毒素源性大肠杆菌定居因子抗原CS6基因的克隆

通过构建人源毒素源性大肠杆菌野生株E519/66A大质粒的基因文库,成功地筛选出能表达定居因子抗原CS6菌毛的阳性克隆,初步确定了克隆DNA片段的限制性内切酶图谱。CS6抗原的编码和调控基因集中在一大小为4.6kb的DNA区段中,该片段能产生两种分子量大小不同、但抗原反应交叉的菌毛蛋白。本研究获得的CS6抗原阳性的重组菌株可用于人源ETEC多价疫苗的研制,克隆的基因片段亦可作为研究CS6菌毛蛋白基因表达及调控的基础。     

CS3抗原基因的表达及纤毛装配元件的研究

在肠毒素大肠杆菌(ETEC)的已知定居因子中,CS3是临床分离株中最常见的抗原之一。为了研究CS3纤毛装配的基本元件,绘制了CS3亚基结构基因和辅助蛋白编码区的限制酶谱。通过亚克隆的亚基基因和不同辅助蛋白基因之闻的互补性表达结果,确定了CS3纤毛装配所需要的辅助蛋白的DNA功能片段。微细胞分析结果显示,CS3基因的有效表达和纤毛的装配至少需要6条蛋白多肽分子量分别为15kDa,17kDa,24kDa,27kDa,48kDa和90kDa。除了15／17kDa的蛋白多肽为CS3亚基外,其余的蛋白多肽参与CS3亚基的转运及纤毛的装配。根据以上结果初步确定了上述相关基因的相对位置。     

肠毒素大肠杆菌定居因子CS6蛋白的纯化和抗体制备

将大肠杆菌E519／66A在CFA固体培养基上培养,收菌后经热水浴脱蛋白、硫酸铵分级盐析、超速离心及S-200柱纯化,获得了相对分子量约14600的高纯度CS6蛋白。用其免疫家兔,然后颈动脉采血。ELSIA法检测血清,测得效价为1：32000。Westem印迹证实CS6抗原蛋白可特异性结合抗CS6多克隆抗血清。本研究建立了分离纯化肠毒素大肠杆菌定居因子CS6抗原蛋白的有效方法;获得了高纯度的野生型定居因子抗原CS6蛋白及相应的多克隆抗血清。对于进一步研究肠毒素大肠杆菌腹泻疫苗具有重要意义。     

肠毒素大肠杆菌定居因子CS6抗原基因在痢疾杆菌中的表达

通过体外重组的方法,将asd基因插入重组表达质粒,使抗生素抗性失活,并与弗氏志贺氏菌FWL01构成宿主-载体平衡致死系统. 通过蛋白质印迹结果表明,在没有抗生素条件选择的情况下,可稳定表达肠毒素大肠杆菌定居因子抗原CS6. 重组菌通过口服和鼻饲免疫小鼠后,可以诱生CS6血清IgG抗体;同时可以检测到分泌型IgA产生,表明重组菌可以诱导相应的黏膜免疫反应.     

用人源肠毒素性大肠杆菌CS3菌毛构建新型呈现载体

根据对人源大肠杆菌菌毛CS3亚单位亲水性、表位、二级结构和柔韧性计算机预测结果,以CS3亚单位第72位氨基酸残基之后作为外源表位的插入位点,构建了一种新的表面呈现载体pCSX72。用该载体分别表达口蹄疫病毒（FMDV）的VP1表位和C-myc的十肽表位（410-419aa）。SDS-PAGE结果以及电镜和免疫电镜观察证明,插入的外源表位和CS3亚单位以杂合菌毛的形式呈现在菌体表面。ELISA检测结果表明,pCSX72表达的杂合蛋白的抗原性较之其他插入位点的载体要高得多。用重组细菌腹腔免疫小鼠,能够诱发机体对杂合蛋白的双重免疫应答。构建的表面呈现载体可望成为构建多价疫苗的有力工具。     

肠毒素源性定居因子CS6在减毒伤寒沙门氏菌中表达及免疫原性的研究

将编码肠毒素源性大肠杆菌定居因子抗原CS6基因克隆至pXL670,转化asd基因突变的E.coli X6097,获得重组质粒pSS64,再将后者转化至减毒的△aroA、△aroC、△asd伤寒沙门氏菌,构建了无药物抗性且稳定的大肠杆菌和伤寒双价菌苗候选株。小鼠腹腔免疫和攻击实验表明,该菌株对伤寒沙门氏菌毒株的攻击具有良好的保护作用。家兔免疫实验证明,该菌株能产生抗CS6和伤寒菌Vi抗原的血清抗体。     

口服型HCV融合抗原DNA疫苗在小鼠诱导免疫应答

将编码一个外源信号肽、一个通用型辅助性T淋巴细胞抗原表位和HCV核心 包膜蛋白E2融合抗原基因的真核表达质粒pST CE2t(DNA疫苗 )转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL72 0 7.将该重组菌口服接种BALB c小鼠 3次 .小鼠的抗HCV核心和E2抗体阳转率分别达 6 0 %和 70 % .体外以重组HCV核心或E2抗原刺激小鼠脾细胞 ,均使之发生明显的增殖反应 ,且小鼠脾细胞能有效杀伤表达HCV核心抗原的同系骨髓瘤细胞SP2 0 .这为研制高效免疫、成本低廉、接种方便的HCV疫苗提供了一个新的可行途径     

肠毒素大肠杆菌定居因子CFA／I和CS6在减毒福氏志贺氏菌中的共表达

定居因子CFA／I和CS6是肠毒素大肠杆菌(ETEC)中重要的两种优势抗原,是ETEC疫苗研制的首选组分。采用基因重组技术将二者构建在asd基因为选择标记的重组质粒上,与asd基因缺失突变型减毒福氏志贺氏菌FWL01构成宿主．载体平衡致死系统,实验结果表明,重组疫苗候选株能够稳定表达CFA／I和CS6抗原,并可在菌体表面形成相应菌毛。重组菌口服免疫BALB／c小鼠后,可诱生相应的抗CFA／I和CS6的特异性血清抗体IsG和分泌型抗体sIgA．说明以志贺氏菌为载体．可以构建同时表达多个定居因子抗原的ETEC多价菌苗。     

肠毒素大肠杆菌定居因子CFA/Ⅰ和CS6在减毒福氏志贺氏菌中的共表达

定居因子CFA/I和CS6是肠毒素大肠杆菌 (ETEC)中重要的两种优势抗原 ,是ETEC疫苗研制的首选组分。采用基因重组技术将二者构建在以asd基因为选择标记的重组质粒上 ,与asd基因缺失突变型减毒福氏志贺氏菌FWL0 1构成宿主 载体平衡致死系统。实验结果表明 ,重组疫苗候选株能够稳定表达CFA/I和CS6抗原 ,并可在菌体表面形成相应菌毛。重组菌口服免疫BALB/c小鼠后 ,可诱生相应的抗CFA/I和CS6的特异性血清抗体IgG和分泌型抗体sIgA ,说明以志贺氏菌为载体 ,可以构建同时表达多个定居因子抗原的ETEC多价菌苗     

表达毒素源性大肠杆菌定居因子抗原CS6的一组基因的克隆

人源毒素源性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.Coil ETEC)是引起婴幼儿及旅游者腹泻的主要致病菌。ETEC的致病因子包括定居因子抗原 (Colonization factor antigens,CFAs)和肠毒素。大多数ETEC菌株均能产生抗原特异的菌毛,介导细菌与宿主小肠粘膜表面并在粘膜表面上受体的结合,使得细菌能定殖于粘膜表面并在粘膜的功能性清除中存活下来。已经报道的定居因子抗原包括CFA/Ⅰ,CFA/Ⅱ、CFA/Ⅲ、CFA/Ⅳ(PCF8775)、PCF09和PCFO159等。CFA/Ⅰ和CFA/Ⅲ均由单一的菌毛亚基构成,CFA/Ⅱ、CFA/Ⅳ则由多种表面抗原(colisurface antigen,CS)复合而成。所有的CFA/Ⅳ阳性菌株均表达CS6抗原,其中有些同时表达CS4或CS5抗原。CS4和CS5都是直径6～7nm的菌毛,能引起人和牛血红细胞的甘露糖抗性的凝集反应(MRHA)。迄今为止,没有观祭到CS6明显的菌毛结构,CS6也不能引起MRHA阳性反应。然而动物实验的结果表明,CS6是CFA/Ⅳ复合抗原中一种对定居作用最重要的抗原”,。本研究组已经通过分子克隆的手段获得了能分别表达CFA/Ⅰ和CS3抗原的重组菌株,用于人源ETEC疫苗的研究。本文报道了表达CS6菌毛抗原的DNA片段的克隆,并用免疫吸附制备的CS6抗血清测定了重组菌株表达的菌毛蛋白。     

NLRP6在抗细菌感染免疫中的作用研究进展

含热蛋白结构域的核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白6(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 6,NLRP6)是宿主固有免疫重要的胞内模式识别受体之一,参与机体感染、炎症、肿瘤和代谢性疾病的调节。它可通过感知细菌、病毒、真菌和寄生虫等病原生物及其产物,如革兰氏阳性菌脂磷壁酸(lipoteichoic acid, LTA)和病毒双链RNA,调节机体抗感染免疫效应,减弱或增强宿主的抵抗力,从而影响感染的转归。本文就NLRP6的结构与功能及其在抗细菌感染免疫中的作用研究作综述。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 EspA和EspB蛋白的重组表达及其免疫效果

目的：通过DNA重组技术表达肠出血性大肠杆菌（EHEC）0157：H7的EspA和EspB蛋白,并分析它们的免疫保护性。方法：采用PCR技术从EHEC0157：H7基因组中扩增espA和espB基因,连接至pET-22b（4-）载体上,转化至宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达,用亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE测定其相对分子质量,免疫小鼠分析其免疫保护性。结果：重组espA和espB基因片段的测序结果与GenBank中的相应基因序列完全一致,一致性均为100％;得到了纯度为95％以上的重组EspA和EspB蛋白,免疫小鼠所得到的抗体效价均为10^6。结论：重组EspA和EspB蛋白获得了可溶性表达,表达的蛋白具有良好的免疫保护性,为进一步制备疫苗奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6抗原和HSP70截短后C端片段融合蛋白的克隆、表达及免疫原性研究

<正>结核病(TB)仍是一个主要的威胁世界公共健康的问题。选定结核分枝杆菌(MTB)的免疫原,以期能有效诱导保护性免疫应答是开发研究TB疫苗的最终目的。