影响农杆菌介导的柑桔基因转化因素研究

以柑桔（ Ｃｉｔｒｕｓ） 中的枳壳、甜橙、柠檬、四季桔上胚轴为对象, 进行了农杆菌介导的柑桔衰退病病毒外壳蛋白基因转化影响因素研究, 最终将衰退病病毒外壳蛋白基因转入枳壳。研究结果表明： 以卡那霉素为选择试剂, 且外植体水平放置时, 枳壳的选择浓度为５０μｇ／ｍＬ, 其它品种为２０ ～３０μｇ／ｍＬ。外植体与农杆菌的共培养时间３ ｄ 最好, ７０ ～１００μｍｏｌ／Ｌ的酚类化合物（Ａｓ） 的添加对外植体Ｇｕｓ 瞬时表达阳性率有明显促进作用。转化所用外植体年龄以２０ ｄ 最好, 品种之间抗性芽产生率与Ｇｕｓ 阳性芽产生率明显不同。以质粒ＤＮＡＮｃｏⅠ酶切产物为探针, 进行了Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析, 结果表明外源基因已稳定整合到了枳壳植株的核基因组中。     

柑桔遗传转化技术的研究进展

柑桔是当今世界种植面积最大的果树。遗传转化技术的发展为柑桔育种提供了一条全新的途径。该文就柑桔遗传转化的研究进展 ,包括外源DNA的直接转化与农杆菌介导的转化 ,作一简要的综述 ,并对当前研究中存在的问题及今后的研究方向作了进一步的探讨。     

遗传转化技术在柑桔育种中的研究进展

本文概述了遗传转化技术在柑桔育种中的研究进展,主要内容包括：遗传转化的常用方法,柑桔遗传转化研究的现状,柑桔遗传转化研究中存在的主要问题及发展前景     

甲型肝炎病毒衣壳蛋白融合基因植物表达载体的构建 与遗传转化柑桔的研究

基因工程领域的研究进展使得植物体成为具有重要经济价值的药用蛋白的生产体系。以含甲型肝炎病毒结构基因cDNA的克隆载体pCDNAⅡA16为模板,用甲型肝炎病毒衣壳蛋白融合基因特异引物进行PCR扩增,得到全长2.2kb衣壳蛋白融合基因序列。经测序鉴定后正向克隆于植物表达载体pBI121中,衣壳蛋白融合基因位于pBI121质粒T-DNA左右边界区间内,处于CaMV35S启动子控制之下。经限制性内切酶分析和PCR鉴定后利用冻融法将重组质粒pBI121-A导入根癌农杆菌LBA4404。以锦橙 (Citrus. Sinensis Osbeck) 上胚轴为转化材料,通过根癌农杆菌介导法将衣壳蛋白融合基因转 化到植物基因组中。120株转化外植体经卡那霉素50 mg/L筛选,其中13株生长状况良好未出现白化现象的拟转化芽微嫁接到实生砧木继续培养。PCR分析证明,13株拟转化植株中有5株植物基因组中已导入甲型肝炎病毒衣壳蛋白融合基因,转化率为4.1%。此研究是对遗传转化柑桔表达外源蛋白的初步探讨,为进一步研究食用疫苗开辟了新途径。Abstract: The use of edible plants for the production and delivery of vaccine proteins could provide an economical alternative to fermentation systems. The construction of the plant expression vector pBI121-A was reported, which contained a fusion gene encoding hepatitis A capsid proteins. The gene was located between the left and right Ti border sequences under the control of CaMV35S promoter. The vector was identified via PCR and restriction enzyme analysis and was introduced into Agrobacterium tumerifacience LBA4404. The transgenic Citrus plants were produced by Agrobacterium-mediated transformation of epicotyl segments. 13 putatively transformed plants through the kanamycin selection were micrografted onto the seedlings. The presence and integration of the transgene had been verified by PCR analysis. The result showed that five transformants were integrated and the transformation efficiency was 4.1%.     

高等植物的质体基因转化

质体基因转化技术由于其独特的优越性,已开始成为植物基因工程中新的研究热点。本文对质体基因转化技术所面临的几个关键性问题,包括外源基因导入方法、外源基因的整合及表达、质体转化体的有效筛选标记等进行了讨论,同时对质体基因转化的优越性及其应用与发展前景进行了综合评述。     

绿色荧光蛋白基因作为报告基因在水稻基因转化中的应用研究

本研究中 ,构建了含有编码绿色荧光蛋白的改进型基因质粒pJPM5。用基因枪法分别把pJPM5和另一带有绿色荧光蛋白基因的质粒pSBG70 0转入水稻TNG6 7愈伤组织。用South ern杂交法证实了转基因的存在 ,而且表明多数转基因植株含有 1到 8个拷贝的转基因。取 2个月的转基因植株上的叶片用于分析绿色荧光蛋白基因表达。用SLM - 80 0 0荧光分析仪定量测定绿色荧光蛋白。多数转基因植株具有很高的绿色荧光蛋白信号。虽然水稻植株有少量自发荧光 ,但是绿色荧光蛋白基因表达出的绿色荧光蛋白信号比植株的自发荧光强得多 ,其测定不会受自发荧光的太大影响。在荧光显微镜下观察到了绿色荧光蛋白基因的表达。借助观察分析绿色荧光蛋白基因的瞬时表达 ,本研究还发现基因枪法转化中 ,如果两枪的气压为90 0psi& 135 0psi,比两枪的气压都为 90 0psi或者 135 0psi更好 ,因其能使质粒进入更多的细胞。研究结果表明 ,绿色荧光蛋白基因可以作为水稻 (甚至小麦、玉米 )转基因研究中的报告基因。研究还显示 ,MAR序列能明显增强绿色荧光蛋白基因的表达能力 (这一结果在另文讨论 ) .     

基因枪法介导GNA基因遗传转化甘蔗的研究

目的:将含有雪花莲外源凝集素(GNA)基因的植物表达载体用基因枪法分别导入一个果蔗和一个糖蔗品种中,以期获得转基因植株。方法:将GNA基因插入到植物表达载体上,构建出不同选择标记、不同启动子的表达载体,并用基因枪法将之导入甘蔗胚性愈伤组织,分别在G418、PPT和Hyg的选择压力下,筛选抗性植株,并进行分子杂交鉴定。结果:通过斑点杂交和PCR-Southern杂交证明GNA基因已整合到甘蔗基因组中。结论:用基因枪法成功获得了含有GNA基因的甘蔗转化株,为培育抗甘蔗绵蚜(Ceratovacuna lanigeraZehnther)的新品种提供了基础。     

ACC脱氨酶基因转化白兰瓜的初步研究

用带有ACC脱氨酶基因和卡那霉素抗性基因（NptⅡ,作为报告基因）的工程根癌农杆菌转化白兰瓜子叶。通过组织培养,得到具有卡那霉素（Km)抗性的再生小苗,经NptⅡ报告基因的PCR扩增,ACC脱氨酶基因的Southern点杂交以及ACC脱氨酶活性的生理生化检测可知,ACC脱氨酶基因已成功转入白兰瓜子叶再生小苗,而且不同植株的真叶中表现出不同水平的ACC脱氨酶活性。     

大麦转化体系的改进及TrxS基因的转化

以啤酒大麦品种“晋引6号”的幼胚为转化起始材料,用基因枪法将分别携带有目的基因(TrxS)和除草剂基因(筛选基因,Bar)的两个质粒进行了共转化,同时对基因转化的相关技术和植株再生的培养方案进行了优化。结果表明,受体材料宜选用预培养15d的幼胚;在培养前2周添加1mg／L ABA可抑制胚芽萌发而且有助于胚性愈伤组织的形成;1．0mg／L ZT与0．1mg／L IAA激素配比可有效促进愈伤组织的分化。利用优化的培养条件,经在含3～5mg／L筛选剂PPT的培养基上筛选、再生及生根培养。共在178块抗性愈伤组织上获得11株再生植株,再生率达到6．2％,经对T0、T1、T2代PCR、nested PCR和Southern杂交检测表明,TrxS基因已经稳定整合到大麦基因组中且遗传稳定、结构完整。     

基因转化小实验

为了贯彻实施生物课程标准 ,帮助一线教师更好地开展探究式教学 ,本刊特设“探索引航”栏目 ,将陆续介绍一些生物学探究性教学的选题和方法 ,指导教师结合当地条件 ,开展多性化的探究性教学。也希望广大读者踊跃投稿 ,共同办好该栏目。     

低压脉冲电泳介导的外源基因转化部分酶解的水稻小细胞团

开发了一类新型的低压脉冲电泳法介导外源基因进入水稻细胞的转化系统。本系统以水稻部分酶解小细胞团为受体,采用低压脉冲电泳推动质核DNA进入水稻细胞。以报告基因GUS酶活性为指标,借以测定转化了的水稻细胞。最佳的组合处理可以获得8.2％的转化频率。文中对低压脉冲电泳转移外源基因的条件亦作了讨论。     

A NEW COLLOIDAL LIPIDIC SYSTEM FOR GENE THERAPY

ABSTRACT

A novel type of liposomal vector for gene therapy is described (Artificial Virus Particles; AVPs). This vector is based on the composition of retroviral envelopes, serum-resistant and non-toxic and smaller than 200 nm in size. The DNA is condensed using low molecular weight branched PEI. Equipment of these particles with a cyclic RGD peptide ligand as targeting device renders them selective for tumor endothelial and melanoma cells expressing high levels of α_vβ₃-integrins, and allows for an efficient delivery of the enclosed genetic material. The specificity of the vector system for melanoma cells could be further improved by using a melanocyte-specific tyrosinase promoter to drive transgene expression.     

LIPOPLEX-MEDIATED STABLE GENE TRANSFER INTO HeLa CELLS

Unilamellar cationic liposomes containing phosphatidylcholine, L-α-phosphat-idyl-DL-glycerol, cholesterol and N,N-dimethylaminopropylaminyl succinyl cholesterol in lipoplexes with plasmid ptkNEO transfected HeLa cells efficiently in the presence of G418.     

甜橙辣椒红/辣椒玉红素合成酶同源基因的克隆(简报)

类胡萝卜素是由8个类异戊二烯单位组成的一类碳氢化合物及其氧化衍生物。它存在于所有植物中,并在光合作用及光保护等生理过程中起着重要作用。同时,类胡萝卜素也使果实呈现各种色泽。柑桔成熟果实的果皮及果汁色泽也主要是由于类胡萝卜素引起。果皮中类胡萝卜素种类及含量决定了     

一种新的柑桔属植物精油资源

用毛细管气相色谱和色谱-质谱联用技术分析了蟹橙(Citrus junos(Sieb)Tan.cv.Xiecheng Hort.)叶精油的化学成分,共鉴定出37个成分,其中N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯占精油总量的56.11～64.14％,它是经柱层析分离,IR.HNMR和~(13)CNMR鉴定的。像这种含有大量含氮化合物的植物精油在自然界中是不多见的,在我国尚属首次发现。由于这种化合物在香料工业上具有多种用途,所以该精油很可能是一种新的有价值的精油资源。     

完整植物细胞的电击基因转移

本文研究了高压电脉冲对大白菜悬浮细胞通透性和成活率的影响。与原生质体比较,完整细胞可以耐受更高幅值的电脉冲。采用45℃热激,酸性介质(pH4.0)或巯基乙醇预处理黄瓜、水稻和小麦完整植物细胞,有效地提高了导入率。于黄瓜和水稻未去壁的完整细胞,成功地实现了外源 cAT(氯霉素乙酰转移酶)基因的电击导入和瞬间表达。     

基因转移治疗血友病B的动物试验和安全性探讨

本文报道了皮肤成纤维细胞基因治疗血友病Ｂ的新西兰大白兔试验及安全性检测。转有人凝血因子ＩＸｃＤＮＡ的兔皮肤成纤维细胞包埋于胶原基质中,然后进行不同方式的自体或同种异体移植,移植兔血浆中人ＩＸ因子蛋白有高水平的表达且持续稳定,腹腔移植有ＲＳＦ－ｐＣＭＶＩＸ转化细胞的兔血浆中人ＩＸ因子表达水平达１００ｎｇ／ｍｌ．持续５个月以上,腹腔移植有ＲＳＦ－ｐＣＭＶＩＸｌ转化细胞的兔血中人ＩＸ因子表达水平达２９５     

FLUORESCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER DYE NUCLEOTIDE TERMINATORS: A NEW SYNTHETIC APPROACH FOR HIGH-THROUGHOUT DNA SEQUENCING

Fluorescence resonance energy transfer (FRET) based dye-nucleotide terminators (10–13) were designed, synthesized, and formulated with Thermo Sequenase? II DNA polymerase into a robust kit for high throughput DNA sequencing. The key energy transfer (ET) rigid and linear linker (2), required for the syntheses of energy transfer cassettes (6–9) was synthesized via Heck coupling reaction on t-Boc-L-4-iodo-phenylalanine (1) with N-TFA-propargylamine.     

激光微束技术及其在基因转移研究中的应用

本文中介绍了我们设计和安装的一套激光微束系统,该系统分为二部份:激光源和显微镜.工作波长355nm是由电子调Q Nd:YAG激光经KDP倍频和混频后得到的.这束光从显微镜的左边引入45°反射,再经×100物镜聚焦.光束直径小于1μ.这束激光可给细胞打孔,约在1秒内小孔自行修复,在修复之前荧光物质和质粒可以扩散进细胞.我们成功地把GUS基因导入烟草花粉细胞中并得到瞬间表述,还把DAPI-λDNA导入M85胃癌细胞必观察到兰色荧光.从本工作初步表明这种导入方法很有发展前途.