转基因烟草表达霍乱毒素B亚单位的研究

将霍乱毒素Ｂ亚单位（ＣＴＢ）基因克隆到质粒ｐＢｉｎ４３８中,分别构建植物表达载体ｐＢＩ－ＣＴＢ、ｐＢＩ－ＳＰＣＴＢ和ｐＢＩ－ＣＴＢＥＲ。采用叶盘法分别转化烟草Ｋ３２６,各表达载体得到了一批较基因植株。转基因烟草的ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明ＣＴＢ基因整合到了烟草基因组中。转基因植株的ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明ｐＢＩ－ＳＰＣＴＢ和ｐＢＩ－ＣＴＢＥＲ的转基因植株能有效表     

霍乱毒素B亚单位基因（CtxB）的克隆及其表达

从霍乱弧菌中抽提基因组ＤＮＡ,用ＰＣＥＲ方法获取霍乱毒素Ｂ亚单位基因（ＣｔｘＢ）。序列分析结果表明,ＣｔｘＢ基因编码１２４个氨基酸,其中编码６２位Ｔｈｒ的密码子与文献报道有差异。将ＣｔｘＢ基因插入质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－２,构建ｐＧＥＸ－ＣＴＸＢ表达质粒,转化大肠相菌ＢＬ２１（ＤＥ３０,筛选表达菌株ＣＴＸＢ／ＢＬ２１。工程株经ＩＰＴＧ诱导表达,可产生大量的表达蛋白,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,融合蛋白分子     

转基因烟草生产霍乱毒素B亚单位的纯化

提取转基因烟草叶片总蛋白,用经溴化氰活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ偶联有抗ＣＴ ＩｇＧ色谱柱,得到了表达产物ＣＴＢ蛋白质。经ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、琼脂糖免疫扩散和免疫电泳等方法鉴定表明该蛋白与天然ＣＴＢ相同。     

烟草生产霍乱毒素B亚单位疫苗的免疫分析

用纯化的ＣＴＢ后腿肌肉注射免疫小鼠,每次１２．５μｇ,每隔１４天加强一次,共注射三次,末次免疫后两周收集血清,免疫小鼠诱导产生了特异性抗ＣＴＢ抗体。在ＣＨＯ细胞中,免疫小鼠血清能够中和ＣＴ的细胞病变效应;小鼠肠结扎实验表明,抗ＣＴＢ血清能够抑制ＣＴ结合细胞表面受体ＧＭ１神经节苷脂。这表明转基因烟草产ＣＴＢ在小鼠中能够产生抗细菌毒素的保护免疫力。     

霍乱毒素无毒B亚单位（CTB）黏膜免疫佐剂的研究进展

霍乱毒素（CT）具有很强的黏膜免疫佐剂活性,是当今研究热点之一,但CT的黏膜免疫佐剂效应机理尚未完全弄清。本文主要就霍乱毒素无毒B亚单位（CTB）的黏膜免疫佐剂作用进行综述。     

志贺氏毒素B亚单位的分离纯化及其多克隆抗体的制备

从高效表达志贺氏毒素Ｂ亚单位（ＳｔｘＢ）的工程菌株ＤＨ５α／ｐＳＵ１０８分离纯化了ＳｔｘＢ,并用它制备了多克隆抗体。ＥＬＩＳＡ试验表明抗ＳｔｘＢ抗血清的滴度达１×１０４。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示该抗血清能与ＳｔｘＢ发生特异反应。这为研究志贺氏毒素Ｂ亚单位的免疫保护作用和痢疾志贺氏Ⅰ型菌苗的研制打下了基础     

霍乱毒素B亚基融合蛋白表达系统的构建

霍乱毒素Ｂ亚基（ＣＴＢ）是良好的免疫佐剂和载体蛋白。本研究通过定点突变,在ＣＴＢ基因（ｃｔｘＢ）３＇端终止密码前引入了限制性内切酶ＥｃｏＲＩ,构建了质粒ＰＭＣ０５,ＰＭＣ０５中ＣＴＢ与下游ｌａｃＺ＇基因阅读框架相同,转化大肠杆菌后能够表达ＣＴＢ与β－半乳糖苷酶α肽的融合蛋白;所表达的融合蛋白能与ＧＭ１结合,说明融合蛋白保持ＣＴＢ的基本高级结构和生物学活性;融合蛋白能与抗－ＣＴＢ抗体结合,说明融合蛋     

霍乱毒素B亚基融合蛋白表达系统的构建

霍乱毒素Ｂ亚基（ＣＴＢ）是良好的免疫佐剂和载体蛋白。本研究通过定点突变,在ＣＴＢ基因（ｃｔｘＢ）３′端终止密码前引入了限制性内切酶ＥｃｏＲＩ,构建了质粒ｐＭＣ０５。ｐＭＣ０５中ＣＴＢ与下游ｌａｃＺ′基因阅读框架相同,转化大肠杆菌后能够表达ＣＴＢ与β－半乳糖苷酶α肽的融合蛋白;所表达的融合蛋白能与ＧＭ１结合,说明融合蛋白保持ＣＴＢ的基本高级结构和生物学活性;融合蛋白能与抗－ＣＴＢ抗体结合,说明融合蛋白具有ＣＴＢ的抗原性。以上结果表明：通过将外源抗原决定簇基因融合至ｃｔｘＢ的３′端,在大肠杆菌中表达融合蛋白,构建基因工程肽苗是可行的。还探索了转录终止序列对融合基因蛋白表达水平的影响,构建了高效表达融合蛋白的载体－宿主系统。     

霍乱毒素B亚单位基因分泌型表达载体的构建及转化烟草的研究

为了探索利用植物分泌特性来表达重组蛋白的可行性,先构建了含钙网蛋白信号肽的植物双元载体pBIcal,再向该载体中插入霍乱毒素B亚单位编码基因,最后得到表达载体pBIcal—ctb。通过根癌农杆菌介导,该表达载体转化烟草,在卡那霉素抗性培养基上筛选,得到30棵抗性植株。经PCR鉴定,霍乱毒素B亚单位基因已经整合到烟草基因组中。初步表达分析表明,转基因烟草中含有具生物活性的霍乱毒素B亚单位蛋白。     

霍乱肠毒素A2亚单位15肽(10一24)的合成及其有关生物活性初步测定

本文根据Merrifleld固相方法,人工合成了霍乱肠毒素A2亚单位第10—24位氨基酸序列。合成中采用树脂一氯甲烷为载体,双环己基碳化二亚胺(D．C．C．I)作为连结剂。最终合成产物经过高压液相氨基酸分析证实：含有A。亚单位第10—24位十五个氨基酸组成成分,经初步活性测定证实有抗原性;能激发家兔产生特异性抗体,在琼脂双扩散试验中能产生抗原抗体特异性沉淀反应。它不具有改变血管通透性的毒性活力,小鼠皮肤反应阴性。肠袢结扎试验显示：不引起肠液贮留;当与B亚单位结合后,在肠内可抑制霍乱毒素的作用。     

乙肝PreS_2抗原决定簇和霍乱毒素B亚基基因的融合与表达

通过全化学法按大肠杆菌密码偏性合成了乙肝炎病毒（ＨＢＶ）前Ｓ２抗原（ＰｒｅＳ２）抗原决定簇基因,与霍乱毒素Ｂ亚基基因的３’端融合。重组质粒转化大肠杆菌后融合基因得到高效表达,表达量达３０μｇ／ｍＬ,表达产物９５％以上分泌到胞外。表达的融合蛋白能与神经节苷脂ＧＭ１结合,说明融合蛋白保持了霍乱毒素Ｂ亚基（ＣＴＢ）的基本高级结构和生物学功能;酶联免疫吸附实验证明融合蛋白具有ＣＴＢ和ＨＢＶＰｒｅＳ２的抗原性;应用亲和层析纯化后得到了电泳纯融合蛋白制品,为研究融合蛋白免疫原性并进一步构建基因工程肽苗奠定了基础。     

霍乱毒素B亚基基因具有自己的启动子

本研究发现并证实霍乱毒素B亚基基因上游Xba Ⅰ～Cla Ⅰ限制性片段内存在具有启动子活性的序列;在该启动子作用下,霍乱毒素B亚基表达水平可达200mg/L,氯霉素乙酰基转移酶基因表达水平随培养条件不同在0.3～10mg/L之间,大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的表达量达4100U/ml。在该启动子的控制下霍乱毒素B亚基基因可以高效表达,该启动子的存在可能是由于霍乱毒素操纵子中霍乱毒素B亚基表达量是A亚基的6倍。     

霍乱毒素B亚单位工程菌MM2在含乳酸培养基中的高表达

确定了工程菌MM2中霍乱毒素B亚单位(CTB)在含乳酸培养基中的高表达方案。采用两阶段控制培养温度(30℃→37℃)可提高CTB产量4倍,提高后期pH值(72→84)可提高CTB比表达水平214倍,中间补加乙酸钠可提高CTB产量65%。在5L发酵罐培养菌密度OD₆₀₀达30,CTB产量达1867mg/L,产物在培养液中以多聚体形式存在,具有抗原性。     

A组轮状病毒VP6与霍乱毒素B亚基融合蛋白在大肠杆菌中的表达及生物活性分析

利用霍乱毒素B亚基 (CholeratoxinBsubunit,CTB)的免疫载体作用 ,将轮状病毒相关抗原引入口服免疫体系 ,可激起有效的粘膜免疫反应 ,这里报道了CTB基因与A组轮状病毒地方株T114VP6全基因的融合 ,并在大肠杆菌BL21(DE3 )中进行了融合蛋白的表达。在IPTG诱导下得到分子量为 5 6kD的融合蛋白 ,表达量占菌体蛋白的15 %。分别用抗CT的抗体和抗A组轮状病毒的高价免疫血清进行WesternBlot检测 ,结果证明融合蛋白CTB VP6保留了天然霍乱毒素B亚基及轮状病毒VP6的抗原性。G_M1-ELISA检测表明 ,复性后的融合蛋白具有与神经节苷脂GM1 结合的能力。     

霍乱肠毒素B亚单位在转基因番茄中表达的研究

将霍乱肠毒素B亚单位（CT－B）基因及内质网引导序列（SEKDEL）克隆到质粒pRTL2和pBI121中,分别构建植物双元表达载体pBI-CTB和pBI-CTBK,CT-B基因由Ca35S启动子控制表达。采用叶盘法经根癌农杆菌介导转化番茄（金丰1号,Jinfeng1)各表达载体得到一批转基因植株。经PCR和Southern blot分析表明CT－B基因整合到了番茄基因组中;ELISA和Western blot分析表明pBI-CTB和pBI-CTBK的转基因植株能够有效表达CT－B多肽,分别占番茄叶片可溶性蛋白的0.055%和0.084%。     

Liposome Fluidity Alters Interactions Between the Ganglioside GM1 and Cholera Toxin B Subunit

Cholera toxin is a complex protein with a biologically active protein (A subunit) and a cell targeting portion (B subunit). The B subunit is responsible for specific cell binding and entry of the A subunit. One way to limit potential toxicity of the toxin after exposure is to introduce cellular decoys to bind the toxin before it can enter cells. In this study the ganglioside GM1, a natural ligand for cholera toxin, was incorporated into liposomes and the interaction between fluorescent B subunit and the liposome determined. Liposome membrane fluidity was determined to play a major role in the binding between liposomes and the cholera toxin B subunit. Liposomes with lower fluidity demonstrated greater binding with the B subunit. The findings from this study could have important implications on formulation strategies for liposome decoys of toxins.     

Expression of Cholera Toxin B Subunit in Transgenic Rice Endosperm

The synthetic cholera toxin B subunit (CTB) gene, modified according to the optimized codon usage of plant genes, was introduced into a plant expression vector and expressed under the control of the Bx17 HMW (high molecular weight) wheat endosperm-specific promoter containing an intron of the rice act1. The recombinant vector was transformed into rice plants using a biolistic-mediated transformation method. Stable integration of the synthetic CTB gene into the chromosomal DNA was confirmed by PCR amplification analysis. A high level of CTB (2.1% of total soluble protein) was expressed in the endosperm tissue of the transgenic rice plants. The synthetic CTB produced only in the rice endosperm demonstrated strong affinity for G_M1-ganglioside, thereby suggesting that the CTB subunits formed an active pentamer. The successful expression of CTB genes in transgenic plants makes it a powerful tool for the development of a plant-derived edible vaccine.