高渗震动对杜氏盐藻细胞跨膜K+运输的影响

杜氏盐藻细胞吸收K 的Km为 2 .86mmol/L ,Vmax为 1 .39μmol/1 0 8cells .h。钒酸钠和DES、CCCP、Li 抑制藻细胞对K 的吸收。高渗震动促进藻细胞H 的分泌 ,降低K 的吸收速率 ,CCCP和Li 减弱了高渗震动对藻细胞K 吸收的抑制。高渗震动对藻细胞K 分泌有轻微的抑制作用。     

盐生杜氏藻质膜ATPase及其对高渗震动的反应

用水溶性多聚物 ( dextran T5 0 0 PEG 335 0 )两相法制备盐生杜氏藻细胞质膜 ,经检测质膜纯度较高 ,原位膜约占 78%。质膜 ATPase的动力学常数 Km 和 Vmax分别为0 5 8mmol L和 4 3 5 9μmol Pi ( mg protein· h) ;最适 p H值是 7 5。质膜 ATPase的活性随Mg Cl2 和 Ca Cl2 浓度的升高而增加 ,但较高浓度的 Mg Cl2 和 Ca Cl2 有轻微的抑制作用 ;KCl促进质膜 ATPase的活性 ,在 1 0 0 mmol L时达到最大 ,高于 1 0 0 mmol L时抑制效应显著。钒酸钠、DES、DCCD和 NEM明显地抑制质膜 ATPase的活性 ;而 Na N3、Na NO3、Na Mo O4和KCN对质膜 ATPase的活性影响不大。高渗震动刺激了质膜 ATPase的活性。     

杜氏盐藻细胞质膜氧化还原系统

杜氏盐藻细胞质膜具的氧化ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ,还原Ｆｅ（ＣＮ）＾３－６和Ｏ２的氧化还原系统。当Ｆｅ（ＣＮ）＾３－６浓度为０．６ｍｍｏｌ／Ｌ,氧化ＮＡＤＨ的Ｋｍ为９６μｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍａｘ为１５９ｎｍｏｌ１０＾－８ｃｅｌｌｓｍｉｎ＾－１,最适ｐＨ为８．５。ＴｒｉｔｏｎＸ－１００可促进ＮＡＤＨ和Ｆｅ（ＣＮ）＾３－６的氧化还原活性。ＮＡＤＨ能促进藻细胞的氧吸收,最适ｐＨ为８．５。在无外源电子供体存在时,细胞质     

甘油对杜氏盐藻电击转化的影响

通过在HEPES电击缓冲液中添加不同浓度的甘油,讨论了甘油对电转前细胞存活率的影响;通过在盐藻培养基中添加不同浓度的甘油,讨论了甘油对盐藻细胞生长的影响;使用含有不同浓度甘油的HEPES缓冲液介导质粒载体转入盐藻细胞,比较了甘油对于转化率的影响。实验结果表明,在电击缓冲液中添加0.5mol/L甘油能有效提高细胞存活率,促进转化细胞恢复生长,从而获得最佳转化效果。因此,0.5mol/L甘油可作为杜氏盐藻电击转化过程中一种良好的稳渗剂。     

红光和远红光处理引起的杜氏盐藻跨类囊体膜质子动力势变化

照射远红光后杜氏盐藻毫秒延迟发光快相强度明显增加,而红光处理结果则相反.低温条件明显抑制远红光引起的毫秒延迟发光快相强度的上升,而红光则仍能够有效地引起毫秒延迟发光快相强度的降低.加入消除跨类囊体膜质子梯度的尼日利亚菌素后,远红光不能引起延迟荧光强度的上升.与以前在高等植物中得到的结果相比,在杜氏盐藻中远红光处理后毫秒延迟发光快相强度增加的幅度更大,红光处理后没有出现毫秒延迟发光快相强度先增加后降低的现象.     

杜仲对铜胁迫后杜氏盐藻恢复速率的影响

本研究通过检测不同浓度的杜仲药液对铜胁迫下的盐藻细胞数和叶绿素含量,来探讨杜仲对铜胁迫后杜氏盐藻恢复速率的影响。结果表明,适当浓度的杜仲药液会加快盐藻的恢复速率,其中5mg/ml的药液作用最为明显。     

高浓度钾抑制杜氏盐藻生长的生理机制

在含１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的杜氏盐藻（Ｄｕｎａｌｉｅｌａｓａｌｉｎａ（Ｄｕｎａｌ）Ｔｅｏｄ．）培养液中加入５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上的ＫＣｌ可观察到Ｋ＋对杜氏盐藻生长有明显的抑制作用,而当ＫＣｌ达１００ｍｍｏｌ／Ｌ时,杜氏盐藻的生长被完全抑制。另一方面,当培养液中缺乏Ｋ＋时,杜氏盐藻的生长也被显著抑制。在正常培养条件下,伴随着杜氏盐藻的生长,培养液的ｐＨ由８左右升高至１０左右,而高浓度Ｋ＋则显著抑制杜氏盐藻培养液ｐＨ的升高;而在培养液ｐＨ为７．０至１０．０的范围内,不同ｐＨ对杜氏盐藻的生长无明显影响。将杜氏盐藻在高浓度Ｋ＋条件下预处理１２ｈ以上,杜氏盐藻的光合放氧速率显著下降,光合速率下降的程度与Ｋ＋浓度的高低和预处理的时间长短呈正相关。高浓度Ｋ＋处理也引起杜氏盐藻叶绿素含量的显著下降。对经高浓度Ｋ＋预处理的杜氏盐藻的光合放氧速率与培养液中ｐＨ变化同时进行测定的结果表明,Ｋ＋抑制杜氏盐藻光合速率的同时也显著抑制了光照条件引起的培养液ｐＨ的上升。实验结果表明,Ｋ＋抑制杜氏盐藻光合作用以及抑制杜氏盐藻生长与Ｋ＋影响跨盐藻质膜的质子运输之间可能存在一定关系。     

渗透震扰对杜氏盐藻细胞蛋白质磷酸化的影响

杜氏盐藻（Ｄｕｎａｌｉｅｌａｓａｌｉｎａ（Ｄｕｎａｌ）Ｔｅｏｄ．）细胞可溶性蛋白提取液中含有对Ｃａ２＋有一定依赖性的蛋白激酶。体内磷酸化实验进一步说明细胞质Ｃａ２＋浓度对蛋白磷酸化有影响。加入Ｃａ２＋和ＭｏＯ－４显著促进低渗震扰细胞蛋白质磷酸化,而高渗震扰细胞中蛋白磷酸化程度仍低于对照;在没有Ｃａ２＋和ＭｏＯ－４存在时,观察不到渗透震扰对蛋白磷酸化的刺激作用。低渗震扰信号的传导机制可能不同于高渗震扰信号,它很可能通过蛋白磷酸化进一步将信号放大,２４ｋＤ蛋白是杜氏盐藻细胞蛋白激酶最有潜力的作用底物。     

杜氏盐藻细胞质膜氧化还原系统

杜氏盐藻细胞质膜具有氧化ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、还原Ｆｅ（ＣＮ）和Ｏ２的氧化还原系统。当Ｆｅ（ＣＮ）浓度为０．６ｍｍｏｌ／Ｌ时,氧化ＮＡＤＨ的Ｋｍ为９６μｍｏｌ／Ｌ,Ｔｍａｘ为１５９ｎｍｏｌ１０－８ｃｅｌｌｓｍｉｎ－１,最适ｐＨ为８．５。ＴｒｉｔｏｎＸ－１００可促进ＮＡＤＨ和Ｆｅ（ＣＮ）的氧化还原活性。ＮＡＤＨ能促进藻细胞的氧吸收,最适ＰＨ为８．５。在无外源电子供体存在时,细胞质电子供体提供的电子使Ｆｅ（ＣＮ）还原。培养液ＰＨ影响正常呼吸链、交替氧化酶途径和质膜电子传递链的耗氧比例;当有外源ＮＡＤＨ存在时,ＳＨＡＭ明显促进细胞的氧吸收,并且质膜电子传递链的耗氧比例增加。     

盐生杜氏藻细胞光合特性的研究

研究了盐生杜氏藻细胞的光合特性获知：⑴在７００－３００ｎｍ波长范围,出现三个吸收峰,分别位于６８０．４８５和４００ｎｍ处;⑵测定了该藻细胞内ＡＴＰ／ＡＤＰ比值,钒酸钠处理可以提高ＡＴＰ／ＡＤＰ比值;⑶以培养液为反应介质,测出该藻细胞的光合放氧,钒酸钠抑制放氧速率;⑷用调制式荧光计测出该藻细胞的Ｆｏ,Ｆｍ以及经间隔饱和光脉冲引起的Ｆｍ,表明盐生杜氏藻具有正常的光系统结构;⑸该藻细胞可诱导可逆的光状态     

甘油代谢对杜氏盐藻盐耐受性的调节

杜氏盐藻是迄今发现的世界上最耐盐的单细胞真核生物,能在0.05 mol/L至饱和NaCl浓度下正常生长,因此其耐盐机制倍受人们关注。研究发现,杜氏盐藻盐耐受性与甘油代谢密切相关。为此,我们综述其耐盐机制、甘油代谢调控、甘油代谢与盐耐受性关联性、甘油代谢重要酶的分子生物学研究等进展,希望对深入研究植物耐盐机制、培育耐盐作物新品种及开发甘油等高附加值次生代谢产物等研究提供有益帮助。     

杜氏盐藻基因工程选择标记的研究

研究了杜氏盐藻对链霉素,卡那霉素,潮霉素,G418和氯霉素5种常用抗生素的敏感性。结果表明,经4周培养,盐灌对链霉素,卡那霉素,潮霉素和G418不敏感,浓度高达600ug/ml时,也不能抑制盐藻生长,对氯霉素很敏感,60ug/ml即可完全抑制固体和液体培养中盐藻的生长,氯霉素合作为盐藻基因工程的筛选抗生素,CAT基因在其阳性筛选标记基因。     

丁草胺对杜氏盐藻生理生化的影响

采用室内模拟培养试验方法,研究了酰胺类除草剂丁草胺对杜氏盐藻(Dunaliella salina)生长和生理生化的影响。结果表明,低浓度的丁草胺对杜氏盐藻生长速率有促进作用,而高浓度的丁草胺对杜氏盐藻生长速率有显著的抑制作用,且随着浓度的加大,杜氏盐藻生长速率逐渐降低。丁草胺对杜氏盐藻藻细胞的光合色素含量、可溶性蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性等也有影响。     

盐生杜氏藻对盐度改变的生理响应

以盐生杜氏藻为实验材料,采用f/2培养基,设置了8个盐度(15、20、25、30、50、70、90、110)处理,分盐度改变前(A)和盐度改变后(B)两个实验阶段,研究了盐生杜氏藻在不同盐度处理下的生长情况,测定了藻液的OD值、叶绿素a、β-胡萝卜素、可溶性蛋白质和可溶性糖含量等指标。结果表明,A阶段,几个较低盐度(15、20、25和30)处理生长状况较好,其中又以盐度20的处理最好;余下的处理,盐度越高,其生长所受的影响越大。B阶段,盐生杜氏藻的生长进入平台期后,50、70、90、110几个盐度较高处理的细胞密度、叶绿素a、β-胡萝卜素含量均显著超过了作为对照的盐度20的处理。且B阶段末期,先前盐度15的处理蛋白质、糖的积累量,与A阶段末期相比都有了不同程度的增加,而其余盐度处理组的蛋白质、糖含量则分别产生了不同程度的下降。     

静态荧光光谱法研究杜氏盐藻的生长规律

测量了杜氏盐藻不同生长期的静态荧光光谱,得出了杜氏盐藻生长规律曲线。通过与传统的分光光度计法和血球计数板法研究盐藻生长规律的比较发现,该方法反映的是活盐藻细胞浓度的变化情况,更能反映盐藻实际生长规律;不仅操作简便,灵敏度高,而且可以实现远距离非接触测量。     

高浓度钾对杜氏盐藻叶绿体超微结构的影响

在观察到高浓度K 对杜氏盐藻 (DunaliellasalinaTeod .)生长有显著抑制现象 ,以及初步证明高浓度钾通过抑制杜氏盐藻的光合作用而抑制其生长的基础上 ,探讨了高浓度K 对杜氏盐藻叶绿体超微结构的可能影响。电镜观察表明 ,培养液中加入 10 0mmol/LKCl使叶绿体膨胀 ,类囊体膨大并解体 ,叶绿体中同时大量形成及积累淀粉粒。高pH对盐藻叶绿体超微结构有类似影响。高钾引起的叶绿体超微结构的改变及叶绿体中淀粉粒的积累可能是高K 抑制盐藻光合作用及生长的原因之一。     

杜氏盐藻电击转化方法的系统优化

本研究系统分析了盐藻生长状态、电击条件、电击缓冲液成分和质粒浓度等条件对电击转化效率的影响。实验结果表明:正常接种后培养7d对数生长中期的盐藻细胞,在25μF、0.8kV的电击条件下加入终浓度为10μg/mL的质粒可使盐藻电击转化效率达到1.85‰;电击缓冲液中加入0.4mol/L的甘油可使转化效率显著提高至2.03‰(P<0.05)。在上述优化电击体系下,运用3种不同质粒分别转化盐藻细胞后获得的转化效率无显著差异。通过对电击转化中相关因素的优化,本研究建立了一种适用于杜氏盐藻的高效稳定的电击转化体系,为杜氏盐藻的转基因研究提供有效方法。     

杜氏盐藻质膜ATPase在渗透调节中的可能作用

杜氏盐藻是一种以甘油为渗透调节物质的单细胞海藻,能够在0.08～5.0mol/L NaGl的培养液中生长。当外界NaGl浓度从0.5mol/L上升到4.0mol/L时,藻细胞内的Na~+和K~+含量变化不大,甘油含量则从6.20Pg/cell上升到51.50pg/cell。当藻细胞承受2.0mol/L到3.0mol/L NaCl的高渗胁迫时,能通过增加细胞内甘油含量来恢复原有形态;同时,藻细胞的H~+分泌增加,ATP含量下降;20μmol/L Na_3VO_4抑制了这些变化。KGN处理虽降低藻细胞内的ATP含量,却增加K~+外流和Na~+内渗。     

杜氏盐藻促生菌株的分离与鉴定

拟通过探究藻际微生物对微藻生长及代谢产物积累的影响,筛选出促进微藻生长的促生菌株。以杜氏盐藻(Dunaliella salina)Ds-SXYC-2为试材,分离鉴定盐藻藻际环境中的共生菌株,进一步构建藻菌(1∶1)共培养体系、测试盐藻生长及代谢产物积累等表型。结果显示,从杜氏盐藻藻际环境分离获得5株共生菌株,经16S rDNA分子鉴定,属于3个菌属。菌株B1与B2为涅斯捷连科氏菌(Nesterenkonia),菌株B3与B4为盐单胞菌(Halomonas),菌株B5为海杆菌(Marinobacter)。5株共生菌株对杜氏盐藻的生长均有促进作用,菌株B3能显著促进杜氏盐藻生长及代谢产物的积累。共培养15 d后,杜氏盐藻生物量达到2.3 g/L,比对照组增加了28.9%,叶绿素a的含量达到4.61 mg/L,比对照组增加了36.3%,β-胡萝卜素比对照组提高了56.4%。盐藻多糖、蛋白质、总脂含量分别比对照组增加了34.8%、71.2%和37.6%。菌株B3盐单胞菌可以作为促进杜氏盐藻生长及代谢产物累积的优势菌株,进一步构建共培养体系可应用于杜氏盐藻的商业生产。     

杜氏盐藻的耐盐机制研究进展和基因工程研究的展望

概述了杜氏盐藻 (Dunaliellasalina)的耐盐机制和基因工程的研究进展。盐藻的耐盐机制十分复杂 ,短时间内通过细胞体积的改变来调节渗透压平衡 ,之后通过甘油的合成与转化恢复细胞正常形态和大小。渗透调节过程中 ,还涉及到蛋白质的合成。cDNA文库和基因组文库已经建立 ;几种基因已被克隆 ,如碳酸酐酶基因和硝酸还原酶基因等 ;GUS(β_葡糖苷酸酶 )基因已成功地转入盐藻细胞内。另外 ,对盐藻的基因工程作了简单的展望