两种传代细胞系对轮状病毒D36株(P[4]G2)敏感性的比较

目的探讨轮状病毒D36株在MDCK细胞和Vero细胞上培养的适应性,确定其培养的最佳细胞基质及培养条件。方法将D36株以MOI 1.0按不同培养瓶分组接种MDCK细胞和Vero细胞,补充含有不同浓度胰酶的维持液,于不同时间观察两种细胞病变的情况,同时抽样检测病毒滴度,分析两种细胞对D36株的敏感性。结果D36株病毒感染MDCK细胞后第6天病毒滴度达到最高,为(5.00～5.50)lgCCID50/mL;而D36株病毒感染Vero细胞后病毒滴度于第8天达高峰,为(4.50～4.75)lgCCID50/mL。另外,在两种细胞维持液中加入约0.8μg/mL的胰酶均可提高病毒滴度。结论两种细胞系在同等条件下感染D36株病毒后,MDCK细胞比Vero细胞出现病变的时间早,每一批MDCK细胞培养物病毒滴度高于同批次试验的Vero细胞培养物。     

鳜鱼病毒病原及细胞感染特性的研究

在患暴发流行性发病鳜鱼的脾、肾、肝、鳃组织细胞的超薄切片中观察到直径为120-150 nm的二十面体病毒粒子,其截面呈六角形,有囊膜.将病鱼内脏与10倍体积的PBS缓冲液制成组织匀浆液,过滤除菌后感染对数生长期的草鱼肾细胞.结果表明,该感染液在28 ℃条件下,培养36-48 h,生长旺盛的草鱼肾细胞开始出现CPE,5-7 d感染的单层细胞逐渐脱落死亡.该细胞病毒悬液具有感染性,可持续稳定地进行传代培养.感染细胞的病毒培养液,经差异离心纯化,负染制片,电镜下观察到大量的病毒粒子,对照培养物中未发现任何病毒颗粒.     

用15L转瓶大规模生产腮腺炎疫苗的研究

细胞与病毒同时接种于33℃培养5天,其病毒滴度平均为6.25 LogCCID50/ml,但细胞成片后再感染,其病毒滴度平均为4.85 LogCCID50/ml.在鸡胚细胞感染2.3×10-3病毒剂量时,滴度可达≥6.5 LogCCID50/ml,病毒高峰期于100小时和120小时分二次收获,其滴度分别达到6.0和≥6.5 LogCCID50/ml.每瓶产疫苗量4500ml和9000ml,病毒滴度没有影响.液体疫苗于2～8℃保存14天,滴度由5.75降至4.75 LogCCID50/ml,而将疫苗保存在-18℃至18周,其滴度由6.38缓慢下降至5.0 logCCID50/ml.     

轮状病毒LH9株在Vero细胞中的培养条件优化研究

为优化轮状病毒株在Vero细胞上的培养条件,将轮状病毒基因重配株LH9按0.1MOI分别接种于不同规格的细胞培养瓶(100ml、2000ml、3L、15L)。病毒接种采用吸附与未吸附两种方式、病毒收获采取低温冻融后离心与直接离心两种方法,观察分析对病毒滴度的影响。实验中,用CASY细胞计数仪分析活细胞率,病毒接种后逐日观察细胞病变(CPE)并取样,采用细胞半数感染量测定病毒滴度。结果表明,使用不同规格细胞培养瓶经吸附法培养接种、低温破碎法收获的LH9株病毒滴度高,其中以15L立瓶培养滴度最高(6.0～7.0 logCCID50/ml)。     

发热伴血小板减少综合征病毒在不同环境条件下的稳定性研究

为评估发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)在环境中的稳定性，本研究比较分析了实验室制备的SFTSV在不同介质表面的稳定性以及温度、自然通风干燥和常用酒精消毒剂等因素对其生存能力的影响。不同时间点收获的病毒样本，通过接种于Vero细胞中传代培养、空斑试验和实时荧光定量RT-PCR等方法测定病毒的感染性、滴度和复制培养过程中的动态变化。结果显示，在室温(约25℃)自然通风干燥条件下，不同介质表面的SFTSV感染性快速下降，在硬币、塑料等介质表面的病毒感染性可维持24 h，但病毒感染性滴度24 h内显著下降分别约10^4.46倍和10^4.6倍，在无纺布和纸张表面的病毒感染性滴度在6 h内就下降分别约10^3.82倍和10^4.12倍。如果将SFTSV置于密闭湿润环境中，病毒感染性可维持长时间的稳定性，24 h病毒感染性滴度下降不明显，1周内下降约10^1.49倍，在3周时仍可通过细胞培养...     

转瓶培养与生物反应器微载体培养乙脑病毒的比较

分别用15L转瓶与15L生物反应器微载体(2.5g/L CytodexⅢ)系统培养Vero细胞并接种乙型脑炎病毒(简称乙脑病毒)。转瓶培养Vero细胞7~8d,细胞数最高能达到8×108;当单层细胞长至3.0~4.5×108时接种乙脑病毒,病毒滴度能达到6.5~6.98 lg PFU/ml,并能够连续收获4~5次;采用微载体系统培养Vero细胞,细胞密度最高能达到170×108;当单层细胞长至60~70×108时接种乙脑病毒,病毒滴度能达到7~7.5 lg PFU/ml,并能够连续收获13~15次。两种方式培养的乙脑病毒收获液分别经灭活、浓缩、柱层析纯化后制备Vero细胞乙脑纯化疫苗,各项检定指标均符合《中国药典》的相关要求。     

麻疹疫苗生产用毒株沪191增殖的动力学研究

通过延长麻疹病毒生产中感染的基质细胞培养时间并连续收获病毒,获得麻疹病毒生产的动力学曲线;通过工艺放大阶段的病毒增殖动力学研究,提高麻疹病毒产量。采用直接接种和间接接种法,接种不同感染量(MOI)的病毒,将转瓶培养单次收获改为转瓶培养多次收获,滴定整个培养期间每次收获液的病毒滴度,观察感染的细胞培养维持状况并计算病毒产量。结果表明,直接接种病毒培养期为20~25d,共收获病毒14~17次;间接接种病毒培养期24d,共收获病毒29次。通过延长感染细胞培养时间和连续收获病毒,获得病毒繁殖的动力学曲线。通过麻疹毒株的增殖动力学研究获得了麻疹疫苗生产毒株沪191增殖动力学相关参数。     

轮状病毒LLR株培养条件的优化

目的为提高轮状病毒滴度,对病毒培养过程中的关键因素如感染复数(multiplicity of infection, MOI)、胰蛋白酶浓度及维持液pH进行优化,为口服轮状病毒活疫苗生产提供数据依据。方法将轮状病毒LLR株分别以MOI 0.005、0.01、0.02、0.04和0.08接种牛肾细胞后收获病毒;以MOI 0.02接种牛肾细胞,分别加入含1、2、3、4、5和7μg/mL胰蛋白酶的MEM培养液后收获病毒;以MOI 0.02接种牛肾细胞,分别加入pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0及8.5的MEM培养液后收获病毒。分别在24、48、72及96 h取样,检测病毒滴度。结果以MOI 0.02接种牛肾细胞后滴度最高,为7.5 lgCCID_(50)/mL;当维持液中胰蛋白酶质量浓度为4μg/mL时滴度最高,为7.2 lgCCID_(50)/mL;当pH为6.5及7.0时滴度最高,均为7.5 lgCCID_(50)/mL。结论通过对牛肾细胞培养轮状病毒关键条件的优化,获得了提高病毒滴度的有效方法,为口服轮状病毒活疫苗生产过程控制提供数据依据。     

Raji细胞培养中HSV持续感染模型的建立及免疫因素(TNF IFNs)对它的影响

本文观察HSV持续感染Raji细胞培养物150天。发现整个感染过程似呵分为两个阶段:急性期(前30天)和稳定期(30天以后)。在急性期上清液中HSV滴度达10~(6.2)TCID_(50)/ml.病毒抗原阳性细胞达21％,死细胞达42％;在稳定期病毒和细胞处于相对平衡状态,上清液中IISV滴度在10~(3.5-4.2)TCID_(50)/ml,病毒抗原阳性细胞约占5—10％,感染细胞与对照细胞在生长特性上无明显差异。用rIFNs、rlL-2和TNF处理稳定期的细胞培养物,发现TNF和rlFNa能明显抑制HSV的复制,rIENy作用较弱,去除上述因子5天后又恢复到处理前水平。rlL-2无明显作用。用HSV抗体处理上述细胞培养物上清液中病毒和病毒抗原阳性细胞都消失,且在去除抗体后连续观察50天仍未出现。本实验为体外研究HSV持续感染提供了一个有用的模型。     

细胞工厂在轮状病毒基因重配株LD9培养中的应用初探

为了探索用细胞工厂代替转瓶培养轮状病毒基因重配株LD9及收获高滴度的LD9病毒原液和提高产量的可行性,分别在2层4、层细胞工厂和3L1、5L转瓶培养Vero细胞,比较两种容器内细胞的生长状态。结果显示,以相同活细胞数2.5×104/ml同时接种两种不同培养容器时,细胞工厂培养3d已长成单层,而转瓶培养需5d;对两种容器长满单层时的细胞经胰酶消化后通过细胞仪计数、分析,结果显示,两种容器培养细胞长成单层时的单位面积细胞密度相当;对长成致密单层细胞的两种容器以相同的MOI(MOI=0.1)接种LD9病毒,转瓶培养的病毒于第8d病毒滴度达到高峰,为6.0～6.5 lgCCID50/ml;细胞工厂第5d病毒滴度达高峰,为6.5 lgCCID50/ml,并于第9d病毒滴度再次达到峰值,为6.0～6.5 lgCCID50/ml,实现二次收获病毒。     

鳜鱼病毒病原及细胞感染特性的研究

在患暴发流行性发病鳜鱼的脾、肾、肝、鳃组织细胞的超薄切片中观察直径为１２０－１５０ｎｍ的二十面体病毒粒子,其截面呈六角形,有囊膜。将病鱼内脏及１０倍体积的ＰＢＳ缓冲液制成组织匀浆液,过滤除菌后感染对数生长期的草鱼肾细胞。结果表明,该感染液在２８℃条件下,培养３６－４８ｈ,生长旺盛的草鱼肾细胞开始出现ＣＰＥ,５－７ｄ感染的单层细胞逐渐脱落死亡。该细胞病毒悬液具有感染性,可持续稳定地进行传代培养。感染     

不同亚型甲型流感病毒在单个核细胞内复制情况研究

目的研究不同亚型的甲型流感病毒在单个核细胞内的复制情况,探讨其免疫应答机制。方法①细胞培养:复苏A549、MDCK细胞后,用DMEM培养液常规培养;外周血分离得到单个核细胞,用RPMI1640常规培养;②空斑形成试验:用空斑试验检测病毒A/Shantou/169/2006(H1N1)和A/Shantou/602/2006(H3N2)的病毒原始滴度;检测流感病毒感染单个核细胞后的病毒滴度变化。结果流感病毒感染单核细胞后,上清液的病毒滴度下降,36、48、72 h病毒滴度<10 PFU/mL;而其细胞裂解液病毒滴度上升,滴度由9.5×10~4 PFU/mL上升至1.63×10~5 PFU/mL。流感病毒感染淋巴细胞,其细胞上清和裂解液病毒滴度均下降,其中上清液H3N2病毒滴度在48、72 h均<10 PFU/mL;裂解液病毒滴度则由4.8×10~5 PFU/mL下降至1.8×10~3 PFU/mL。结论不同亚型的甲型流感病毒在单核细胞和淋巴细胞中的复制存在差异。单核细胞可以吞噬流感病毒但不能直接灭活流感病毒,而淋巴细胞却可以直接抑制流感病毒的复制。     

孕中期巨细胞病毒宫内感染与血Free-β-HCG水平的相关性研究

目的:通过检测孕中期妇女人巨细胞病毒(HCMV)活动性感染、宫内感染以及血Free-β-HCG水平,分析血Free-β-HCG水平与HCMV宫内感染的相关性,初步探讨其可能影响机制.方法:通过酶免法测孕妇血HCMV-IgM和定荧光定量PCR对孕中期妇女血清和羊水中HCMV-DNA的检测以及DILFIA法(时间分辨免疫荧光法)定量检测孕中期妊娠妇女血Free-β-HCG的含量,研究HCMV感染状况与Free-β-HCG之间的相关性,探讨HCMV对母血Free-β-HCG水平的影响.结果:718例样本中共检出HCMV-IgM阳性和(或)HCMV-DNA阳性者共43例并进一步行产前诊断羊水HCMV-DNA阳性14例.孕中期HCMV活动性感染率为5.98％,HCMV宫内感染率为2.22％.孕中期感染组Free-β-HCG含量:7.32± 2.25 ng/ml,非感染组:8.47± 3.17 ng/ml,对照组:10.10± 3.67 ng/ml.结论:HCMV宫内感染组比非感染组孕中期外周血Free-β-hcG的测定水平降低,两者结果之间的差异具有统计学意义.HCMV可通过损伤胎盘绒毛滋养层细胞,使Free-β-hcG的分泌减少.     

草鱼出血病病毒的生长特性及高滴价培养

草鱼出血病病毒感染鱼肾(Clk)单层细胞后,产生明显的细胞病变,其繁殖周期为2—3天。病毒增殖的上升期在感染后的12—48小时。28℃下,当感染复数(Multiplicityof Infection简称MOI)为0.05PFU/cell时,病毒滴价可达1.78×10~(11)PFU/ml,不同温度(25℃、28℃、30℃)下通气培养,测定病毒滴价略有差异。感染病毒的细胞培养液经ELISA检测和电子显微镜观察均为阳性结果,并且能感染健康草鱼。     

感染HCMV的U251干细胞裸鼠大脑移植瘤模型的建立

研究人巨细胞病毒(HCMV)感染的U251干细胞(GSC_S)裸鼠颅内成瘤情况。用单克隆培养法从U251细胞系中分离出GSC_S,采用流式细胞仪检测分离出的GSC_S中CD133的表达,感染HCMV病毒,制备细胞密度为1×10~7个/mL的GSC_S悬液。取20只SPF级BALB/c裸鼠腹部麻醉,固定在立体定位仪上,在裸鼠颅脑钻一小孔,将3μL干细胞悬液缓慢接种于裸鼠颅内,随机分为HCMV感染组和未感染HCMV组。观察HCMV对肿瘤生长及裸鼠存活情况,处死濒死裸鼠取脑组织做免疫组化检测HCMV感染组胶质瘤内IE蛋白是否持续表达及HCMV感染对胶质瘤干细胞分化为血管的影响。结果显示,经单克隆法分选出的GSC_S在无血清培养基中成球生长;经流式细胞仪检测,分离出的GSC_S中CD133比例为98.00%;裸鼠脑内出现膨胀性生长的肿瘤;HCMV感染组肿瘤组织中检测到IE高表达,HCMV感染可促进CD133阳性胶质瘤干细胞分化为CD34阳性血管内皮细胞。以上结果表明,HCMV的IE蛋白能在通过此方法建立的HCMV阳性移植瘤中持续表达,且HCMV能促进GSC_S分化为血管内皮细胞。     

LLR株口服轮状病毒活疫苗在制品稳定性观察

对LLR株口服轮状病毒活疫苗生产中各阶段产物(在制品)放置于-20℃、2～8℃,进行稳定性观察,用细胞微量病变滴定法(CCID50)结合酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其病毒感染滴度。结果显示,LLR株口服轮状病毒活疫苗单一收获物-20℃放置18个月,病毒滴度不低于5.50logCCID50/ml,原液-20℃放置18个月,病毒滴度不低于5.50logCCID50/ml。2～8℃存放49d,疫苗原液的病毒滴度不低于5.75logCCID50/ml,疫苗半成品病毒滴度不低于5.50logCCID50/ml。结果表明,LLR株口服轮状病毒活疫苗生产各阶段产物在-20℃及2～8℃存放,其稳定性良好。     

间接酶联免疫吸附试验快速检测无毒唐菖蒲试管苗

本文利用间接酶联免疫吸附试验检测了从北京地区栽种的唐菖蒲上分离到的一株病毒的提纯制品和唐菖蒲试管苗的病叶粗提液。用提纯的病毒免疫家兔,抗血清的滴度为1：62500。提纯病毒的最适包被浓度为2．5μg/ml。能检测提纯病毒的最低浓度为4ng／ml。侵染性试验检测提纯病毒的最低浓度为30Ⅱg／mI。在间接酶联免疫吸附试验中,该病毒与烟草花叶病毒普通株有血清学相关性。     

流行性出血热病毒在长爪沙鼠肺肾原代细胞中增殖

将来源于黑线姬鼠肺,褐家鼠肺和流行性出血热(EHF)病人血液的三株 EHF 病毒,在长爪沙鼠肺、肾细胞中传代培养。接种后第一代就能很好增殖,滴度可达10~(6·0-6·5)TCID50/ml。随着传代次数的增加,病毒增殖速度加快,第三代在接种后2天即可检出感染细胞,4—8天有50%左右的细胞感染。经传九代未见明显的细胞病变。病毒增殖的高峰在接种后9天左右。维持液中有牛血清,冻融和超声波处理能提高病毒滴度。不同温度(33℃和37℃)和 pH(含5%和3%CO_2)培养对病毒增殖无明显影响。经传代的感染细胞仍能与 EHFV 单克隆抗体起反应,并排除ⅠⅡⅢ面型呼肠孤病毒的感染。     

四株草鱼呼肠孤病毒毒株的细胞感染特性比较研究

本文首次对低温保存的三株草鱼呼肠孤病毒GCRV873、GCRV875、GCRV876与新分离的GCRV991毒株进行了细胞培养与病毒感染特性等比较研究.结果表明,GCRV873、GCRV875、GCRV876在-30℃保存10年后仍然具有一定的感染性,其滴度均在102TCID50/mL以上,略低于从病鱼组织分离的GCRV991毒株的滴价.经传代培养后,四株GCRV的毒力逐渐升高,并趋于稳定;当感染复数(MOI)为0.05PFU/cell时,测定四株GCRV的滴度均高于108 TCID50/mL,但略有差异.GCRV873的滴度最高,可达到6.4×1011 TCID50/mL.连续传代的GCRV毒株在不同温度(28℃、31℃、34℃、37℃、41℃)条件下,均可感染CIK细胞;在28℃时,感染效价最高,随着温度的升高,其感染效价逐渐降低.     

G418对IL—2基因包装细胞的筛选

本文用高浓度的G418(800μg/ml)和低浓度的G418(200μg/ml)对包装细胞PLXSN/IL-2/PA317细胞进行40天的选择筛选培养,使其细胞呈稳定状态生长时,收集上清液转染NIH/3T3细胞,进行病毒滴度测定。试图在高选择标记的情况下筛选出高表达目的基因的包装细胞。实验结果表明:高、低浓度的G418对PLXSN/IL-2/PA317包装细胞的选择作用相同,即包装细胞的病毒滴度同选择标记物浓度无关。提示可用低浓度的G418来维持包装细胞的生命。