电脉冲和布吡卡因增强A型肉毒毒素DNA核酸疫苗的免疫效果

目的：考查DNA疫苗注射免疫后电脉冲和布吡卡因佐剂化DNA疫苗递送方式对A型肉毒毒素DNA核酸疫苗免疫效果的影响。方法：A型肉毒毒素DNA复制子疫苗和传统DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠后电脉冲和布吡卡因佐剂化DNA后再肌肉注射免疫小鼠;检测免疫小鼠的抗体和细胞水平,并分析抗体亚类。结果：电脉冲和布吡卡因这二种递送方式均增强DNA复制子疫苗和传统DNA疫苗的体液免疫和细胞免疫效果;电脉冲提高DNA疫苗免疫效果更为明显,并且电脉冲和布吡卡因组合这种递送方式增强DNA疫苗体液免疫和细胞免疫水平最高;与传统DNA疫苗相比,A型肉毒毒素DNA复制子疫苗在这些递送方式下均诱导产生了更好的特异性体液免疫和细胞免疫应答,并且这些递送方式没有改变DNA疫苗的Th1/Th2免疫应答特性,即DNA复制子疫苗诱导产生Th1/Th2混合免疫应答但偏向于Th2途经,而传统DNA疫苗则完全偏向于Th2途经。结论：电脉冲和布吡卡因增强DNA复制子疫苗和传统DNA疫苗的免疫效果,是提高DNA疫苗免疫原性的良好策略。     

增强DNA疫苗免疫应答的新进展

DNA疫苗为编码抗原蛋白的真核表达载体,注入体内后在原位表达所编码的抗原并诱导免疫应答,在预防感染、治疗自身免疫性疾病、过敏性疾病和肿瘤等疫病中有着很好的应用前景。但与灭活疫苗相比,其免疫效价还比较低。有多种策略能够增强或调节DNA疫苗诱导的免疫应答,其中,作为外源基因载体的质粒的组成及插入的有关基因均可直接或间接地影响免疫反应的效果,在构建DNA疫苗质粒时,加入细胞因子、融合信号、泛素等基因以及ISS序列,另外还可以通过设计一些对抗原提成细胞有影响的分子共注射,以及加入转移分子,都可以明显增强DNA疫苗的免疫效果,从而有利于研制更有效的DNA疫苗。     

携带EBV-LMP2基因的DNA疫苗、腺相关病毒疫苗和腺病毒疫苗免疫小鼠的特异性细胞免疫应答

细胞免疫应答, 尤其是CD3⁺CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL), 在控制病毒感染中扮演着重要角色. 鼻咽癌(nasopharyngenl carcinoma, NPC)与EB病毒(epstein-barr virus, EBV)持续感染密切相关, 在鼻咽癌疫苗的研究中, 人们将研究重点放在增强特异性抗病毒CTL应答上. 本研究单独或联合使用表达EB病毒潜伏膜蛋白抗原2(epstein-barr virus latent membrane protein 2, EBV-LMP2)的DNA疫苗、腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)疫苗、非复制5型腺病毒疫苗(Ad5), 分别于0, 2, 4周肌肉注射免疫4~6周龄的雌性Balb/C小鼠, IFN-γ 免疫斑点法检测EBV-LMP2特异性细胞免疫应答水平. 疫苗诱导的特异性细胞应答水平与疫苗的免疫策略有关. 其中, 使用3种载体疫苗联合免疫的效果最好, 其次则是先使用DNA疫苗免疫两次, 再用腺病毒疫苗加强免疫一次的联合免疫方法. DNA疫苗和AAV疫苗单独免疫能够诱导出特异性的CTL, 但与联合免疫相比诱导的应答水平很低. 结果表明, 使用DNA, AAV和腺病毒载体疫苗联合免疫, 能够更好地诱导机体产生特异性细胞免疫应答, 为鼻咽癌的防治提供了很好的疫苗策略.     

IL-15基因佐剂对HIV-1B亚型gp160DNA及腺病毒载体疫苗的免疫效果的影响

本研究构建了IL15质粒以评估其对表达HIV-1gp160的DNA和腺病毒5型载体疫苗的免疫效果的影响。我们构建表达IL15的质粒pVR-IL15,将pVR-IL15联合pVR-HIVgp160初免Ad5-HIVgp160加强方式免疫BALB/c小鼠,用IFN-γELISPOT和ELISA等方法比较疫苗单独免疫组小鼠与疫苗加IL15佐剂组小鼠诱导的细胞免疫和体液免疫反应的强度。结果显示疫苗加IL15佐剂组小鼠诱导的细胞免疫反应和体液免疫反应比疫苗单独免疫组小鼠相均有显著增强。构建的IL15基因佐剂可以增强HIV DNA疫苗初免和腺病毒疫苗加强免疫策略的免疫效果。     

IL-12对巨细胞病毒DNA疫苗免疫增强作用的研究

白介素12(interleukin 12,IL-12)主要和细胞免疫应答有关,是免疫过程中重要的调节因子。本研究探讨IL-12对编码巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)即刻早期基因IE1的DNA疫苗的免疫增强作用。将CMVIE1质粒DNA单独或与编码IL-12的质粒DNA共同免疫小鼠,然后用致死量病毒攻击小鼠。通过检测小鼠体内诱导的细胞免疫应答、小鼠的存活率、体重丢失率、器官中的病毒滴度等来评价IL-12对疫苗免疫的佐剂效果。结果显示,与单独疫苗免疫组相比,IE1 DNA联合IL-12 DNA免疫组能够在小鼠体内诱导更高的细胞免疫应答水平,同时能够降低器官中的病毒滴度,显著提高保护率,从而更好地抵抗病毒攻击。实验证明,IL-12能够作为巨细胞病毒IE1 DNA疫苗的佐剂,提高免疫保护效果。     

免疫共刺激分子OX40L对乙型肝炎核酸疫苗的免疫佐剂作用

[目的]为了进一步增强HBV DNA疫苗的免疫反应,本研究将共刺激分子OX40L 作为HBV DNA疫苗的分子佐剂免疫小鼠,旨在探讨共刺激分子OX40L对HBV DNA疫苗诱导体液和细胞免疫应答的影响.[方法]我们将HBV DNA疫苗(pcDS2)单独或联合共刺激分子质粒pOX40L免疫C57BL/6小鼠;分别在第0,2,4周进行免疫,在第6周检测抗-HBs IgG、IgG1和IgG2a,T淋巴细胞增殖指数,细胞因子表达水平和体内细胞毒性T淋巴细胞杀伤作用(CTL)等免疫学指标.[结果]pceDS2联合pOX40L免疫组小鼠的抗-HBs水平显著提高,抗-HBs IgG亚类以IgG2a占优;免疫小鼠的T淋巴细胞体外经乙型肝炎表面抗原(HBsAg)刺激后,联合免疫组刺激指数(SI)明显高于pcDS2组;联合免疫组CD4 + T淋巴细胞的IL-4和IFN-γ表达水平及CD8 + T淋巴细胞的IFN-γ表达水平显著升高;DNA疫苗免疫的各组小鼠,HBsAg特异性体内CTL高于对照组,其中联合免疫组小鼠的体内CTL杀伤作用最强.[结论]共刺激分子OX40L不仅能增强HBV DNA疫苗诱导特异性体液免疫应答,还能增强特异性细胞免疫反应,尤其增强体内CTL的杀伤活性,为HBV DNA疫苗的研究奠定了基础.     

HIV-1 p24 DNA和P24蛋白联合免疫小鼠的效果

DNA疫苗能够诱导机体产生特异的细胞免疫和体液免疫反应,在肿瘤和感染性疾病的疫苗开发中显示出巨大的潜能。以HIV-1核心蛋白P24为抗原基因,构建pVAX1-p24 DNA,经Western blotting和动物活体成像检测证明,pVAX1 DNA携带的外源基因可以在293T 细胞和小鼠肌肉组织有效表达。采用不同的免疫策略免疫BALB/c小鼠 (DNA/DNA,DNA/Protein),实验结果表明：pVAX1-p24单独免疫BALB/c小鼠,可诱导明显的体液免疫及细胞免疫反应;pVAX1-p24与P24蛋白联合免疫诱导的体液免疫反应高于pVAX1-p24单独免疫,所获得的抗体滴度是单独免疫的7.3~8.0倍,但细胞免疫反应则不及单独免疫组。研究结果表明采取不同的免疫策略可以诱导产生不同的免疫反应,根据具体情况调整免疫策略将获得更好的免疫效果。这些研究为艾滋病疫苗的研发提供了实验依据。     

从DNA疫苗到耐受疫苗:全新的适应症和抑炎前景

DNA疫苗技术从1990年代发现到至今,已经创造成功了4个临床兽用疫苗或产品,并仍然有数十个产品正在临床验证的不同阶段。通过不断提高DNA质粒进入体细胞的效率,DNA疫苗将具有更强的免疫应答效率,从而使得DNA疫苗走向更多和更广泛的临床应用。DNA疫苗不仅可以增强机体免疫系统的应答反应,利用其与蛋白质疫苗共免疫的方式也可以产生特异性的免疫耐受反应用于抑制免疫反应。基于DNA疫苗的诱导免疫耐受的疫苗技术开辟了全新的过敏性疾病和自主免疫疾病的干预领域,具有重要的临床潜力和应用前景。     

DNA疫苗佐剂研究进展

DNA疫苗在免疫应答中能诱导机体产生持久的体液免疫和细胞免疫,然而DNA疫苗刺激机体免疫应答能力往往比常规疫苗引起的免疫反应弱。最近研究表明:使用DNA疫苗佐剂如细胞因子、CpGODN、补体C3d等有助于提高DNA疫苗的免疫效价。就DNA疫苗佐剂的研究进展做一综述。     

HIV-1复制型DNA疫苗与非复制型重组痘苗病毒疫苗在小鼠体内细胞免疫效果的研究

目的:用HIV-1复制型DNA疫苗和非复制型重组痘苗病毒疫苗(rNTV-C)进行单独免疫和联合免疫的研究(2种疫苗分别包含HIV-1 B’/C亚型的gp160、gag-pol、rev-tat-nef等6种基因),以了解这2种新型HIV疫苗单独免疫及联合免疫的效果,并为临床免疫方案的制定提供实验依据。方法:将HIV-1 DNA疫苗和rNTV-C疫苗免疫BALB/c小鼠,设计rNTV-C单独免疫组、DNA单独免疫组,以及DNA初免、rNTV-C加强的联合免疫组,并设计不同免疫途径和不同剂量的各种组合。用IFN-γELISPOT检测各组的细胞免疫效果,用统计学方法分析比较各组细胞免疫效果的差异。结果:DNA疫苗和rNTV-C疫苗单独免疫时,二者都能诱发针对各抗原的特异性免疫反应;联合免疫能够诱发比DNA或rNTV-C单独免疫都强的特异性细胞免疫反应。统计分析显示,2种疫苗采用肌肉注射途径的免疫效果显著高于皮内注射,1μg和5μg DNA疫苗的免疫效果差异不显著,而1×108 PFU的rNTV-C比2×107PFU的免疫效果要强。结论:联合免疫策略能够显著增强HIV-1疫苗各抗原的免疫原性,通过对2种HIV-1疫苗单独免疫及二者联合免疫的细胞免疫反应的分析比较,确定了较好的免疫方案,为疫苗临床前免疫效果评价和临床方案的制定提供了实验依据。     

DNA疫苗免疫佐剂的研究进展

DNA疫苗是最近几年从基因治疗研究领域发展起来的一种新型疫苗,它能诱导机体产生持久的体液免疫和细胞免疫应答,能够抗病毒,细菌和寄生虫的感染,对自身免疫性疾病和过敏性疾病有一定的疗效作用。但与传统的灭活疫苗相比,其免疫效价还比较低,最近的研究表明：联合使用DNA疫苗和疫苗佐剂如细胞因子,协同刺激分子等有助于提高DNA疫苗的免疫效价,这一发现有利于研制更有效的DNA疫苗,本文就通过使用免疫佐剂提高DNA免疫效价的最新进展做一综述。     

核酸疫苗佐剂的研究进展

免疫佐剂是一种免疫调节剂,可增强抗原的免疫原性、提高免疫效果。为增强疫苗的免疫原性,在病毒性疫苗、DNA疫苗、多肽疫苗的研制中通常需加入免疫佐剂。随着DNA疫苗研究的深入和扩展,推动了用于提高DNA疫苗免疫效果的免疫佐剂的研究。本文就常用佐剂的研究进展作一综述。     

鼠巨细胞病毒 IE-1核酸疫苗和灭活疫苗联合免疫抗病毒感染的研究

巨细胞病毒（Cytomegalovirus,CMV）在人群中感染普遍,对婴幼儿及免疫低下人群中造成严重疾病,目前还没有针对该病毒的商品化疫苗。本研究以BALB/c小鼠为动物模型,探讨鼠巨细胞病毒（Murine cytomega-lovirus,MCMV）IE-1 DNA疫苗和MCMV灭活疫苗联合免疫抗MCMV感染的免疫保护效果。将编码IE-1基因的DNA疫苗（pIE-1）通过肌肉注射辅以电穿孔的方式对小鼠进行初免,再用全病毒灭活疫苗单独或者辅以MF59佐剂进行加强免疫,分别通过ELISA和ELISPOT方法检测到联合免疫策略在免疫组小鼠体内诱导了MC-MV特异性的抗体应答和CTL应答;免疫两周后用3＆#215;LD50致死剂量MCMV感染小鼠,疫苗对小鼠的免疫保护通过检测小鼠存活率、重要器官中的病毒滴度及体重丢失率来评价。结果显示,与单独免疫DNA疫苗或灭活疫苗相比,IE-1 DNA疫苗联合灭活疫苗组能同时在小鼠体内诱导体液免疫和细胞免疫应答,并提供小鼠完全保护;而且MF59辅以灭活疫苗免疫小鼠能增强疫苗的免疫效果。     

一次接种HA DNA保护小鼠抵抗B型流感病毒攻击

为详细探讨小鼠不同次数接种B型流感病毒HA DNA疫苗后免疫应答情况,以及CpG基序的免疫佐剂效果,采用不同剂量HA DNA,1次或2次(间隔3周)电击法免疫BALB/C小鼠。初免4周后(或二免加强免疫1周后)用致死量流感病毒(B/Ibaraki/2/85)攻击。研究发现:①100μg HA DNA一次接种的小鼠全部存活;②经含有CpG基序的DNA免疫的小鼠体内诱导产生的抗HAIgG抗体更高,小鼠体重丢失更少。这些结果说明,1次接种100μg HA DNA疫苗可以使小鼠抵抗致死量B型流感病毒攻击,CpG基序能够增强HA DNA疫苗的免疫保护作用。     

超抗原SEA增强小鼠对HBV DNA 疫苗的免疫反应

观察超抗原SEA(D227A)的真核表达载体（pmSEA）, 对HBV DNA 疫苗诱导Balb/c 小鼠(H2d）免疫应答的调节作用。 肌内注射空载体pcDNA3、HBV DNA 疫苗加pmSEA佐剂（pHBVS2S+pmSEA）或不加佐剂（pHBVS2S）; ELISA 法测定血清抗HBs; ELISPOT检测分泌IFN-γ的脾淋巴细胞;4 h51Cr 释放法检测小鼠脾细胞CTL 活性。HBV DNA佐剂组免疫小鼠抗HBsAg抗体滴度明显高于不加佐剂组,其IgG1/IgG2a的比例不同于多肽免疫组,二者分别为0.282与10。HBV DNA佐剂组均能增强IgG1和IgG2a的产生,是不加佐剂组的1.36、1.73倍。佐剂组小鼠脾淋巴细胞IFN-γ的分泌量是不加佐剂组2～3倍。CTL 细胞杀伤活性（E:T=100）佐剂组与不加佐剂组分别为：69.77%±7.5%、 42.81%±7.7%,差异显著(P<0.05)。HBV DNA 疫苗具有较强的免疫原性, 能够诱导机体产生特异性的抗体及CTL反应;pmSEA佐剂能够提高小鼠对DNA 疫苗的免疫应答,有望成为DNA 疫苗的免疫佐剂。     

嵌合NY-ESO-1 DNA疫苗诱导黑色素瘤小鼠模型抗肿瘤免疫的研究

NY-ESO-1作为一种肿瘤抗原,具有较强的免疫抗原性,并且已成为肿瘤候选疫苗之一。但由于目前大多应用NY-ESO-1多肽以及蛋白质疫苗,其临床试验效果欠佳,亟需更为有效的NY-ESO-1抗原设计的肿瘤免疫治疗出现。该研究的目的是探索将NY-ESO-1与具有增强免疫效应的五种因子分别重组成嵌合蛋白抗原,使其更有效地被加工、转运和呈递,以期找到最佳的基因佐剂,增强NY-ESO-1作为肿瘤治疗性DNA疫苗的免疫效果。采用电脉冲体内细胞高效转入的方法对C57BL/6小鼠进行DNA免疫,发现用编码NY-ESO-1或连接有HSP70的嵌合体质粒免疫可诱导强烈的NY-ESO-1特异性Ig G1反应。NY-ESO-1连接泛素的质粒免疫小鼠主要诱导NY-ESO-1特异性Ig G2a反应,表明此基因佐剂诱导强的Th1免疫反应。与其他嵌合NY-ESO-1质粒免疫相比,NYESO-1连接泛素的质粒免疫小鼠,有效地保护小鼠对有NY-ESO-1表达的B16F10黑色素瘤细胞系的挑战作用,证明强的Th1免疫反应对预防和治疗肿瘤具有重要作用。去除调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)可进一步增强泛素-NY-ESO-1嵌合DNA疫苗治疗黑色素瘤的作用。此外,Ub-NY-ESO-1质粒结合编码异源黑素瘤抗原GP100和TRP-2的质粒免疫可诱导对抗含有NY-ESO-1表达的B16F10黑色素瘤的协同抗肿瘤免疫疗效。该研究结果表明,编码泛素-NY-ESO-1嵌合抗原的质粒DNA疫苗或与编码其他相关黑色素瘤抗原的质粒的联合可能是有效的治疗黑色素瘤的疫苗。     

人乳头瘤病毒(HPV)58型DNA疫苗免疫原性的初步分析

为了检测HPV 58型不同L1基因的DNA疫苗的免疫原性,以pcDNA3.1为载体分别构建含HFV 58型不同L1基因的DNA疫苗,命名为L1h、L1h△c、L1S、L1SM和L1wt.用免疫印迹法检测各DNA疫苗的体外表达情况;各重组质粒与pcDNA3.1-h58L2和pcDNA3.1-GFP共转染293FT细胞,检测其形成假病毒的能力;并将各DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠,利用假病毒中和实验检测中和抗体水平,用ELISPOT检测细胞免疫情况.结果显示,本实验成功构建了五种DNA疫苗,L1h△c的体外表达量最高,L1S和L1SM的表达量次之,L1wt没有表达;重组质粒L1S能够形成假病毒,而其他四种重组质粒均不能形成假病毒.L1S和L1h均可在小鼠体内诱导中和抗体,但L1S诱导的中和抗体的平均滴度为1:6 400,明显高于L1h诱导的中和抗体水平(平均滴度为1:48),而其他疫苗在小鼠体内未产生中和抗体.对五种疫苗均未检测出特异性的细胞免疫反应.结果提示,体外能够组装成假病毒的DNA疫苗在免疫动物后可诱导高滴度的中和抗体,为今后DNA疫苗的筛选提供参考.     

融合表达小鼠IgG2b-Fc可增强人类免疫缺陷病毒1型Gag DNA疫苗的免疫原性

为阐明小鼠IgG2b-Fc对DNA疫苗免疫原性的增强作用,首先构建表达人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)CN54Gag基因的DNA疫苗及表达Gag与小鼠IgG2b-Fc融合基因的DNA疫苗,限制性酶切和DNA测序结果表明这两个疫苗均构建成功,蛋白免疫印迹结果也显示其正确表达。然后,利用上述DNA疫苗接种C57BL/6小鼠,比较两个DNA疫苗所诱导的特异性体液免疫反应和特异性细胞免疫反应。结果显示,融合表达小鼠IgG2b-Fc对特异性细胞免疫和体液免疫反应均有增强作用,但只有对特异性体液免疫反应的增强作用有统计学意义。     

乙肝DNA疫苗的研究进展

核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗,目前研究以DNA疫苗为主。乙肝DNA疫苗不仅能诱导机体细胞介导的体液免疫反应,而且还能诱导机体细胞介导的特异性细胞免疫反应,CTL活性增强,在乙型肝炎预防和治疗中具有广阔的应用前景。本文就近几年有关乙肝DNA疫苗的进展作了综述。     

乙型脑炎病毒DNA初免-蛋白加强策略在小鼠模型上的免疫效应评价

为了评价基因Ⅰ型乙型脑炎病毒prM-E DNA疫苗与prM和EⅢ融合抗原亚单位疫苗采用DNA初免-蛋白加强免疫策略对小鼠的免疫效果,本研究将prM-E融合基因插入到pVAX1真核表达载体中,构建重组表达载体prM-E-pVAX1作为DNA疫苗进行初免,利用原核表达系统获得的prM和EⅢ融合抗原作为亚单位疫苗进行加强免疫。将32只4−6周龄雌性BALB/c小鼠随机分成4组,设置prM-E-pVAX1 DNA疫苗组、DNA初免-蛋白加强免疫组、prM和EⅢ融合抗原亚单位疫苗组及pVAX1载体对照组,通过ELISA检测血清中特异性抗体水平;通过噬斑减少中和试验滴定中和抗体滴度;通过细胞因子表达丰度和淋巴细胞增殖试验分析不同疫苗免疫组诱导产生的细胞免疫反应。结果表明,用DNA初免-蛋白加强策略免疫的小鼠诱导产生的中和抗体滴度略高于prM和EⅢ融合抗原亚单位疫苗免疫组,显著高于prM-E-pVAX1 DNA疫苗免疫组。DNA初免-蛋白加强策略在小鼠模型中诱导产生了有效的Th1/Th2型免疫反应,特别是显著诱导了Th1型细胞免疫反应。本研究为预防流行性乙型脑炎提供了新的免疫策略和理论参考依据。