β2糖蛋白I及其抗体在抗磷脂抗体综合症病理进程中的作用探讨

抗磷脂抗体综合症(Antiphospholipid syndrome,APS)是以反复的动脉和静脉血栓形成为特征,与内皮细胞及单核淋巴细胞功能失调有关。β2糖蛋白Ⅰ是一种磷脂结合型糖蛋白,抗β2糖蛋白Ⅰ抗体与血栓形成密切相关,并且在APS的发生发展过程中具有决定性作用,但是抗β2糖蛋白Ⅰ及其抗体的功能尚未阐明。本文将围绕β2GPⅠ及其抗体的结构、生物学功能及其在血栓形成中的作用等方面进行详细的阐述,期望为APS发生发展过程中抗原抗体复合物调节细胞功能的分子机制提供新的视点。     

抗纤维蛋白β链N端七肽抗体的制备

编码纤维蛋白β链Ｎ末端七肽的寡核苷酸片段,通过基因重组技术插入到金葡核酸酶基因的５’端,在ＰＲＰＬ启动子的调控下,β七肽以融合蛋白的形式在Ｅ．ｃｏｌｉ细胞中得到高效表达,以纯化的融合蛋白为免疫原,制备出抗β七肽抗体,纤维蛋白原抑制实验证明,该抗体对纤维蛋白（ＦＰ）有特异性反应。     

抗纤维蛋白β链N端七肽抗体的制备

编码纤维蛋白β链Ｎ末端七肽（β七肽）的寡核苷酸片段,通过基因重组技术插入到金葡核酸酶（Ｐ－１蛋白）基因的５′端。在Ｐ_ＲＰ_Ｌ启动子的调控下,β七肽以融合蛋白（β七肽·Ｐ－１）的形式在Ｅ．ｃｏｌｆｉ细胞中得到高效表达。以纯化的融合蛋白为免疫原,制备出抗β七肽抗体;纤维蛋白原（ＦＧ,４ｇ／Ｌ抑制实验证明,该抗体对纤维蛋白（ＦＰ）有特异性反应。     

半合成抗体库的构建及抗Tie2 Fab抗体的筛选

构建一个半合成抗体库 ,不经免疫制备人源抗Tie2Fab抗体。通过RT PCR方法 ,从人脐带血淋巴细胞总RNA扩增轻链基因及重链VH段基因 ,将轻链基因插入pCOMb3载体中 ,得人轻链质粒库 ;从HBsAb的Fd段基因制备含有不同长度随机化CDR3的FR3 CDR3 J CH1片段 ,然后将VH段基因与随机化的CDR3融合 ,得到Fd基因片段 ,再将其插入轻链质粒库中 ,得半合成人Fab质粒库。通过多次建库 ,获得总容量为 2× 1 0 7的半合成抗体库。其Fd段和轻链基因的重组率为 5 0 %。经 3轮淘洗 ,从噬菌体抗体库中筛选到与Tie2抗原特异结合的噬菌体克隆。测序确定抗体基因序列     

一种从抗狂犬病病毒噬菌体抗体库中筛选和验证中和抗体的方法

目的建立一种从噬菌体库抗体库中高效筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法。方法①定性分析:从经过灭活的CVS-11筛选噬菌体抗体库中挑取单克隆于96孔板中培养,制备噬菌体抗体,取培养上清进行快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT),选择可明显抑制病毒感染的克隆测序,获得具有中和活性的抗体可变区序列;②定量分析:挑选有中和活性的克隆,重新制备噬菌体抗体颗粒,纯化后进行RFFIT分析;扩增抗体可变区基因,构建真核瞬时表达质粒。瞬转HEK-293 EBNA1细胞,培养上清经Mabselect SuRe亲和纯化后测定抗体比活。结果定性分析获得的噬菌体抗体颗粒与全分子抗体体外中和活性显著相关;剔除低活性序列后,活性高于0.5 IU/mL的噬菌体抗体颗粒与其全分子抗体体外中和活性之间无显著相关;所有纯化后噬菌体抗体颗粒活性>0.5 IU/mL的序列其全分子抗体体外中和活性均>500 IU/mg。结论构建了一种从抗狂犬病病毒噬菌体库中高效筛选、验证中和抗体的方法。     

抗体库的构建与特异性抗体的筛选

噬菌体抗体库技术和出现标志着抗体技术从多克隆抗体,单克隆抗休进入基因工程抗体的时代,这一技术具有省时,省力,筛选容量大,可直接接得到抗体,便于构建筑各种基因工程抗体及在原核系统中进行表达的特点。     

脑梗塞患者血清抗心磷脂抗体含量变化的研究

目的探讨脑梗塞患者血清中抗心磷脂抗体(ACA)含量变化的意义。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对80例脑梗塞患者血清中ACA含量进行检测,并与40例作为对照组进行比较。结果脑梗塞组血清中ACA阳性率明显高于对照组(P<0.01);ACA分型中,脑梗塞组血清中IgG阳性率明显高于对照组(P<0.01)。结论检测血清中ACA含量,可作为研究ACA与脑梗塞关系的一项可靠指标,对脑梗塞的病理机制研究以及对疾病的预防、治疗和预后判断可能有一定帮助。     

从大容量噬菌体抗体库中筛选抗DNA-PKcs单链抗体

目的：从单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗DNA-PKcs的人源抗体,用于肿瘤治疗或诊断目的。方法：经抗原性分析及BLAST比对,选定人DNA-PKcs蛋白中抗原性高且与其他蛋白没有同源性的片段,进行原核表达及纯化后将其固定在抗原管上,通过4轮“吸附－洗脱－扩增”过程从大容量抗体库中筛选特异性抗体,转化HB2151菌,制备抗DNA-PKcs的可溶性单链抗体;ELISA检测抗原-抗体结合活性。结果：经生物信息学分析,确定抗原性高且与其他蛋白没有同源性的DNA-PKcs片段DPK3（250个AA）、DPK4（257个AA）。经过4轮筛选,获得26个特异性结合DPK3及31个特异结合DPK4的克隆,指纹分析分别有5种和21种不同的可变区片段;成功制备了可溶性抗体。并做了抗原结合活性鉴定。结论：利用单链大容量抗体库获得抗DNA-PKcs的噬菌体抗体基因并且成功制备成可溶性抗体,为今后的研究和应用奠定了基础。     

抗整合素β3胞外区噬菌体抗体库的构建及筛选

用RT-PCR的方法从人胶质瘤BT-325细胞中扩增人整合素β3胞外区,并克隆到载体pET-24a中构建表达载体.表达的人整合素β3胞外区经变性、复性和纯化后免疫BALB/c小鼠,提取脾脏总RNA,用RT-PCR技术扩增小鼠抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,经重叠PCR(SOE-PCR)将VH和VL连接成单链抗体(scFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,电转化至大肠杆菌TGl,经辅助噬菌体M13KO7超感染,构建噬菌体单链抗体库.通过淘选从该抗体库中筛选特异性识别人整合素β3胞外区的噬菌体单链抗体.结果表明,成功构建了库容为2.6×106的抗人整合素β3胞外区的单链抗体库,初步筛选到了与人整合素β3胞外区特异性结合的单链抗体.     

抗EGFRvIII噬菌体抗体库的构建和筛选

目的：应用噬菌体展示技术筛选针对表皮生长因子受体突变体Ш (epidermal growth factor receptor variant type Ⅲ, EGFRvIII)的单链抗体 (single chain Fv, scFv)。方法：利用原核表达纯化的人EGFRvIIIex蛋白和高表达EGFRvIIIex的小鼠成纤维细胞系NIH3T3免疫小鼠,扩增VH和VL片段并拼装成scFv 基因,连接至噬菌粒pCANTAB 5E,电击转化Hpd3cells,构建噬菌体单链抗体库,并进行3轮富集筛选。在第4轮筛选时,采用了降低抗原浓度的方法。然后将筛选得到的阳性克隆测序分析,转化E.coli HB2151,IPTG 诱导可溶性scFv 的表达。结果：构建了库容为7.9×107 的噬菌体单链抗体库。经过第4轮低浓度抗原筛选,得到了较高亲和力的克隆。取单个阳性克隆测序分析结果表明,该抗EGFRvIII scFv 基因序列长807 bp,编码268个氨基酸。IPTG诱导后表达的可溶性scFv 可分别与纯化的EGFRvIIIex抗原以及细胞表面的EGFRvIIIex结合。结论：利用噬菌体抗体库筛选得到了高亲和力的抗EGFRvIII scFv,为开发针对EGFRvIII的抗体药物提供了靶向载体分子。     

噬菌体呈现肽库技术的应用

噬菌体呈现肽库是噬菌体显示技术的一个非常重要的分支。自问世以来,随着分子生物学技术的飞速发展,它已被广泛应用于免疫学、分子生物学、药理学、疫苗学等生命科学领域。简要概述了这一技术的应用。     

从噬菌体文库中筛选潜在的GMCSF的拮抗剂(英文)

以粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭＣＳＦ） 为筛选文库的靶分子, 通过高效筛选（Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇ, ＨＴＳ） 方法来筛选多种多肽噬菌体文库, 在一个以噬菌体主要蛋白质为载体的多肽噬菌体文库中筛选到了一些与ＧＭＣＳＦ结合的多肽, 并通过了ＥＬＩＳＡ和微淘选（ｍｉｃｒｏｐａｎｎｉｎｇ） 实验的证实。这些多肽先导化合物经过进一步的优化, 可能成为ＧＭＣＳＦ细胞因子的拮抗剂     

噬菌体抗体库技术与高通量筛选抗体

噬菌体抗体库技术是组合技术与基因工程抗体技术相结合的产物 ,为快速筛选特异性抗体提供了简便而高效的操作系统 ,随着蛋白质组学的飞速发展 ,对抗体的大规模制备的需求日益增加 ,迫切需要发展高质量的抗体库和与之相整合的高通量筛选技术。近年来 ,以上技术的发展和自动化设备的引入为大规模抗体制备的实现提供了条件 ,对这一领域的研究进展做一概述。     

从噬菌体随机肽库中筛选流感病毒神经氨酸酶的抑制多肽

目的:从噬菌体呈现12肽库中筛选与流感病毒神经氨酸酶特异性结合的肽。方法:以甲三型流感病毒裂解疫苗原液为靶分子,经过3轮生物淘选,从噬菌体随机肽库中筛选与之结合的噬菌体。用ELISA方法鉴定噬菌体克隆与靶分子的结合力,用荧光方法测定噬菌体克隆对流感病毒A/Sydney/5/97(H3N2)神经氨酸酶的抑制活性。对筛选到的阳性克隆进行DNA序列测定并推导出相应的氨基酸序列。结果:经过3轮筛选后,42个噬菌体克隆与靶分子有高度亲和力,23个噬菌体克隆对流感病毒A/Sydney/5/97(H3N2)神经氨酸酶有抑制活性。对27个噬菌体克隆的测序结果表明,分别有10个和2个克隆的序列是一致的,其氨基酸序列分别为KSLSRHDHIHHH和WPRHHHSASVQT。结论:通过噬菌体肽库筛选到抑制流感病毒神经氨酸酶的12肽,为进一步研究对流感病毒神经氨酸酶有抑制活性的分子药物奠定了基础。     

多肽噬菌体展示

噬菌体展示技术已被广泛地应用于生物学研究的各个方面.利用它可融合表达多肽、蛋白质结构域和蛋白质.尤其是多肽噬菌体展示,已被作为一种便利的研究工具去发现和研究那些与受体、酶、凝集素、抗体、核酸以及其他生物分子亲和的多肽配基和酶的底物专一性,该技术在药物的发现,疫苗的设计等医学领域也有着潜在的应用价值.     

噬菌体短肽库的构建及其随机短肽的多样性

噬菌体短肽库是将随机合成的寡核苷酸序列通过与单链噬菌体外壳蛋白基因融合,从而将随机短肽表达于噬菌体的表面。将体外随机化学合成的寡聚核苷酸序列重组到单价噬菌体表达载体,构建了噬菌体短肽库,证明其库容为２×１０￣７集落形成单位（ｃｆｕ）,重组率为９３％。同时将１１个随机克隆进行序列测定,证实其寡聚核苷酸序列和氨基酸的分布几乎是完全随机的,其多样性可以满足特异性短肽筛选的要求。     

以GST融合蛋白为靶从噬菌体肽库中筛选结合肽

以重组的谷胱甘肽S-转移酶（GST）和目标蛋白的融合蛋白为靶,通过将其固定于谷胱甘肽琼脂糖凝胶上,可以方便地从噬菌体肽库中筛选目标蛋白的结合肽.用此方法筛选到含WWXF结构的HIV-1病毒蛋白R（Vpr）的结合肽,与经典的将Vpr包被于培养板上的筛选方法相比,此方法具有简便、快速的优点.     

以重组TACE胞外功能域从噬菌体随机肽库中筛选TACE的抑制肽

肿瘤坏死因子转换酶 (TACE)是加工裂解TNF-α前体的关键酶 ,参与了许多炎症的发生发展过程。为通过肽库筛选得到TACE的抑制肽 ,首先制备筛选靶分子 ,用RT PCR从人外周血单核细胞中分别扩增出TACE的催化区 (T800 )和整个胞外区 (T1300 ) ,然后分别克隆至pET-28a和pET-28c中 ,转化大肠杆菌BL2-1(DE3) ,经IPTG诱导表达出带有His-tag的目的蛋白 ,两者均为包涵体 ,变性复性后过Ni²⁺-NTA亲和层析柱得到纯度达90%的重组蛋白。以纯化的重组T800和T1300分别筛选噬菌体展示随机 15肽库 ,对筛选克隆进行ELISA检测、竞争抑制实验和序列分析。从两个独立的筛选过程中得到一个相同的阳性克隆序列“TRWLVYFSRPYLVAT” ,固相Fmoc法合成该短肽 ,观察其在LPS诱导人单核细胞产生sTNF-α中的作用。结果表明 ,筛选到的短肽可显著抑制TACE的活性 ,减少TNF-α的分泌 ,抑制率可达 60.3% ,为抗炎小分子药物的设计和改造提供线索和依据。