微切割,在国际上率先建立了寡核音酸引物介导的人类高分辨染色体显微切割和显微基因克隆技术。至今,该室已建立了１...     

植物遗传工程

940738小南瓜花叶病毒外壳蛋白基因:克隆序列分析及其在烟草原生质体中1的表达〔英万Hu,J.S…了Areh.Virol一。1993,130(i一2)一17~31仁译白DBA,1993,12(19),93一11036〕 克隆了南瓜花叶就豆花叶病毒(SqMV)香瓜株系中间部分RNA的互补DNA。分离出SqMVmRNA,通过蔗糖梯度离心分级分离双链cDNA、用E。。Rl DNA一甲基化酶使之甲基化并将EcoRI-亲和性接头连到两侧末端。用EcoRI消化后,将。DNA克隆到质粒pUC18的EcoRI位点上。转化并筛选大肠杆菌DHS感受态细胞。设计了4种寡核普酸引物,用以在SqMV寡核昔酸序列和预测的多聚蛋白…     

密码子优化BTRCP-CypA融合基因的PCR合成

为了提高BTRCP-Cyp A融合基因的表达量,对基因密码子进行优化,主要是去除过多富含AT碱基以及提高GC含量。在此基础上提出一种用于基因合成的PCR法。拆分单链寡核首酸长度为59 nt左右,重叠区碱基数14~21 nt,Tm值为46~62℃。具体步骤如下:把拆分的寡核首酸组装成300~500 bp左右的中间片段,再将中间片段拼接成全长基因。结果表明利用该法法合成了BTRCP-Cyp A融合基因,并提高了表达量。因而改良的PCR法能经济、简便、高效地进行基因合成,具有良好的应用前景。     

基因工程

860001 以键合DNA和用作键合DNA的寡核昔酸使双链DNA片段产生一定交联的方法〔专,英〕/Koster,H.//PC T patent     

遗传学实验— 微生物实验

（十一） 大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选（一） （物理因素诱变）实验原理 在以微生物为材料的遗传学研究中，广泛应用营 养缺陷型。用某些物理因素或化学因素处理细菌，使 基因发生突变，丧失合成某一物质（如氨基酸，维生素， 核昔酸等）的能力，因而它们不能在基本培养基上生 长，必须补充某些物质才能生长。这样从野生型经诱 变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。筛选营养缺陷 型菌株必须经过如下几个步骤：诱变处理，淘汰野生 型、检出缺陷型、鉴定缺陷型。本实验选择紫外线作为 诱变剂，并用青霉素法淘汰野生型，采用逐个测定法检 出缺陷型，最后用生长谱法鉴定缺陷型。实验原理 在以微生物为材料的遗传学研究中，广泛应用营 养缺陷型。用某些物理因素或化学因素处理细菌，使 基因发生突变，丧失合成某一物质（如氨基酸，维生素， 核昔酸等）的能力，因而它们不能在基本培养基上生 长，必须补充某些物质才能生长。这样从野生型经诱 变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。筛选营养缺陷 型菌株必须经过如下几个步骤：诱变处理，淘汰野生 型、检出缺陷型、鉴定缺陷型。本实验选择紫外线作为 诱变剂，并用青霉素法淘汰野生型，采用逐个测定法检 出缺陷型，最后用生长谱法鉴定缺陷型。     

基因工程

通过熔解待测DNA,将24个碱基的寡核普酸引物与连有1.okb片段的单DNA序列退火,并用DNA聚合酶完成链延伸反应,来扩增1.Okb的DNA专一性探针片段。从理论上说,要增工00 000 000倍,需要重复此过程25次。扩增之后,将反应混合物转移到尼龙过滤器中,并用点印迹法与放射性标记的1.Okb片段杂交。用     

基因工程

核酸及蛋白质合成、提取、纯化931888ONA侧序反应纯化的固相方法〔英〕/Tong,X.…/Anal。Chem一1992,6魂(22)。一2672~2677〔译自DBA,1993,12(i),。3一00002〕 在酶促延伸反应中采用了5尸末端用吕:P标记、中间位置含生物素类的引物寡核昔酸,形成的产物与抗生蛋白链菌素包被的磁性珠拉结合。通过变性并洗涤珠粒除去模板链和其它反应污染物,通过在EDTA/甲酞胺混和物中加热,洗脱残留的纯单链片段。将珠粒固定于具固定磁铁的样品管之后,洗涤珠粒以除去各种污染物(如蛋白、盐类、模板DNA及未掺入或降解的三礴酸脱氧和双脱氧核昔。通过在9…     

化工上的应用

<正> 将马缨丹属叶状锻的干叶和茎压碎,在索格利特 (Soxhlet)装置上用石油提取8小时。将分离出的粗品三菇酸在硅胶柱和中性氧化铝上进行色谱分离,用薄层色谱法、气液色谱法、质子核磁共振等手段鉴定。在     

DNA分析与扩增

920044班射起动共振离子光谱法在ONA测序中的潜在应用[英〕/Arlinghaus,H.F.…尹Anal.Chem。一1991,63(5)一402~407〔译自DBA,1991,10(9),91一04828〕 采用溅射起动共振离子光谱(SIRIS)来检测亚原子摩尔量,经富含同位素的铁、锡标记的DNA,分辨率极好。合成了叛酸二茂铁和(三乙基甲锡烷基)一烷基数酸,并通过5‘己胺的一个氨基连接到寡核二阵酸的末端位置上。调整SIRIS方法,用来检测50pMol连于DNA上的Fe或Sn。在SIRIS中若用高重复率激光,而其它准备步骤不是限制因素,每天可能检测1千万个碱基。在聚丙烯酞胺和尼龙膜上分析铁、锡…     

一株微囊藻毒素降解辅助菌的分离和鉴定

以从太湖蓝藻中提取的微囊藻毒素作为微囊藻毒素降解菌的筛选物质, 通过稀释平板涂布法从腐烂的蓝藻中富集分离到一菌株, 经形态特征、生理生化特征和16S rDNA 序列分析将该菌株(GenBank 序列登录号为GQ143751)鉴定为藤黄微球菌(Micrococcus luteus); 微囊藻毒素降解实验结果表明该菌株几乎不能降解微囊藻毒素, 但可以明显促进一株微囊藻毒素降解菌微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)对微囊藻毒素的降解能力, 将筛选菌株与微嗜酸寡养单胞菌混合培养, 混合菌对微囊藻毒素的降解能力比微嗜酸寡养单胞菌单独培养时提高66.7%。     

核酸定量检测试验应用于HIV-1感染实验室诊断的探讨

目的:探讨核酸定量检测在HIV-1感染实验室诊断中的应用。方法:选取145例第四代抗原/抗体联合诊断筛查试验为阳性反应的血浆样本,分别用Western印迹和HIV-1核酸定量方法进行检测,综合对比分析2种方法检测结果。结果:Western印迹检出阳性样本120例,不确定样本17例,阴性样本8例;HIV-1核酸定量试验检出结果大于检测限样本131例,其中包括12例Western印迹不确定样本、2例Western印迹阴性样本;有3例Western印迹阳性样本用HIV-1核酸定量检测试验未能检出。结论:核酸定量检测试验对于HIV-1感染阳性样本是一种有效的实验室诊断方法;对HIV-1核酸定量检测结果为"TND"的样本,建议加做Western印迹或结合其他补充试验结果进行综合诊断。     

DNA分析与扩增

JJ,‘翻920422大片段定位缺失:缝合环聚合酶链反应〔英〕/5 ong,C.…/B ioteeh Forum Enr一1991,s(s)一130一132仁译自DBA,2991,10(12),91-06633〕 用缝合环聚合酶链式反应(PCPCR)在载体中的噬菌体T7启动子与菊花矮小类病毒(CSV)的cDNA序列之间制造缺失,这样,不含外源序列的CSV RNA即可通过T7的离体转录来合成。新方法应用超螺旋质粒pBCSU172作为PCR扩增模板,产生不含要删除区的线性DNA分子。采用与线性分子两端相配对的第三寡核昔酸来制备缝合环状DNA,并用于大肠、杆菌JM109的直接转化。用该法合成了与天然CSV序列一样…     

激素和活性多肽

924034生产并回收大肠杆菌融合蛋白形式的贡组人胰高血糖案仁英〕/Ishizaki,J.…厂ApPI.Miero-b 101.Bioteehnol一1992,36(4)一453~理8已[译自DBA,1992,11(10),92一05567〕 用14个寡核普酸构建了编码人胰高血糖素的人工基因,并连在GAA下游,形成102bP.具Pstl-BamHI末端的DNA片段。将此基因与编码4个氨基酸(Pro一Phe一Arg一Cys)的Sall一Pstl接头相连,并与较大的BamH工一Sall片段(来自质粒pAT一Trp huIFN一y/PSTI)连接。质粒pAT-T印五uIFN一州PSTI编码人卜干扰素末端135个氨基酸和5个接口氨基酸Lys一Se卜Leu一Val一AsP…     

体外培养和遗传育种

852368矮牵牛种间体细胞杂种叶绿体分离的分析〔会,英洲Kool,A.J.…了Plant Tis-sue Culture一1982,5 Meet一653~654[译自DBA,1984,3(16),54一07685) 将矮牵牛(Peru。‘a parodli)的叶肉原生质体与野生型矮牵牛(尸etunl’ah少brida)、矮牵牛(Perun‘a parviflora)的一种核白花突变体或矮牵牛(Petunia inflata)的一种细胞质白化苗突变体的悬浮培养细胞分离爵原生质体融合,产生体细胞杂种,从矮牵牛尸.parodl‘和尸.par。‘fl。。。的体细胞杂种的叶绿体DNA(CpDNA)用限制性内切酶Bgn酶切,酶切谱仅呈现出尸.Parod“叶绿体DNA的电泳图…     

不同固定方法对植物细胞扫描电镜观察用冷冻断裂样品的影响

用冷冻断裂法在扫描电镜下研究了洋葱(Allium cepa)根端分生组织细胞内部的三维结构。采用了两种固定方法。冷冻断裂前只用1％锇酸固定的材料容易在细胞质和核之间断开,而用卡诺固定液(无水乙醇:冰醋酸3:1)前固定,然后再用1％锇酸固定的材料容易使细胞核断裂。前一固定方法适于研究细胞质的内部结构(细胞骨架的纤维、线粒体、内质网等及其三维分布关系):后一固定方法适于研究核内结构(染色质、核仁、核基质纤维)的三维形象,特别是核仁纤维中心染色质的三维结构。     

体外培养和遗传育种

<正>用6个典型的水稻(Oryza sativa)品种:台北177和309,Giza 170,峰光,Ta-tsumi 糯和Mingolo研究了引起雄核发育的最佳培养条件和生理条件。在品种台北177,309,Giza 170上,具有单核中期到双核初期花粉的花药中,有50%接种30天后产生了愈伤组织,所有6个品种     

人精子膜蛋白片段在沙门氏菌中的表达——一种制备抗生育疫苗的途径(英文)

合成编码一种人精子膜蛋白YWK-Ⅱ胞外区的一段多肽片段的双链寡核昔酸链,HSD—2a。用平端连接的方法将其插入到沙门氏菌鞭毛基因fliC(d)的抗原表位IV高变区EcoRV位点,构建了重组质粒pLS408-H1。重组基因在鞭毛负性aroA基因缺失的无致病性沙门氏菌S.dublin SL5928疫苗菌株中表达。经ELISA、电镜免疫胶体金法检测,表明HSD-2a编码的多肽片段成功地在沙门氏菌鞭毛表面表达。融合鞭毛蛋白分子量约为60kD。Western-Blot法检测,提纯的融合鞭毛蛋白与YWK-Ⅱ小鼠抗血清只在60 kD处出现一条结合带。携带重组质粒pLS408—H1的沙门氏菌疫苗菌株极有可能成为抗生育疫苗。     

TaqMan探针荧光PCR检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7方法的建立

肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagie Escherichia coli,EHEC)O157:H7是一种重要的传染病病原菌,以EHEC O157:H7标准菌株rfbE保守区设计一对特异引物和一条探针,建立了检测EHEC O157:H7核酸的荧光定量PCR检测方法。实验结果表明荧光定量PCR检测方法特异性好,最低检测限为20 cfu/mL,线性范围是102～108cfu/mL。稳定性试验表明批内变异系数和批间变异系数分别为2.06%和2.45%。