甲醇酵母表达系统高拷贝数整合型表达载体的构建

以甲醇酵母(Hansenula polymorpha)表达系统的Yip型表达载体pJF5-1为基础,通过引入宿主来源的一个rDNA随机顺序和由SV40早期启动子控制的G418抗性基因(neo)及对野生型标记基因Hpleu2启动子大部分上游序列的缺失,构建了一个高拷贝整合型表达载体pMIRH。有关转化、筛选和拷贝分析等试验结果表明,由pMIRH可产生含高拷贝数载体的转化子,并可通过由leu2+筛选和G418抗性筛选所组成的二级筛选方法富集这些含高拷贝数载体的转化子。有关完整DNA和消化DNA Southern杂交分析结果进一步表明,上述高拷贝数的载体以串联重复排列的方式整合于宿主基因组。     

真菌天然产物异源生产研究进展

真菌天然产物是天然药物的重要来源之一,大规模真菌基因组序列测序的完成表明真菌具有产生丰富的次级代谢产物的潜能。然而,许多真菌或生长缓慢,或不适宜在实验室条件下培养,或难以进行遗传操作,或化合物产量极低等,这些因素导致大量有价值的真菌天然产物无法获得。利用异源表达系统对真菌天然产物进行生产是发现新天然产物及解析其生物合成途径的有效手段,并为定向的以合成生物学的手段去合成重要活性分子奠定基础。本文对目前用于真菌天然产物生产的各种异源表达系统进行了综述,并结合最新的DNA组装技术展望了异源表达系统在真菌天然产物研究中的应用价值和前景。     

利用木糖和葡萄糖合成乙醇的新型重组大肠杆菌的研究

利用PCR方法从运动发酵单孢菌染色体DNA扩增出乙醇合成途径的关键酶基因pdc、adhB,分别用tac启动子控制表达,构建了可以在Escherichia coli JM109中表达的重组质粒pKK-PA、pEtac-PA.初步的乙醇发酵结果表明,在E.coli中只引入adhB基因不能拓宽其中的产乙醇途径,引入pdc基因可以与宿主自身的ADH酶协同作用,使碳流有效导向产乙醇方向.同时引入pdc、adhB基因可以在宿主E.coli中成功建立产乙醇途径.     

经合理的序列重组制备花生主要过敏原Ara h2低致敏衍生物

目的:构建经序列重组的Ara h 2表达载体,表达并纯化该蛋白,鉴定其低致敏原性.方法:根据已鉴定的Ara h 2 IgE抗原表位,利用基因工程技术将Ara h 2基因进行合理的组合,并将其序列进行合成,再将合成后的基因连入原核表达载体pET-32a(+)上,然后转入Origami宿主表达菌中;IPTG诱导表达;通过N...     

放线菌基因组大片段克隆载体及异源表达宿主改造的研究进展

大规模基因组测序发现放线菌基因组内包含有极丰富的天然产物合成基因, 是非常有价值的资源。放线菌基因组中负责天然产物合成的基因通常成簇存在。要想完整地克隆这些较大的基因簇并且进行功能研究, 或者通过异源表达激活原本沉默的天然产物合成基因簇, 需要大容量的载体系统和合适的异源宿主。本文重点介绍了放线菌中常用于基因组大片段克隆的载体及异源表达宿主改造的研究进展。     

植物基因工程中使用的报道基因

本世纪自70年代基因工程诞生以来,各种分子生物学技术相继出现。如限制性内切酶的使用,DNA重组技术的完善,DNA序列快速测定等,现在已经能通过多种转基因技术很容易将外源目的基因导入生物体中,怎样才能知道外源目的基因已经转入植物体中,这就需报道基因来探路。什么是报道基因？有些文献中提到的筛选基因、标志基因、指示基因基本上和报道基因类似。所谓报道基因是一个表达产物非常容易被检定的基因．把它的编码序列与调节基因表达的DNA序列相融合,形成一嵌合基因或与其他目的基因相融合,在调控序列控制下进行表达,从而用报道…     

利用CpG DNA甲基化酶M.SssⅠ共表达载体制备限制性内切酶NotⅠ

限制性核酸内切酶是DNA重组的重要分子生物学工具。由于其本身对DNA有切割作用导致其重组表达在技术上十分困难,产率低、提纯程序复杂。而商业化生产所采用的利用专一型甲基化酶保护宿主DNA的限制酶表达技术流程繁琐、实用性有限。为表达NotⅠ限制酶,采用来源于Spiroplasma sp.MQ1的DNA甲基化酶M.SssⅠ特异性甲基化CpG序列,甲基化后的DNA会免受识别位点中包含CpG序列的限制酶NotⅠ的切割。将甲基化酶M.SssⅠ导入大肠杆菌表达宿主ER2566后,M.SssⅠ基因在宿主中持续表达并甲基化宿主DNA成CpG甲基化样式;利用此表达体系制备限制性内切酶NotⅠ获得成功。并借助引入纯化标签经过简便的Ni亲和层析和阴离子交换层析2步层析洗脱纯化,制备了高活力高纯度的重组限制酶NotⅠ。此表达体系可应用于一系列识别位点中包含CpG序列的限制酶的表达。     

非随机方法构建酿酒酵母基因工程菌

酿酒酵母是基因工程产品研究和生产的一个重要表达系统,表达载体和宿主细胞是构成表达系统的两大要素,虽然外源基因表达的方式、强度主要由表达载体控制．但宿主细胞的选择对最终获取产品的质量和数量也具有十分关键的作用。酿酒酵母基因工程宿主菌除要求具有高的DNA转化效率、细胞生长密度和稳定性、低的内源蛋白水解酶活性外,还必须具备与表达载体相对应的营养缺陷筛选标记,用传统随机诱变方法得到的营养缺陷变异株,因含有本底和隐性突变,在细胞生长密度和稳定性方面往往不能满足基因工程产品研究和生产的要求,甚至不能有效地表达外源基因。本文报道用重组技术,通过非随机方法构建了酿酒酵母基因工程宿主茁。研究表明用该方法得到的宿主菌在细胞生长密度、稳定性和表达外源基因方面优于用传统随机诱变方法得到的宿主菌。     

重组DNA产物在哺乳动物细胞中的表达

重组DNA技术通过克隆的(即设计的)基因在适当宿主细胞中的表达,为大量生产从前难得的或全新的蛋白质的生产提供了可能性。最近已经明确,细菌表达系统常不适合复杂的真核蛋白,但引入哺乳动物细胞的基因的高水平表达,意味着动物细胞的大量发酵能为有价值的蛋白质的生产提供另一种重要的途径。     

雨生红球藻八氢番茄红素合成酶基因的克隆及表征

雨生红球藻是一种单细胞绿藻,在多种逆境胁迫条件下能够大量合成并迅速积累虾青素,其积累量最高可达细胞干重的4%,从而成为目前最理想的天然虾青素合成工具.八氢番茄红素合成酶(PSY)是虾青素合成途径中第一个限速酶.分离了八氢番茄红素合成酶基因(psy)的全长cDNA及基因组DNA.其全长cDNA包括1200个碱基,编码400个氨基酸,基因组DNA包括5个外显子,4个内含子.系统发育分析结果显示,绿藻的八氢番茄红素合成酶基因形成一个进化枝,它们与高等植物的psy亲缘关系比较近.通过GenomeWalking的方法,分离了psy基因约1kb的5′侧翼序列.将含有TATA-box和CAAT-box的297bp的序列与LacZ报告基因构成嵌合的表达载体,用基因枪法转化雨生红球藻.lacZ的瞬间表达检测结果表明,这段上游序列能够驱动lacZ表达,具有启动子活性.     

宏基因组克隆--微生物活性物质筛选的新途径

在现有技术条件下自然界存在的微生物95％以上未能培养,采用传统的分离培养筛选的途径寻找新的微生物生物活性物质受到局限;宏基因组是特定小生境中全部微小生物遗传物质的总和,直接抽提环境样品中的总DNA,利用适宜的载体克隆到替代宿主细胞中构建宏基因组文库,通过外源基因赋予宿主细胞的新性状或基于某些已知DNA序列筛选,寻找新的生物活性物质或基因,极大地扩展了微生物资源的利用空间,增加了获得新的生物活性物质的机会。     

宏基因组克隆——微生物活性物质筛选的新途径*

在现有技术条件下自然界存在的微生物95%以上未能培养,采用传统的分离培养筛选的途径寻找新的微生物生物活性物质受到局限;宏基因组是特定小生境中全部微小生物遗传物质的总和,直接抽提环境样品中的总DNA,利用适宜的载体克隆到替代宿主细胞中构建宏基因组文库,通过外源基因赋予宿主细胞的新性状或基于某些已知DNA序列筛选,寻找新的生物活性物质或基因,极大地扩展了微生物资源的利用空间,增加了获得新的生物活性物质的机会。     

新型的DNA序列测定策略:PCR产物直接测序

DNA序列的测定在现代分子生物学中的应用越来越广泛,传统的模板制备方法是将待测序列的DNA片段插入质粒或病毒载体中,然后让其在宿主细菌细胞中增殖.尽管这套方法已被简化和标准化,但由于其涉及到活细胞的保存和使用,不可避免地会带来诸如载体和宿主细胞基因发生突变等不利影响.     

MAR的结构、功能及其应用研究现状

真核细胞表达外源基因克服了原核细胞表达外源基因的种种不足(如mRNA的成熟、翻译后的加工),因而得到广泛应用。但真核细胞表达外源基因也有不足之处,即表达效率低。造成真核细胞外源基因表达效率低的原因有很多,如基因结构、表达载体、调控元件等,而宿主细胞染色质DNA对外源基因的影响是一个不可忽视的原因。人们在通过载体将外源基     

遗传工程技术公司基因拼接研究的几项重大成就和最新突破

近几年来,随着重组DNA技术或者叫基因拼接技术的发展,提出了许多新的方法来生产有治疗作用的人类蛋白质。这些方法都是基于将编码蛋白质的基因片段拼入细菌的正常DNA内,然后进行无性增殖,以微生物发酵法生产大量的人类蛋白质或其它有用物质。不仅如此,用基因拼接技术,还可对自然界中的天然药物进行鉴定,并将其中有明显用处的那些天然药物以更新更有效的基因拼接方法进行大量生产。     

抗菌肽AD与haFGF融合基因的合成及其表达

通过PCR技术和体外DNA重组技术将CecropinAD连接在haFGF改构体的5′端,构建成融合基因CADAF。将其克隆到表达载体pET3c上,然后转化到BL21(DE3)中经IPTG诱导表达。经DNA序列分析,合成的CADAF基因序列与设计序列一致。构建的CADAF基因在BL21(DE3)中获得了表达 。     

遗传工程技术公司基因拼接研究的几项重大成就和最新突破

近几年来,随着重组DNA技术或者叫基因拼接技术的发展,提出了许多新的方法来生产有治疗作用的人类蛋白质。这些方法都是基于将编码蛋白质的基因片段拼入细菌的正常DNA内,然后进行无性增殖,以微生物发酵法生产大量的人类蛋白质或其它有用物质。不仅如此,用基因拼接技术,还可对自然界中的天然药物进行鉴定,并将其中有明显用处的那些天然药物以更新更有效的基因拼接方法进行大量生产。     

Sirt3过表达载体的构建及表达

目的:在HEK293细胞中获得Sirt3全长基因,构建其高效真核表达载体。方法:提取人HEK293细胞总RNA,反转录合成c DNA,以特异性引物扩增Sirt3全长基因并克隆入pc DNA3.1载体,筛选阳性克隆进行序列测定后,鉴定其表达情况。结果:PCR扩增得到特异性的约1000 bp的片段,序列测定结果表明与国外已发表的序列完全一致;将构建的pc DNA3.1-Sirt3质粒转入AGS和SGC-7901细胞,检测到Sirt3的m RNA和蛋白表达水平均提高。结论:构建获得Sirt3基因高效真核表达载体,将用于Sirt3的功能研究。     

基因诱变、重组、克隆

920861克隆的外源基因在大肠杆菌中增加表达的可能性〔英〕/Venetianer,p.了Aeta Bioteehnol一1991,11(2)一129~133〔译自DBA,1991,10 (15),91一08439习 在异源宿主(如大肠杆菌)中合成并累积想要的(外源)蛋白产物是一个复杂的多步骤过程,并受到以下步骤的影响:i。提高基因拷贝数的方法,如采用高拷贝数载体;11.提高和控制转录率的方法,如使用强启动子;111。提高翻译率的方法,如选用适宜的Shine一Dalgaroo序列;iv.增加合成蛋白或肤稳定性的方法,如表达融合蛋白;v.提高重组质粒稳定性的方法;如使用无需抗生素而能选择连续出现的质粒的方法;…     

核酸疫苗--一种新型疫苗

核酸疫苗是指将含有编码某种抗原蛋白基因序列的质粒载体作为疫苗,直接导入动物细胞内,从而通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,达到免疫的目的.核酸疫苗又称为基因疫苗或裸DNA疫苗,这种免疫称为核酸免疫、基因免疫、DNA介导的免疫以及遗传免疫等.