乙醛脱氢酶2基因在毕赤酵母中的表达和分离纯化

将乙醛脱氢酶2（ALDH2）基因整合到质粒pPIC9K上,构建重组表达载体pPIC9K-coALDH2,用电转导将表达质粒pPIC9K-coALDH2转化至毕赤酵母GS115中,在毕赤酵母中表达经密码子改造的ALDH2。结果表明：重组基因工程菌GS115（pPIC9K-coALDH2）发酵液中蛋白质量浓度为8.40 mg/L,1 mL发酵液中酶活为11.35 mU。     

一种新型抗菌肽Cecropin B真核表达载体的构建

通过重叠区扩增法人工设计和合成一种新型抗菌肽Cecropin B基因,按正确的阅读框架定向克隆至巴斯德毕赤酵母的高效表达载体pPIC9K上。经PCR鉴定及序列分析,所转化的大肠杆菌DH5ct菌落中含有插入Cecropin B基因的重组质粒pPIC9K—CB,表明成功构建了新型抗菌肽Cecropin B表达载体pPIC9K—CB。     

人可溶性gp190在酵母Pichia pastoris中的表达

人可溶性gPl90(sgp190)是白血病抑制因子(LIF)的可溶性受体,可能在LIF行使众多生物学功能中扮演着重要的角色。为获得这一蛋白以研究它在人体内的生物学活性,在酵母Pichia pastoris中实现了重组sgp190分泌表达。利用基因重组技术,将编码人可溶性gP190(LlF受体α亚基gP190胞外区)cDNA克隆到毕赤酵母Pichia pastoris分泌表达载体pPIC9K,构建了重组表达质粒pPIC9K-sgp190。原生质体法转染Pichia pastoris GS115菌株,经过G418筛选,得到了高效分泌表达sgp190蛋白的毕赤酵母菌株GS115／pPIC9K-sgp190,sgp190蛋白占摇瓶培养表达上清中总蛋白质的26％。经初步纯化,对表达产物的性质鉴定表明,其分子量约125kD,具有免疫活性。对sgp190体外活性分析表明它能够抑制LIF诱导滋养层细胞分泌hCG。     

猪PR-39抗菌肽基因在毕赤酵母中的表达

[目的]在毕赤酵母中表达抗菌肽PR-39基因,获得有抗菌活性的PR-39。[方法]根据酵母和猪密码子偏好性,对其密码子进行优化改造。将经SOE-PCR获得的PR-39基因与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建重组载体pPIC9K-PR-39。经SacⅠ线性化电击转化毕赤酵母GS115,取阳性克隆进行髙拷贝转化子筛选和诱导表达。[结果]pPIC9K-PR-39重组质粒构建成功,pPIC9K-PR-39菌株发酵产物检测结果对DH5α大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑菌效果。[结论]获得了PR-39基因的重组酵母,并用毕赤酵母系统成功地分泌表达了具有明显抗菌活性的抗菌肽PR-39。     

人胸腺素α1基因在毕赤酵母中的分泌表达

根据质粒pPIC9K中信号肽基因和质粒pPIC3.5K/hTα1-RP,构建表达质粒pPIC9K/S-hTα1-RP,通过电激法转化到毕赤酵母GS115菌株中。甲醇诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot结果证明,重组基因hTα1-RP在酵母中得到了表达。     

日本囊对虾Kunitz型蛋白酶抑制剂在毕赤酵母中的表达纯化及活性分析

SKPI(shrimp Kunitz-type protease inhibitor)是日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)体内的一个小分子多肽, 含有一个Kunitz型结构域, 属于丝氨酸蛋白酶抑制剂。目前已知丝氨酸蛋白酶抑制剂在节肢动物免疫系统中起着非常重要的作用, 为了了解SKPI在对虾天然免疫系统中的作用, 首先对其进行了重组表达。从日本囊对虾肝胰腺中扩增skpi的cDNA片段, 插入改造后的pPIC9K酵母表达载体, 获得的重组质粒转化至毕赤酵母GS115进行表达。由于改造的pPIC9K载体加入了6-His标签, 因此利用Ni?Sepharose?High?Performance对SKPI进行了高效纯化。初步的活性研究表明, 重组表达的SKPI能特异性地抑制胰蛋白酶的水解活性。     

人源抗狂犬病毒糖蛋白稳定型抗体精氨酸密码子突变株的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的：对人源抗狂犬病毒糖蛋白（GPRV）单链二硫键稳定抗体（ScdsFv）进行精氨酸密码子修饰,实现其在酵母中的分泌表达,并检测其生物学活性。方法：参照巴斯德毕赤酵母偏好密码子,对抗GPRV ScdsFv原核表达基因进行密码子修饰,并通过点基因融合技术构建ScdsFv重组酵母表达基因,连接pPIC9K构建重组表达质粒pPIC9K-ScdsFv,电转化毕赤酵母GS115,经筛选后进行甲醇诱导表达。结果：SDS-PAGE及Western blot检测到重组表达质粒在30℃经甲醇诱导表达的蛋白相对分子质量为30000;荧光抗体试验验证ScdsFv能靶向结合GPRV;MTT试验说明ScdsFv能中和狂犬病毒,具有一定的细胞保护作用。结论：重组ScdsFv在酵母系统中可以有效表达。具有较好的生物学活性。     

神经营养素-3基因的人工合成及其在毕赤酵母中的分泌性表达

根据人神经营养素3（Human neurotrohin3,hNT3）的基因序列,把编码氨基酸的密码子转换成毕赤酵母（Pichia pastoris）偏爱的形式,设计了10条36～59nt的寡聚核苷酸引物,通过5次连续PCR反应,获得了人工合成的NT3 cDNA片段（简称NT3b基因）。将合成的NT3b基因克隆到pPIC9K质粒上,获得重组表达载体pPIC9KNT3b。将重组表达载体pPIC9KNT3b和pPIC9KhNT3分别电击转化宿主毕赤酵母GS115菌株,经筛选得到重组转化子。不同转化子经甲醇诱导,表达产物进行SDSPAGE检测、Western blot检测和ELISA分析,结果表明,NT3b基因和hNT3基因成功获得分泌性表达,从整体水平上,使用偏爱密码子的NT3b基因在毕赤酵母GS115菌株中的表达明显优越于hNT3基因(x2=4.334,P<0.05),表达量在诱导后72～96h最高,达到31mg/L左右。     

日本囊对虾Kunitz型蛋白酶抑制剂在毕赤酵母中的表达纯化及活性分析

SKPI(shrimp Kunitz-type protease inhibitor)是日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)体内的一个小分子多肽, 含有一个Kunitz型结构域, 属于丝氨酸蛋白酶抑制剂。目前已知丝氨酸蛋白酶抑制剂在节肢动物免疫系统中起着非常重要的作用, 为了了解SKPI在对虾天然免疫系统中的作用, 首先对其进行了重组表达。从日本囊对虾肝胰腺中扩增skpi的cDNA片段, 插入改造后的pPIC9K酵母表达载体, 获得的重组质粒转化至毕赤酵母GS115进行表达。由于改造的pPIC9K载体加入了6-His标签, 因此利用Ni?Sepharose?High?Performance对SKPI进行了高效纯化。初步的活性研究表明, 重组表达的SKPI能特异性地抑制胰蛋白酶的水解活性。     

人白介素2受体γ链胞外区在巴斯德毕赤酵母中的表达

目的:在毕赤酵母GS115中表达重组人白细胞介素2受体γ链(rhsIL-2Rγ)胞外区。方法:用RT-PCR法从正常人淋巴细胞中获得IL-2Rγ胞外区基因;构建重组质粒pPIC9K-hsIL-2Rγ,用聚乙二醇法转入感受态GS115菌株,MD平板筛选His+转化子,用BMMY培养基诱导表达rhsIL-2Rγ;对重组蛋白进行免疫酶染色、SDS-PAGE及Western印迹鉴定。结果:克隆到目的片段,构建了重组质粒pPIC9K-hsIL-2Rγ;免疫酶染色、Western印迹等结果显示,重组质粒已成功转化GS115,并获得诱导表达的rhsIL-2Rγ。结论:在毕赤酵母GS115中表达了rhsIL-2Rγ,其蛋白条带有上移现象,分子较大,可能其糖基化过度或存在二聚体。