粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)木糖发酵的研究

研究了不同通氧条件和培养基初始pH等对粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)AS3．1602木糖发酵的影响。结果表明,粗糙脉孢菌具有较强的发酵木糖产生乙醇及木糖醇的能力。通气量对木糖发酵有较大的影响。乙醇发酵适合在半好氧条件下进行,此时乙醇的转化率达到63．2％。木糖醇发酵适合在微好氧的条件下进行,转化率达到31．8％。木糖醇是在培养基中乙醇达到一定浓度后才开始积累。培养基的初始pH对木糖发酵产物有较大的影响,乙醇产生最适pH5．0,木糖醇产生最适pH4．0。在培养基pH为碱性条件时,木糖发酵受到很大的抑制。初始木糖浓度对产物乙醇及木糖醇的产率有很大的影响。葡萄糖的存在会抑制木糖的利用,对乙醇和木糖醇的产生也有很大的影响。     

氧限制下粗糙脉孢菌乙醇发酵的数学模型及过程模拟

粗糙脉孢菌(Mzcrospora crassan)具有直接转化植物纤维性物质生产乙醇的能力。研究了不同氧限制条件对粗糙脉孢菌发酵葡萄糖生产乙醇的影响,构建了该过程的数学模型,并利用数学模型进行了模拟和预测研究。结果表明,数学模型能够很好地预测氧限制条件下乙醇的发酵过程,即使微量氧对乙醇发酵也有较大的负面影响。     

粗糙脉孢菌纤维素酶液体发酵优良形态突变体筛选

丝状真菌被广泛地用于包括纤维素酶在内的工业酶生产过程。在液体深层发酵中,丝状真菌菌丝形态直接影响发酵液的流变特性,进而与目标酶蛋白产量存在着重要的关联。目前,针对丝状真菌工业酶液体发酵菌丝形态的研究依然是从传统的发酵工程学角度出发,对与发酵水平紧密相关的形态、粘度等性状相关基因的认识远远不够。为了挖掘深层发酵中对丝状真菌发酵产酶性能具有重要影响的形态发育相关基因,以粗糙脉孢菌Neurospora crassa单基因突变体库中的95株形态突变株为研究对象,在结晶纤维素为碳源的条件下进行筛选,探寻与野生型菌株蛋白产量有显著差异的突变株。同时,对这些突变株的内切-β-1,4-葡聚糖酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活、发酵液粘度和菌丝干重进行了测定,并观察了发酵液中突变株的菌丝形态。实验结果表明,与野生型菌株相比,突变株SZY32、SZY35、SZY39和SZY43发酵液中蛋白浓度显著降低,突变株SZY11、SZY63、SZY69和SZY87发酵液中蛋白浓度显著性提高。值得注意的是,突变株SZY11和SZY43发酵液菌丝体主要形态为菌球状,其发酵液粘度分别降低75%和50%,突变株SZY87在发酵液中呈长丝状,发酵液粘度显著升高至少2倍。这些与产酶水平相关的形态、粘度基因的获得将有助于丝状真菌纤维素酶等工业酶高产工程菌株的理性构建。     

粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)纤维素酶液体发酵培养基的优化

粗糙脉孢菌是天然纤维素降解真菌,具有产纤维素酶能力,国内外对其纤维素降解机理和发酵产酶有一定的研究,但对其产酶的条件优化研究得不多,其产酶潜力需要进一步挖掘。以粗糙脉孢菌基因组测序菌株FGSC 2489为对象,采用响应面分析法对Neurospora crassa摇瓶发酵产纤维素酶进行培养基优化。采用Plackett-Burman(PB)实验设计考察发酵培养基中关键参数对产酶条件的影响,进而采用最陡爬坡实验逼近最大响应区域,并结合中心组合实验(central composite design,CCD)和响应面分析法对两个显著因素进行分析。PB实验结果显示:Peptone、Yeast extract对产纤维素酶有显著影响。通过响应面分析得到一元二次方程,对方程求解得到Peptone 7.27g/L、Yeast extract 5.51g/L。采用该优化培养基,最大纤维素酶活可达1.27FPU/ml,较优化前提高了2.03倍;CMC酶活14.15IU/ml,比优化前提高1.88倍;木聚糖酶活24.13IU/ml,比优化前提高1.86倍;葡萄糖苷酶酶活1.22IU/ml比优化前提高2.08倍。     

粗糙脉孢菌基因组分泌蛋白的初步分析

文章报道利用信号肽预测软件SignalP v3.0和PSORT,跨膜螺旋结构预测软件TMHMMv2.0和THUMBUP,GPI-锚定位点预测软件big-PI Predictor和亚细胞器中蛋白定位分布预测软件TargetP v1.01对粗糙脉孢菌全基因组数据库中已公布的10 082个氨基酸序列进行预测分析。结果表明在粗糙脉孢菌中有437个蛋白为分泌蛋白,编码这些蛋白最小的可读框（open reading frame,ORF）为252 bp,最大为6 604 bp,平均1 433 bp,分泌蛋白信号肽长度介于15~59个氨基酸之间。在437个分泌蛋白中,205个具有功能描述,主要包括各种酶类、细胞能量生成、运转以及自身修复、防卫等多种功能。这些蛋白所参与的生化过程可能发生在膜外的周质空间或是菌体外的场所,为该物种营养的摄取,以及对环境做出响应服务。      

模式生物粗糙脉孢菌光受体的研究进展

粗糙脉孢菌是一种重要的模式生物,在遗传调节机制、昼夜节律运行以及真菌光应答反应研究中起重要的作用.本综述主要介绍粗糙脉孢菌光受体WC-1和VVD的结构与功能,以及它们参与调节昼夜节律和光适应机制方面的研究进展.在该真菌中,所有已知的光应答反应都受蓝光调节,由光受体WC-1和VVD介导.WC-1是该真菌的转录因子,介导最初的光反应过程,产生VVD等多种光反应蛋白,而VVD通过负反馈机制抑制WC-1的转录作用.此外,vvd基因已经用于构建在哺乳动物中表达的光调节基因元件.     

粗糙脉孢菌木质纤维素降解利用研究进展

粗糙脉孢菌作为木质纤维素降解真菌,不仅具有完整的木质纤维素降解酶系,而且还拥有全基因组基因敲除突变体库,是研究丝状真菌纤维素酶表达分泌和木质纤维素降解机制的优秀体系。近年来,国内外利用粗糙脉孢菌系统,在木质纤维素降解机制方面取得了显著进展,包括纤维素酶信号传导、调控以及生物质降解后糖的转运利用等。笔者就相关方面的进展进行综述,并对利用粗糙脉孢菌研究木质纤维素降解利用进行展望,总结和分析木质纤维素降解机制研究的国际前沿动态,有助于加深本领域研究人员对真菌体系纤维素降解机制的理解。     

粗糙脉孢菌转录因子LAH-3参与渗透压调控

【目的】通过构建转录因子lah-3基因缺失突变体,研究lah-3基因缺失突变体菌株的渗透压表型,进而探究lah-3基因在渗透压调控中的作用。【方法】采用同源基因重组敲除技术构建lah-3基因缺失突变体。用4%NaCl和1 mol/L Sorbitol进行渗透压处理。利用Northern blot检测渗透压应答基因的表达。利用Westhern blot检测LAH-3蛋白磷酸化修饰水平,OS-2蛋白的表达水平及其磷酸化修饰水平。【结果】在转录因子lah-3基因缺失突变体中,渗透压应答基因gcy-1、stl-1以及pck-1的表达水平都明显降低,而且在渗透压刺激下,LAH-3蛋白磷酸化修饰水平升高。LAH-3的磷酸化修饰不受OS-2调控。lah-3基因的缺失既不影响OS-2蛋白的表达水平,也不影响其在渗透压刺激后的磷酸化修饰。【结论】粗糙脉孢菌中转录因子LAH-3参与调控渗透压应答基因的转录,但其响应过程不依赖于OS-2 MAPK信号通路。     

粗糙脉孢菌无性产孢过程中增量表达基因的功能分析

无性产孢是丝状真菌主要的繁殖方式,也是病原真菌传播的基础。为了全面分析丝状真菌无性产孢的调控机制,我们以粗糙脉孢菌为模式菌株,利用RNA‐seq比较了诱导无性产孢前后的转录组变化。对诱导前后差异表达基因的聚类分析发现,无性产孢诱导主要影响氧化还原过程与代谢过程,与ROS(reactive oxygen species)相关的基因差异表达明显,无性产孢诱导阶段伴随ROS的升高。同时,与产孢相关的基因(包括调控基因和结构基因)出现特异性表达。为揭示其他诱导表达基因在无性产孢中的功能,我们对这些基因缺失突变体的无性产孢表型进行了分析,新发现6个正向影响无性产孢的基因[NCU09792、NCU05159、NCU06112、NCU05079、NCU00461、NCU07521(fwd‐2)]。这6个基因在无性产孢过程中增量表达,相应的基因突变体无性产孢量与野生菌株相比有明显降低,说明它们对无性产孢具有正调控作用。以上结果进一步加深了我们对粗糙脉孢菌无性产孢发育及其调控网络的认识。     

粗糙脉孢菌丝氨酸/苏氨酸激酶家族基因敲除库纤维素酶表达分泌研究

【目的】蛋白磷酸化在丝状真菌细胞对外界纤维素酶诱导信号感应以及信号胞内的传导过程中有着重要的作用,而蛋白磷酸化是由蛋白激酶来完成的。为了挖掘在丝状真菌纤维素酶表达过程中发挥重要作用的激酶基因,对粗糙脉孢菌丝氨酸/苏氨酸家族的61株蛋白激酶单基因突变体的纤维素酶表达分泌情况进行了分析测定。【方法】在以微晶纤维素为唯一碳源的条件下,7株单基因突变体胞外分泌蛋白产量有显著变化,随后,对这7株突变体胞外蛋白进行了详细的SDS-PAGE分析和内切-β-1,4-葡聚糖酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活、外切纤维素酶酶活以及木聚糖酶酶活的测定。【结果】突变株W14、W38、W87和W40胞外分泌蛋白含量提高了30%以上,除了突变株W14外,其它突变体的内切-β-1,4-葡聚糖酶酶活分别显著提高了62%、42%和42%。而突变株W85、W26和W46胞外分泌蛋白含量降低了50%以上,相对应的内切-β-1,4-葡聚糖酶酶活也分别下降了86%、75%和84%。【结论】这些关于粗糙脉孢菌丝氨酸/苏氨酸家族蛋白激酶基因的挖掘,为进一步深入研究蛋白激酶在纤维素酶诱导表达调控中的分子机理奠定了基础。     

粗糙脉孢菌中甾醇还原酶基因erg24对麦角甾醇合成的影响

粗糙脉孢菌为子囊菌中的高效纤维素降解菌,可以直接以纤维素为营养源进行生长.本研究以粗糙脉孢菌为实验对象,利用基因工程技术构建甾醇还原酶基因erg24的高表达菌株,分别以蔗糖、麦麸、玉米秸秆、小麦秸秆、杨树木屑、水稻秸秆6种物质的粉末为碳源培养野生型粗糙脉孢菌和erg24高表达菌株,利用半定量RT-PCR测定在不同培养条...     

前纤维蛋白点突变对粗糙脉孢菌生长的影响及其生化机制研究

【目的】为进一步了解前纤维蛋白(profilin,PFN)在丝状真菌中的功能,本文以粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)为研究对象,进行了前纤维蛋白对其菌落生长和肌动蛋白(actin)聚合特性影响的探究。【方法】通过采用定点突变、同源重组、分生孢子过膜和PCR等技术,获得粗糙脉孢菌前纤维蛋白F78 (F78A和F78D)和V113 (V113E、V113R和V113W)的点突变体。利用平板生长法、竞争性生长管和显微镜观察检测表型变化,并结合多聚脯氨酸亲和层析纯化、荧光分光光度技术和高速共沉淀等技术分析点突变的前纤维蛋白对肌动蛋白聚合特性的影响。【结果】获得的粗糙脉孢菌前纤维蛋白点突变株F78A、F78D、V113E、V113R和V113W,与对照菌株ku70RIP相比,突变株生长均明显减慢(P<0.05),其中PFN (F78D)和PFN (V113W)的突变体在生长的12–48 h,菌落直径分别仅为对照的20.0%–75.7%和12.7%–39.2%。竞争性生长管分析表明,PFN (F78D)和PFN(V113W)突变株菌丝生长速度受到显著抑制,分生孢子形成的节律并...     

粗糙脉孢菌蛋白表达系统构建研究北大核心CSCD

旨在将模式丝状真菌粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)构建为蛋白质表达系统。通过真菌杂交技术构建出粗糙脉孢菌六突变缺失菌株LQ-1(Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3)作为蛋白表达宿主菌株。该宿主菌株可以用纤维二糖作为诱导物诱导纤维素酶启动子表达,同时又消除了葡萄糖苷酶蛋白的背景条带,有利于目标蛋白表达纯化。构建了分别含有粗糙脉孢菌自身强启动子(Pcbh-1、Pcbh-2和Ptef-1)的3个新的高效表达载体,该载体带有融合标签蛋白tev-6×his-gfp,能高效方便的筛选阳性转化子,有利于后续目标蛋白纯化。以纤维素酶GH3-4和CBH-1为例,通过重组表达菌株纤维二糖诱导发酵液进行酶活测定、SDS-PAGE电泳分析和Western blotting检测显示,重组蛋白GH3-4-GFP和CBH-1-GFP成功进行了表达和分泌,分泌水平分别为2.77和2.83 mg/L。Pcbh-1启动子重组蛋白表达水平最高,说明在纤维二糖诱导体系中启动子Pcbh-1的启动效率最高,初步建立了粗糙脉孢菌纤维二糖诱导的蛋白质表达体系。     

粗糙脉孢菌及其他真菌中生物钟系统研究进展

地球自转形成的昼夜交替促使地球上的生物在体内进化出了能够测量时间的"生物钟"系统,此系统由输入途径、核心振荡器和输出途径3部分组成。"光逃避"假说为生物钟的进化提供了一种合理的解释。作为研究生物钟的理想模式生物之一,粗糙脉孢菌生物钟的核心振荡器是由正调控因子WC-1、WC-2和负调控因子FRQ、FRH组成的一个基于转录/翻译的负反馈调控环路。输入途径感知光照、温度等环境信号并将其传递到核心振荡器,进而调控下游一系列钟控基因表达,输出昼夜节律。此外,粗糙脉孢菌中还存在不依赖于WC复合体的frq基因的转录,其调控方式的解析进一步丰富了生物钟的调控网络。最后,通过比较并探索其他真菌中生物钟系统组成及运行机制,使我们对真菌生物钟的进化历程及生物体对环境的整体适应性有了更加全面而深刻的认识。     

粗糙脉孢菌snRNA基因的克隆及其表达调控研究

Pre‐m RNA(precursor m RNA)的剪接是真核基因表达中的重要一环,由剪接体复合物(spliceosome)催化完成。小核RNA(small nuclear RNAs,sn RNAs)是剪接体的重要结构和功能组分。本工作首次鉴定了粗糙脉孢菌的U1、U2、U4、U5和U6等sn RNA基因,这些基因除U5为单一拷贝外,其余为多拷贝基因且表达量存在差异。对各基因的近端序列元件(proximal sequence elements,PSEs)的分析显示在大部分基因都存在一段回文的保守序列GTGCAC,荧光素酶报告基因实验证实该序列具有调控部分sn RNA基因转录的功能。我们还通过温度梯度实验检测了stk‐16第三内含子的剪接情况变化,结果提示可变剪接对调节生物可能对不同温度环境的适应具有重要作用。     

形成素结合蛋白调节粗糙脉孢菌菌丝极性生长发育

微丝骨架在真菌菌丝极性生长中具有重要的功能,而其动态解聚 聚合特性是其实现功能的前提.形成素作为肌动蛋白结合蛋白,是微丝骨架动态调控因子之一,而形成素结合蛋白对于形成素发挥功能非常关键,但是对其在真菌极性生长发育中的功能还未见报道.本文以丝状真菌粗糙脉孢菌为材料,利用同源重组基因敲除技术,通过电击转化、分生孢子过膜以及PCR鉴定的方法,获得了形成素结合蛋白基因缺失突变菌株（FBPKO）.进一步利用平板生长方法并结合细胞壁染色对突变菌株的表型进行分析. 结果显示, 与野生型相比,在分生孢子接种后24 h内突变菌株FBPKO的菌丝生长明显减慢且分支异常.这些结果表明, 形成素结合蛋白调节着粗糙脉孢菌菌丝早期的极性生长发育.     

一株粗糙脉孢菌的分离、鉴定及其基因组变异和功能分析

【背景】粗糙脉孢菌LY03是从武平传统"红菌豆腐"中分离得到的主要发酵菌株。【目的】研究粗糙脉孢菌LY03菌株的基因组信息,揭示武平传统"红菌豆腐"发酵特性。【方法】采用形态学观察、ITS鉴定、重测序及框架图测序对所分离的LY03菌株进行鉴定和基因组信息解析。【结果】武平传统"红菌豆腐"中分离得到的主要发酵菌株LY03确定为粗糙脉孢菌,将其在中国普通微生物菌种保藏管理中心进行专利保藏,保藏号为CGMCC3.19233。LY03菌株比对到参考基因组上的总Read数目为95.85%,测序对应深度的位点占全基因组76.13%;各变异类型在内含子区域均无变异,主要变异存在于基因组的外显子区域,具体变异数量为:单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism,SNP)位点变异总数203128个、插入缺失(insertion/deletion,In Del)突变总和26859个、拷贝数变异(copy number variation,CNV)增加和减少的拷贝总数1 039个、结构变异(structure variation,SV)注释的变异总数777个;LY03菌株...     

脉孢菌lca-1基因调控无性产孢及类胡萝卜素的合成

类胡萝卜素是很多生物细胞内重要的抗氧化剂,具有保护细胞免受紫外线伤害的功能。粗糙脉孢菌是少数几个类胡萝卜素合成基因比较清楚的真菌之一,为了深入了解该菌类胡萝卜素合成调控机制,通过对粗糙脉孢菌基因突变体库中6,087株突变体进行筛选,新发现6个基因敲除突变体营养生长正常,但类胡萝卜素的合成降低,其中表型较好的1个突变体,其无性产孢量与类胡萝卜素合成量均明显降低。鉴定发现该突变体所缺失的基因编码一种依赖ATP的染色体重建复合体的ATP酶链ISW1,将该基因命名为lca-1。进一步测定发现lca-1基因的突变导     

全基因组水平扫描鉴定粗糙脉孢菌糖转运蛋白及其在酿酒酵母己糖发酵中的评价

木质纤维素降解真菌粗糙脉孢菌天然具有吸收利用多种单糖和寡糖的能力,但是目前基因组中注释的预测糖转运蛋白仍然有过半功能未知。本研究从全基因组水平系统分析了粗糙脉孢菌预测糖转运蛋白的转运底物。研究发现两个转运蛋白(NCU01868和NCU08152)具有转运多种己糖底物的功能,因此分别命名为NcHXT-1和NcHXT-2。利用荧光共振能量转移技术(FRET)确认了NcHXT-1/-2具有葡萄糖转运功能。在己糖转运蛋白全缺酿酒酵母EBY.VW4000中分别过表达NcHXT-1/-2,能恢复其在葡萄糖、半乳糖或甘露糖的液体培养基中生长并生成乙醇的能力。NcHXT-1/-2在很多纤维素降解真菌中均具有保守的同源蛋白。本研究通过全基因组扫描鉴定,发现了两个保守的丝状真菌己糖转运蛋白,为真菌降解利用木质纤维素及酵母利用单糖发酵提供了新的改造靶点。     

综述: 表观遗传学研究的模式生物——粗糙脉孢菌

丝状真菌粗糙脉孢菌是一种作为遗传学研究的经典模式生物．通过对粗糙脉孢菌5S rRNA基因的组成和在染色体上分布的研究,揭示了丝状真菌中存在的一种基因组防御机制——重复序列诱导的DNA点突变(RIP)．通过对发生突变的5S rRNA假基因的研究还发现,粗糙脉孢菌中存在一种重要的表观遗传修饰——DNA甲基化,随后的深入研究使粗糙脉孢菌成为解析DNA甲基化机制的最重要模式生物之一．粗糙脉孢菌基因转化操作引起的营养生长阶段同源基因的沉默(quelling)是由RNAi途径调控的,同时该途径也是调控减数分裂过程中非配对DNA诱发的基因沉默(meiotic silencing)的关键．由于粗糙脉孢菌基因组简单,且存在与高等真核生物相同的DNA甲基化和多种组蛋白的修饰,使其成为今后深入研究组蛋白修饰与染色质重塑等表观遗传现象参与基因表达调控和基因组稳定性维持的重要模式生物之一．